Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung der Radio(chemo)therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Sie führt zu einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes sowie der Lebensqualität der Patienten. Nicht selten muss die Strahlentherapie unterbrochen werden, wodurch sich die Tumorheilungschance deutlich reduziert. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze konnte bisher kein allgemein gültiges Konzept zur Prophylaxe und Therapie der radiogenen Mucositis enoralis in der Klinik etabliert werden. Die Pathogenese der oralen Mukositis ist komplex. Sie wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, darunter verschiedene Signalkaskaden, wie die Rho- und Ras-vermittelte Signaltransduktion. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit untersuchte deshalb den Ein-fluss des 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Hemmers Lovastatin, welcher unter anderem die genannten Signalkaskaden modifiziert, auf die Reaktion der Mundschleimhaut auf fraktionierte Bestrahlung. Ergänzende histologische Untersuchungen sollen weitere Anhaltspunkte auf den Wirkmechanismus von Lovastatin geben. Alle Untersuchungen erfolgten am etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunter-seite der Maus (Inzucht-Stamm C3H/Neu). Die Bestrahlung wurde als fraktionierte, perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) mit wöchentlich 5x3 Gy über eine (Tag 0-4) bzw. zwei Wochen (Tag 0-4 und 7-11) durchgeführt. Das Bestrahlungsfeld war dabei so definiert, dass die gesamte Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle, und damit die gesamte Zunge, eingeschlossen wurden. Daraus resultierte zunächst nur ein subklinischer Effekt an der Mundschleimhaut. Durch die lokale Testbestrahlung (25 kV Röntgen-strahlung) eines 3x3 mm² großen Feldes auf der Zungenunterseite wurde eine klinische Reaktion indiziert. Die lokale Bestrahlung erfolgte mit jeweils 5 gestaffelten Dosisgruppen (je-weils 10 Tiere zur Generierung vollständiger Dosis-Effekt-Kurven (Logit-Analyse). Als quantaler Endpunkt diente das Auftreten einer Ulzeration, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC-Klasifikation. Die Latenzzeit zwischen lokaler Bestrahlung und Diagnosestellung und die Dauer der Ulzeration bis zur Reepithelialisierung beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Der Beschreibung des Dosiseffektes dienten die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration innerhalb des Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %-Vertrauensbereiche. Für histologische Untersuchungen wurden an 16 aufeinander folgenden Tagen jeweils 3 Tiere einer Versuchsgruppe getötet. Als Kontrolle dienten 3 unbehandelte Tiere. Die Zungen wurden entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte angefertigt. Anschließend erfolgte die lichtmikroskopische Auswertung von mindestens 2 mm Epithellänge pro Präparat, wobei die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Funktions- und Germinativschicht sowie die Dicken der Germinativ-, Funktions- und Keratinschicht bestimmt wurden. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in einer Dosierung von 16 mg/kg, entsprechend der empfohlenen Dosis beim Menschen, appliziert. Die Gabe des in destillierten Wasser suspendierten Medikamentes, erfolgte täglich per os über eine Schlundsonde. Bei fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche erhielten die Versuchstiere Lovastatin von Tag -3 (bezogen auf den Tag der ersten Fraktion) bis Tag +7 oder bis zur Ausheilung der Ulzerationen. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen wurden 4 Behandlungszeiträume von Lovastatin getestet: Tag -3 bis +4, Tag +7 bis +14, Tag 0 bis +14 oder Tag 0 bis zur Heilung der Ulzeration. Für die histologischen Untersuchungen erfolgte eine fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen. An den Tagen 0-14 bzw. 7-14 wurde Lovastatin verabreicht. Als Kontrolle dienten die Versuchsgruppen, welche eine alleinige Bestrahlung bzw. Lovastatingabe erhielten. Zur Testung der Verträglichkeit des Medikamentes erhielten zunächst 5 Versuchstiere einmal täglich 16 mg/kg Lovastatin über einen Zeitraum von 25 Tagen. Dabei konnten keine wesentlichen unerwünschten Arzneimittelwirkungen beobachtet werden. Die alleinige Einzeitbestrahlung ergab einen ED50-Wert von 11,5±1,0 Gy mit einer signifikan-ten Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz (p=0,0007). Die Latenzzeit war 12,2±0,5 Tage, die Ulkusdauer 3,1±0,6 Tage. Der ED50-Wert für die alleinige fraktionierte Bestrahlung über 1 Woche war 8,6±1,4 Gy (p=0,0002). Es wurden für die Latenzzeit 9,7±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 5,4±1,1 Tage bestimmt. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung über eine Woche konnte eine signifikante Erhöhung der ED50-Werte gegenüber der alleinigen Fraktionierung festgestellt werden. Bei Medikamentengabe von Tag -3 bis +7 war die ED50 10,1±0,1 Gy, von Tag -3 bis zur Ausheilung 11,6±0,7 Gy. Die mittleren Latenzzeiten waren gegenüber der Kontrolle nicht signifikant verändert, es konnte jedoch in beiden Versuchsarmen eine Verkürzung der mittleren Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Für die Testbestrahlung nach alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ergab sich ein ED50-Wert von 7,9±1,3 Gy (p=0,0002). Für die Latenzzeit wurden 11,8±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 4,5±1,0 Tage ermittelt. Die Gabe von Lovastatin führte in allen Behandlungs-protokollen zu einer signifikanten Erhöhung der ED50-Werte: Tag -3 bis +4: 12,7±0,9 Gy; Tag +7 bis +14: 11,6±0,9 Gy; Tag 0 bis 14: 14,3±1,2 Gy, Tag 0 bis Ausheilung der Ulzeration: 12,9±1,3 Gy. Ebenso wie bei fraktionierter Bestrahlung über eine Woche, konnte eine Verkürzung der Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Außerdem wurde eine Verkürzung der mittleren Latenzzeit von 2,4 Tagen (Medikamentengabe von Tag -3 bis +4) bis 4,1 Tagen (Tag 0 bis zur Ausheilung) gefunden. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen konnte für den gesamten Behandlungszeitraum eine gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduzierte Gesamtzellzahl (Minimalwert Tag 4: 51%) festgestellt werden. Erst am Tag 16 wurde der Ausgangswert wieder erreicht. Demgegenüber ergab die alleinige Applikation von Lovastatin von Tag 0 bis 14 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant höhere Gesamtzellzahlen (Maximalwert Tag 9: 144% des Ausgangswertes). Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnten gegenüber der Kontrolle reduzierte, jedoch höhere Gesamtzellzahlen als bei alleiniger Fraktionierung festgestellt werden. Die Gesamtschichtdicken aller 4 Behandlungsprotokolle ergaben ähnliche Verläufe ohne signifikante Unterschiede. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Applikation von Lovastatin während fraktionierter Bestrahlung einen mukoprotektiven Effekt aufweist. In allen Behandlungsprotokollen war eine signifikante Erhöhung der isoeffektiven Dosen festgestellt werden. Dabei scheint der mukoprotektive Effekt umso größer zu sein, je länger die Behandlung mit Lovastatin andauerte. Lovastatin führte zu einer eindeutigen Akumulation der epithelialen Zellproliferation. Die exakten Wirkmechanismen der Mukoprotektion durch Statine sind jedoch bisher nicht geklärt und bedürfen weitergehender Untersuchungen. / The radiation response of oral mucosa is a frequent and dose-limiting side effect of radio(chemo)therapy of tumours in the head-and-neck region. Oral mucositis substantially im-pacts on the general condition and the quality of life of the patients. It necessitates treatment interruptions in a number of patients, with the consequence of a marked reduction of the tumour cure probability. Despite various experimental and clinical approaches, no general strategy for the prophylaxis or management of radiation-induced oral mucositis has so far been established in clinical routine. The pathogenesis of oral mucositis is complex and is influenced by a variety of factors, including miscellaneous signalling cascades, such as rho- and ras-dependent signal transduction. The present preclinical study in experimental animals was hence initiated to characterize the effect of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymeA-reductase inhibitor Lovastatin, which modulates the latter signalling chains, on the response of oral mucosa to fractionated irradiation. Accompanying histological studies were performed to illuminate the mechanism of action of Lovastatin. All investigations were performed in the mucosa of the lower surface of mouse tongue (C3H/Neu inbred strain) as an established animal model. Irradiation was administered as fractionated, percutaneous treatment of the entire snout of the animals (200 kV X-rays). The protocols comprised the application of 5x3 Gy/week over 1 week (days 0-4) or 2 weeks (days 0-4, 7-11). The treatment volume encompassed the snout of the animals to a plane from the eyes to the throat, thus including the entire tongue. With snout irradiation, only a subclinical mucosal effect was induced. Subsequent local test irradiation (25 kV X-rays) yielded a clinically manifest reaction within a 3x3 mm2 test area at the lower tongue surface. Local irradiation was performed in 5 graded dose groups with 10 animals each, in order to generate complete doseeffect curves (logit analyses). For this, mucosal ulceration, corresponding to confluent mucositis grade 3 according to the RTOG/EORTC classification, was analyzed as the quantal endpoint. The latent time between test irradiation and first ulcer diagnosis and the ulcer duration until reepithelialisation served as parameters of the time course of the radiation response. The dose effect was described by ED50 values (dose at which an ulceration within the test area is expected in 50 % of the animals) and their standard deviation  or their 95 % confidence intervals. For histological studies, 3 mice of each experimental group (see below) were sacrificed per day over a period of 16 days. Three untreated mice served as controls. The tongues were excised and the sections stained with haematoxylin and eosin. At least 2 mm epithelial length were examined by standard light microscopy, and the number of nucleated cells in the functional and germinal layers as well as the thickness of the individual epithelial layers was quantified. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching, Germany) was administered at a dose of 16 mg/kg, according to the recommended dose in patients. The drug was suspended in A. dest. and applied daily per os via gavage. With fractionated irradiation over 1 week, Lovastatin was administered from day -3 (before the first fraction) until day 7 or until clinical healing of all reactions. Fractionated irradiation over 2 weeks was combined with Lovastatin in 4 admini-stration intervals: day -3 to +4, day +7 to +11, day 0 to +14 or day 0 until clinical healing of all ulcerations. For the histological investigations, irradiation was applied with 10x3 Gy over 2 weeks. Lovastatin was administered on days 0-14 or 7-14, respectively. Groups that received either radiation alone or Lovastatin alone in similar protocols served as controls. To test for tolerability of the drug, 5 animals were treated daily with 16 mg/kg Lovastatin over 25 days. No adverse events were observed. Single dose irradiation alone resulted in an ED50 value of 11.5±1.0 Gy, with a significant dose dependence of ulcer frequency (p=0.0007). The latent time was 12.2±0.5 d, ulcer duration 3.1±0.6 d. The ED50 value for test irradiation after fractionated irradiation over 1 week was 8.6±1.4 Gy (p=0.0002). Latent time was 9.7±0.8 d, ulcer duration 5.4±1.1d. In both protocols with Lovas-tatin, a significant increase of the ED50 values was observed, with 10.1±0.1 Gy and 11.6±0.7 Gy for drug administration from day -3 to +7 and day -3 to ulcer healing, respectively. The mean latencies were not significantly different from the control. However, mean ulcer duration was shortened by ca. 2 d. For test irradiation after 2 weeks of fractionation alone, the ED50 was 7.9±1.3 Gy (p=0.0002). Mean latency was 11.8±0.8 d, mean ulcer duration 4.5±1.0 d. Lovastatin administration yielded a significant increase in ED50 values in all experimental protocols, with 12.7±0.9 Gy for day -3 to +4, 11.6±0.9 Gy for day +7 to +14, 14.3±1.2 Gy for day 0 to +14 and 12.9±1.3 Gy for day 0 until healing. Similar to one week of fractionation, a shortening of ulcer duration by ca. 2 d was found. Mean latencies were reduced by 2.4 days (drug administration day -3 to +4) to 4.1 days (day 0 to healing). Epithelial cell numbers were clearly reduced by fractionated irradiation (minimum day 4: 51 % of the control). Original values were not observed before day 16. In contrast, administration of Lovastatin alone significantly increased the total cell numbers in the epithelium (maximum day 9: 144 % of control). The combination of irradiation and Lovastatin resulted in total cell numbers that were reduced compared to the control, but markedly higher than with irradiation alone. No differences were found for epithelial thickness in comparison to irradiation alone. In conclusion, the administration of Lovastatin during fractionated irradiation showed a substantial mucoprotective effect. Isoeffective doses were significantly increased in all Lovastatin treatment arms. The longer the interval of drug administration was, the more pronounced was the effect. Lovastatin yielded a clear stimulation of epithelial cell proliferation. The detailed mechanisms of action of Lovastatin, however, remain unclear and require further investigation.

Bei der Strahlentherapie fortgeschrittener Tumoren im Kopf-Hals-Bereich gilt die radiogene Mucositis enoralis als schwerwiegende und dosislimitierende frühe Nebenwirkung. Sehr häufig führt sie zu einer Unterbrechung der Behandlung, mit der Folge einer Reduktion der Tumorheilungschancen. Während einer fraktionierten Strahlenexposition kommt es in der Mundschleimhaut zu einer erhöhten Expression des Epidermalen Wachstumsfaktors (Epidermal Growth Factor, EGF) und dessen Rezeptors (EGFR). Durch eine Blockade des EGFR, als anerkannte Strategie zur Verbesserung der Tumorheilung, besteht deshalb die Gefahr, dass es zu einer Verschlimmerung der Schleimhaut-Nebenwirkungen kommt. Der Einsatz von Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) zeigt positive Ergebnisse bezüglich einer Reduktion der Schleimhautveränderungen. In dieser Arbeit wird deshalb im Tiermodell einerseits die Auswirkung einer Blockade des EGFR auf die Schleimhautreaktion, und andererseits eine mögliche Interaktion der Blockade mit der schleimhautschützenden Wirkung von KGF untersucht. Insgesamt kann keine signifikante Veränderung der Schleimhauttoleranz durch die EGFR-Inhibition mittels BIBX1382BF innerhalb der ersten beiden Wochen einer fraktionierten Bestrahlung festgestellt werden; lediglich das Auftreten ulzerativer Läsionen nach der zweiten Woche ist vorverlagert

Bei der Strahlentherapie fortgeschrittener Tumoren im Kopf-Hals-Bereich gilt die radiogene Mucositis enoralis als schwerwiegende und dosislimitierende frühe Nebenwirkung. Sehr häufig führt sie zu einer Unterbrechung der Behandlung, mit der Folge einer Reduktion der Tumorheilungschancen. Während einer fraktionierten Strahlenexposition kommt es in der Mundschleimhaut zu einer erhöhten Expression des Epidermalen Wachstumsfaktors (Epidermal Growth Factor, EGF) und dessen Rezeptors (EGFR). Durch eine Blockade des EGFR, als anerkannte Strategie zur Verbesserung der Tumorheilung, besteht deshalb die Gefahr, dass es zu einer Verschlimmerung der Schleimhaut-Nebenwirkungen kommt. Der Einsatz von Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) zeigt positive Ergebnisse bezüglich einer Reduktion der Schleimhautveränderungen. In dieser Arbeit wird deshalb im Tiermodell einerseits die Auswirkung einer Blockade des EGFR auf die Schleimhautreaktion, und andererseits eine mögliche Interaktion der Blockade mit der schleimhautschützenden Wirkung von KGF untersucht. Insgesamt kann keine signifikante Veränderung der Schleimhauttoleranz durch die EGFR-Inhibition mittels BIBX1382BF innerhalb der ersten beiden Wochen einer fraktionierten Bestrahlung festgestellt werden; lediglich das Auftreten ulzerativer Läsionen nach der zweiten Woche ist vorverlagert

Einleitung: Die Mucositis enoralis stellt die bedeutendste und schwerwiegendste frühe Nebenwirkung bei der Strahlentherapie fortgeschrittener Kopf-Hals-Tumoren dar. Sie führt häufig zu einer Unterbrechung der Behandlung, mit der Folge einer reduzierten Tumorheilungschance. Des Weiteren wirkt sie sich nachteilig auf die Lebensqualität aus, erhöht das Risiko später Nebenwirkungen und Infektionen und stellt einen erheblichen Kostenfaktor dar. Trotz umfangreicher experimenteller und klinischer Untersuchungen wurde bisher keine allgemein anerkannte Strategie zur Prophylaxe oder Therapie der Mucositis enoralis klinisch etabliert. Die Blockade der Cyclooxygenase-2 (COX-2), welche in einer Reihe von Tumoren überexprimiert wird, wird in der Kombination mit einer Strahlentherapie diskutiert. Außerdem kommen COX-2-Inhibitoren als entzündungshemmende Medikamente therapiebegleitend zum Einsatz. C-Jun und NF-kB p50 sind Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise in der Pathogenese der radiogenen Mukositis eine wichtige Rolle spielen. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von Celecoxib, einem selektiven COX-2-Inhibitor, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa (Zellzahl, Epitheldicke) und die epitheliale Expression von c-Jun und NF-kB p50 im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. So soll festgestellt werden, ob eine Interaktion zwischen den begleitenden Entzündungsreaktionen und der eigentlichen epithelialen Strahlenreaktion besteht. Material und Methoden: In vorangegangenen Untersuchungen wurden die Schnauzen von Mäusen des Stammes C3H/Neu mit 5x3 Gy/Woche über 2 Wochen (Tag 0-4, 7-14) bestrahlt (200 kV Röntgenstrahlung). In einer weiteren Versuchsgruppe erhielten die Tiere täglich an den Tagen 0 bis 13 25 mg/kg/Tag Celecoxib oral per Schlundsonde. Im vierzehntägigen Untersuchungszeitraum wurden täglich jeweils 5 Mäuse je Versuchsgruppe getötet, deren Zungen entnommen und fixiert. In diesem Zustand wurde das Material von der Autorin dieser Arbeit übernommen. Mit Hilfe eines Zählrasters wurden in den vorliegenden Untersuchungen die Zellzahl, die Epitheldicke und die Expression von c-Jun und NF-kB p50 im Epithel der Zungenunterseite der unbehandelten Kontrolle (n = 5), während alleiniger Bestrahlung, sowie nach Bestrahlung und Gabe von Celecoxib manuell erfasst. Aufgrund der geringen Tierzahlen pro Untersuchungszeitpunkt (n = 5) und Versuchsgruppe wurde auf eingehende statistische Analysen verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschränkt sich auf eine beschreibende Darstellung des Verlaufs der Einzelparameter über den Gesamtzeitraum. Ergebnisse: Das unbehandelte Epithel besteht aus 402 ± 11 Zellen, wobei 281 ± 8 Zellen der Germinativ- und 121 ± 4 Zellen der funktionellen Schicht angehören. Die Dicke des Gesamtepithels beträgt 68 ± 3 μm. Davon nehmen Germinativ- und Keratinschicht je 15 ± 1 μm und die funktionelle Schicht 38 ± 4 μm ein. Im Kontrollepithel wird c-Jun von 81 % der Zellen der funktionellen und von 80 % der Zellen der Germinativschicht exprimiert, wobei die funktionelle Schicht scheinbar eine größere Färbeintensität aufweist. NF-kB p50 wird von 79 % der Epithelzellen exprimiert, wobei eine stärkere Expression in der Germinativschicht zu beobachten ist. Bei alleiniger fraktionierter Bestrahlung verringert sich die Zellzahl innerhalb der ersten Woche auf 68 % des Kontrollwertes und bleibt anschließend trotz weiterer Bestrahlung weitestgehend konstant. Der größere Anteil an Zellen geht dabei in der funktionellen Schicht verloren. Die Epitheldicke nimmt in der ersten Bestrahlungswoche bis auf 113 % zu und liegt in der folgenden Woche im normalen bis subnormalen Bereich. Die epitheliale c-Jun-Expression nimmt unmittelbar nach Bestrahlungsbeginn zu und liegt anschließend während des gesamten Beobachtungszeitraums über dem Kontrollbereich. Während der gesamten Bestrahlung liegt die Färbeintensität der funktionellen Schicht weiterhin über derer der Germinativschicht. Auch bei NF-kB p50 nimmt die Färbeintensität in der ersten Bestrahlungswoche zu und bleibt anschließend erhöht. Der Anteil NF-kB p50 exprimierender Zellen ist in der Germinativschicht scheinbar größer als in der funktionellen Schicht. Unter zusätzlicher Celecoxibgabe liegen die Zellzahlen vom 6.-12. Tag des Beobachtungszeitraums vermutlich unterhalb derjenigen bei alleiniger Bestrahlung. Dieser Effekt ist besonders innerhalb der Germinativschicht sichtbar. Der Anstieg der Epitheldicke in der ersten Bestrahlungswoche fällt bei zusätzlicher Celecoxibtherapie stärker aus. Im weiteren Verlauf sind kaum Differenzen zu verzeichnen. Die epitheliale Färbeintensität von c-Jun unterscheidet sich kaum von den alleinig bestrahlten Tieren. Bei NF-kB p50 ist dies mit Ausnahme einer scheinbar geringeren Expressionsintensität am 8. und 13. Beobachtungstag ebenso. Schlussfolgerungen: Bei der frühen Strahlenreaktion der Mundschleimhaut werden c-Jun und NF-kB p50 verändert exprimiert. Celecoxib reduziert im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung die Zellzahl und verstärkt die Zunahme der Epitheldicke. Es hat keinen Einfluss auf die Expression von c-Jun und NF-kB p50. Somit ist die Regulation der Aktivität von c-Jun und NF-kB p50 unabhängig von der Aktivität von COX-2 erfolgt.

Die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut ist die häufigste und Dosis limitierende frühe Nebenwirkung der Radio(chemo)therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Sie führt zu einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes sowie der Lebensqualität der Patienten. Nicht selten muss die Strahlentherapie unterbrochen werden, wodurch sich die Tumorheilungschance deutlich reduziert. Trotz zahlreicher experimenteller und klinischer Ansätze konnte bisher kein allgemein gültiges Konzept zur Prophylaxe und Therapie der radiogenen Mucositis enoralis in der Klinik etabliert werden. Die Pathogenese der oralen Mukositis ist komplex. Sie wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, darunter verschiedene Signalkaskaden, wie die Rho- und Ras-vermittelte Signaltransduktion. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit untersuchte deshalb den Ein-fluss des 3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymA-Reduktase-Hemmers Lovastatin, welcher unter anderem die genannten Signalkaskaden modifiziert, auf die Reaktion der Mundschleimhaut auf fraktionierte Bestrahlung. Ergänzende histologische Untersuchungen sollen weitere Anhaltspunkte auf den Wirkmechanismus von Lovastatin geben. Alle Untersuchungen erfolgten am etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunter-seite der Maus (Inzucht-Stamm C3H/Neu). Die Bestrahlung wurde als fraktionierte, perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) mit wöchentlich 5x3 Gy über eine (Tag 0-4) bzw. zwei Wochen (Tag 0-4 und 7-11) durchgeführt. Das Bestrahlungsfeld war dabei so definiert, dass die gesamte Schnauze bis zu einer Ebene von den Augen bis zur Kehle, und damit die gesamte Zunge, eingeschlossen wurden. Daraus resultierte zunächst nur ein subklinischer Effekt an der Mundschleimhaut. Durch die lokale Testbestrahlung (25 kV Röntgen-strahlung) eines 3x3 mm² großen Feldes auf der Zungenunterseite wurde eine klinische Reaktion indiziert. Die lokale Bestrahlung erfolgte mit jeweils 5 gestaffelten Dosisgruppen (je-weils 10 Tiere zur Generierung vollständiger Dosis-Effekt-Kurven (Logit-Analyse). Als quantaler Endpunkt diente das Auftreten einer Ulzeration, entsprechend einer konfluenten Mukositis Grad 3 nach RTOG/EORTC-Klasifikation. Die Latenzzeit zwischen lokaler Bestrahlung und Diagnosestellung und die Dauer der Ulzeration bis zur Reepithelialisierung beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Der Beschreibung des Dosiseffektes dienten die ED50-Werte (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine Ulzeration innerhalb des Testfeldes zu erwarten ist) und deren Standardabweichung σ bzw. deren 95 %-Vertrauensbereiche. Für histologische Untersuchungen wurden an 16 aufeinander folgenden Tagen jeweils 3 Tiere einer Versuchsgruppe getötet. Als Kontrolle dienten 3 unbehandelte Tiere. Die Zungen wurden entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte angefertigt. Anschließend erfolgte die lichtmikroskopische Auswertung von mindestens 2 mm Epithellänge pro Präparat, wobei die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Funktions- und Germinativschicht sowie die Dicken der Germinativ-, Funktions- und Keratinschicht bestimmt wurden. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching) wurde in einer Dosierung von 16 mg/kg, entsprechend der empfohlenen Dosis beim Menschen, appliziert. Die Gabe des in destillierten Wasser suspendierten Medikamentes, erfolgte täglich per os über eine Schlundsonde. Bei fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche erhielten die Versuchstiere Lovastatin von Tag -3 (bezogen auf den Tag der ersten Fraktion) bis Tag +7 oder bis zur Ausheilung der Ulzerationen. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen wurden 4 Behandlungszeiträume von Lovastatin getestet: Tag -3 bis +4, Tag +7 bis +14, Tag 0 bis +14 oder Tag 0 bis zur Heilung der Ulzeration. Für die histologischen Untersuchungen erfolgte eine fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy über 2 Wochen. An den Tagen 0-14 bzw. 7-14 wurde Lovastatin verabreicht. Als Kontrolle dienten die Versuchsgruppen, welche eine alleinige Bestrahlung bzw. Lovastatingabe erhielten. Zur Testung der Verträglichkeit des Medikamentes erhielten zunächst 5 Versuchstiere einmal täglich 16 mg/kg Lovastatin über einen Zeitraum von 25 Tagen. Dabei konnten keine wesentlichen unerwünschten Arzneimittelwirkungen beobachtet werden. Die alleinige Einzeitbestrahlung ergab einen ED50-Wert von 11,5±1,0 Gy mit einer signifikan-ten Dosisabhängigkeit der Ulkusfrequenz (p=0,0007). Die Latenzzeit war 12,2±0,5 Tage, die Ulkusdauer 3,1±0,6 Tage. Der ED50-Wert für die alleinige fraktionierte Bestrahlung über 1 Woche war 8,6±1,4 Gy (p=0,0002). Es wurden für die Latenzzeit 9,7±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 5,4±1,1 Tage bestimmt. In beiden Versuchsprotokollen mit Lovastatingabe und fraktionierter Bestrahlung über eine Woche konnte eine signifikante Erhöhung der ED50-Werte gegenüber der alleinigen Fraktionierung festgestellt werden. Bei Medikamentengabe von Tag -3 bis +7 war die ED50 10,1±0,1 Gy, von Tag -3 bis zur Ausheilung 11,6±0,7 Gy. Die mittleren Latenzzeiten waren gegenüber der Kontrolle nicht signifikant verändert, es konnte jedoch in beiden Versuchsarmen eine Verkürzung der mittleren Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Für die Testbestrahlung nach alleiniger fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen ergab sich ein ED50-Wert von 7,9±1,3 Gy (p=0,0002). Für die Latenzzeit wurden 11,8±0,8 Tage und für die Ulkusdauer 4,5±1,0 Tage ermittelt. Die Gabe von Lovastatin führte in allen Behandlungs-protokollen zu einer signifikanten Erhöhung der ED50-Werte: Tag -3 bis +4: 12,7±0,9 Gy; Tag +7 bis +14: 11,6±0,9 Gy; Tag 0 bis 14: 14,3±1,2 Gy, Tag 0 bis Ausheilung der Ulzeration: 12,9±1,3 Gy. Ebenso wie bei fraktionierter Bestrahlung über eine Woche, konnte eine Verkürzung der Ulkusdauer um ca. 2 Tage festgestellt werden. Außerdem wurde eine Verkürzung der mittleren Latenzzeit von 2,4 Tagen (Medikamentengabe von Tag -3 bis +4) bis 4,1 Tagen (Tag 0 bis zur Ausheilung) gefunden. Bei fraktionierter Bestrahlung über 2 Wochen konnte für den gesamten Behandlungszeitraum eine gegenüber der unbehandelten Kontrolle reduzierte Gesamtzellzahl (Minimalwert Tag 4: 51%) festgestellt werden. Erst am Tag 16 wurde der Ausgangswert wieder erreicht. Demgegenüber ergab die alleinige Applikation von Lovastatin von Tag 0 bis 14 im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant höhere Gesamtzellzahlen (Maximalwert Tag 9: 144% des Ausgangswertes). Bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe konnten gegenüber der Kontrolle reduzierte, jedoch höhere Gesamtzellzahlen als bei alleiniger Fraktionierung festgestellt werden. Die Gesamtschichtdicken aller 4 Behandlungsprotokolle ergaben ähnliche Verläufe ohne signifikante Unterschiede. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Applikation von Lovastatin während fraktionierter Bestrahlung einen mukoprotektiven Effekt aufweist. In allen Behandlungsprotokollen war eine signifikante Erhöhung der isoeffektiven Dosen festgestellt werden. Dabei scheint der mukoprotektive Effekt umso größer zu sein, je länger die Behandlung mit Lovastatin andauerte. Lovastatin führte zu einer eindeutigen Akumulation der epithelialen Zellproliferation. Die exakten Wirkmechanismen der Mukoprotektion durch Statine sind jedoch bisher nicht geklärt und bedürfen weitergehender Untersuchungen.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133 / The radiation response of oral mucosa is a frequent and dose-limiting side effect of radio(chemo)therapy of tumours in the head-and-neck region. Oral mucositis substantially im-pacts on the general condition and the quality of life of the patients. It necessitates treatment interruptions in a number of patients, with the consequence of a marked reduction of the tumour cure probability. Despite various experimental and clinical approaches, no general strategy for the prophylaxis or management of radiation-induced oral mucositis has so far been established in clinical routine. The pathogenesis of oral mucositis is complex and is influenced by a variety of factors, including miscellaneous signalling cascades, such as rho- and ras-dependent signal transduction. The present preclinical study in experimental animals was hence initiated to characterize the effect of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoenzymeA-reductase inhibitor Lovastatin, which modulates the latter signalling chains, on the response of oral mucosa to fractionated irradiation. Accompanying histological studies were performed to illuminate the mechanism of action of Lovastatin. All investigations were performed in the mucosa of the lower surface of mouse tongue (C3H/Neu inbred strain) as an established animal model. Irradiation was administered as fractionated, percutaneous treatment of the entire snout of the animals (200 kV X-rays). The protocols comprised the application of 5x3 Gy/week over 1 week (days 0-4) or 2 weeks (days 0-4, 7-11). The treatment volume encompassed the snout of the animals to a plane from the eyes to the throat, thus including the entire tongue. With snout irradiation, only a subclinical mucosal effect was induced. Subsequent local test irradiation (25 kV X-rays) yielded a clinically manifest reaction within a 3x3 mm2 test area at the lower tongue surface. Local irradiation was performed in 5 graded dose groups with 10 animals each, in order to generate complete doseeffect curves (logit analyses). For this, mucosal ulceration, corresponding to confluent mucositis grade 3 according to the RTOG/EORTC classification, was analyzed as the quantal endpoint. The latent time between test irradiation and first ulcer diagnosis and the ulcer duration until reepithelialisation served as parameters of the time course of the radiation response. The dose effect was described by ED50 values (dose at which an ulceration within the test area is expected in 50 % of the animals) and their standard deviation  or their 95 % confidence intervals. For histological studies, 3 mice of each experimental group (see below) were sacrificed per day over a period of 16 days. Three untreated mice served as controls. The tongues were excised and the sections stained with haematoxylin and eosin. At least 2 mm epithelial length were examined by standard light microscopy, and the number of nucleated cells in the functional and germinal layers as well as the thickness of the individual epithelial layers was quantified. Lovastatin (1A Pharma, Oberhaching, Germany) was administered at a dose of 16 mg/kg, according to the recommended dose in patients. The drug was suspended in A. dest. and applied daily per os via gavage. With fractionated irradiation over 1 week, Lovastatin was administered from day -3 (before the first fraction) until day 7 or until clinical healing of all reactions. Fractionated irradiation over 2 weeks was combined with Lovastatin in 4 admini-stration intervals: day -3 to +4, day +7 to +11, day 0 to +14 or day 0 until clinical healing of all ulcerations. For the histological investigations, irradiation was applied with 10x3 Gy over 2 weeks. Lovastatin was administered on days 0-14 or 7-14, respectively. Groups that received either radiation alone or Lovastatin alone in similar protocols served as controls. To test for tolerability of the drug, 5 animals were treated daily with 16 mg/kg Lovastatin over 25 days. No adverse events were observed. Single dose irradiation alone resulted in an ED50 value of 11.5±1.0 Gy, with a significant dose dependence of ulcer frequency (p=0.0007). The latent time was 12.2±0.5 d, ulcer duration 3.1±0.6 d. The ED50 value for test irradiation after fractionated irradiation over 1 week was 8.6±1.4 Gy (p=0.0002). Latent time was 9.7±0.8 d, ulcer duration 5.4±1.1d. In both protocols with Lovas-tatin, a significant increase of the ED50 values was observed, with 10.1±0.1 Gy and 11.6±0.7 Gy for drug administration from day -3 to +7 and day -3 to ulcer healing, respectively. The mean latencies were not significantly different from the control. However, mean ulcer duration was shortened by ca. 2 d. For test irradiation after 2 weeks of fractionation alone, the ED50 was 7.9±1.3 Gy (p=0.0002). Mean latency was 11.8±0.8 d, mean ulcer duration 4.5±1.0 d. Lovastatin administration yielded a significant increase in ED50 values in all experimental protocols, with 12.7±0.9 Gy for day -3 to +4, 11.6±0.9 Gy for day +7 to +14, 14.3±1.2 Gy for day 0 to +14 and 12.9±1.3 Gy for day 0 until healing. Similar to one week of fractionation, a shortening of ulcer duration by ca. 2 d was found. Mean latencies were reduced by 2.4 days (drug administration day -3 to +4) to 4.1 days (day 0 to healing). Epithelial cell numbers were clearly reduced by fractionated irradiation (minimum day 4: 51 % of the control). Original values were not observed before day 16. In contrast, administration of Lovastatin alone significantly increased the total cell numbers in the epithelium (maximum day 9: 144 % of control). The combination of irradiation and Lovastatin resulted in total cell numbers that were reduced compared to the control, but markedly higher than with irradiation alone. No differences were found for epithelial thickness in comparison to irradiation alone. In conclusion, the administration of Lovastatin during fractionated irradiation showed a substantial mucoprotective effect. Isoeffective doses were significantly increased in all Lovastatin treatment arms. The longer the interval of drug administration was, the more pronounced was the effect. Lovastatin yielded a clear stimulation of epithelial cell proliferation. The detailed mechanisms of action of Lovastatin, however, remain unclear and require further investigation.:ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG 6 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 Tumorerkrankungen im Kopf-Hals-Breich 9 2.2 Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren 11 2.2.1 Chirurgische Therapie 11 2.2.2 Strahlentherapie 11 2.2.3 Zytostatische Therapie 14 2.2.4 Kombinierte Radiochemotherapie 14 2.3 Nebenwirkungen der Strahlentherapie 14 2.3.1 Frühe Strahlenfolgen 15 2.3.2 Späte (chronische) Strahlenfolgen 16 2.3.3 Konsekutive Späteffekte 17 2.4 Radiogene Nebenwirkungen im Kopf-Hals-Bereich 17 2.4.1 Frühreaktionen 17 2.4.2 Spätfolgen 19 2.5 Radiogene Mucositis enoralis 20 2.5.1 Pathogenese und zeitlicher Verlauf 20 2.5.2 Klassifizierungssysteme 22 2.5.3 Inzidenz und klinische Bedeutung 25 2.5.4 Prophylaxe und Therapie 26 2.6 Aufbau und Proliferationskinetik der Mundschleimhaut 30 2.6.1 Humane Mundschleimhaut 30 2.6.1.1 Aufbau der Mundschleimhaut des Menschen 30 2.6.1.2 Proliferationskinetik 31 2.6.2 Murine Mundschleimhaut 31 2.6.2.1 Besonderheiten im Aufbau der Zungenschleimhaut der Maus 31 2.6.2.2 Proliferationskinetik 32 2.7 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen Mucositis enoralis 33 2.7.1 Maus 33 2.7.2 Hamster 34 2.7.3 Ratte 34 2.8 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 35 2.8.1 Intrinsische Strahlenempfindlichkeit und Stammzellkonzept 35 2.8.2 Recovery (Erholung) 36 2.8.3 Repopulierung 37 2.8.4 Redistribution 38 2.8.5 Reoxygenierung 39 2.8.6 Volumeneffekt 39 2.9 Lovastatin 40 2.9.1 Lipidsenkende Wirkung von Lovastatin 41 2.9.2 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik 42 2.9.3 Nebenwirkungen 42 2.9.4 Weitere Wirkungen von Lovastatin (pleiotrope Effekte) 44 2.10 Zielstellung der vorliegenden Arbeit 45 3 MATERIAL UND METHODEN 46 3.1 Versuchstiere 46 3.2 Bestrahlung 47 3.2.1 Bestrahlungsanlagen 47 3.2.1.1 Perkutane Bestrahlung 47 3.2.1.2 Lokale Zungenbestrahlung 48 3.2.2 Dosimetrie 48 3.2.2.1 Perkutane Bestrahlung 48 3.2.2.2 Lokale Zungenbestrahlung 49 3.3 Durchführung der Bestrahlung 49 3.3.1 Perkutane Schnauzenbestrahlung 49 3.3.2 Lokale Zungenbestrahlung 50 3.4 Beurteilung der Strahlenreaktion 51 3.5 Beschreibung der durchgeführten Experimente 52 3.5.1 Alleinige Lovastatingabe (Versuch L) 53 3.5.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 53 3.5.3 Versuche mit fraktionierter Bestrahlung (Versuch F) 54 3.6 Statistische Auswertung 54 3.6.1 Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen 54 3.6.2 Analyse des zeitlichen Verlaufs der oralen Mukositis 55 3.6.3 Analyse der histologischen Parameter 55 3.7 Histologische Untersuchungen 55 4 ERGEBNISSE 57 4.1 Verträglichkeit von Lovastatin (Versuch L) 57 4.2 Lokale Einzeitbestrahlung (Versuch E) 58 4.2.1 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion (Ulkus) 58 4.2.2 Klinisches Erscheinungsbild und Verlauf der Strahlenreaktion 58 4.3 Strahlenreaktion nach einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/0) 60 4.3.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 60 4.3.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 61 4.4 Strahlenreaktion nach zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/0) 62 4.4.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 62 4.4.2 Zeitlicher Verlauf der Schleimhautreaktion 62 4.5 Lovastatingabe bei einwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F1/X) 63 4.5.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 64 4.5.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 65 4.6 Lovastatingabe bei zweiwöchiger fraktionierter Bestrahlung (F2/X) 66 4.6.1 Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz 66 4.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 67 4.7 Histologische Untersuchungen 68 4.7.1 Unbehandeltes beziehungsweise ausschließlich bestrahltes Epithel der Zungenunterseite (H0 und H1) 69 4.7.1.1 Zellzahlen 69 4.7.1.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.2 Alleinige Lovastatingabe über 14 Tage (H2) 71 4.7.2.1 Zellzahlen 71 4.7.2.2 Schicht- und Epitheldicke 71 4.7.3 Fraktionierte Bestrahlung mit 10x3 Gy und Lovastatingabe 75 4.7.3.1 Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 (Versuch H3) 75 4.7.3.2 Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 (Versuch H4) 76 5 DISKUSSION 79 5.1 Klinischer Hintergrund der radiogenen Mucositis enoralis 79 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 80 5.2.1 Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen 80 5.2.2 Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 81 5.2.3 Strahlenreaktion der Mundschleimhaut nach fraktionierter Bestrahlung 82 5.3 Applikation von Lovastatin 82 5.3.1 Dosierung 82 5.3.2 Verträglichkeit 83 5.4 Beeinflussung der Ausprägung der radiogenen Mucositis enoralis durch Lovastatin 83 5.4.1 Lovastatinwirkung bei Einzeitbestrahlung 83 5.4.2 Lovastatinwirkung bei fraktionierter Bestrahlung 84 5.5 Histologische Untersuchungen 85 5.5.1 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Bestrahlung 86 5.5.2 Veränderungen im Epithel bei alleiniger Lovastatingabe 87 5.5.3 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung und Lovastatingabe 88 5.6 Weitere Untersuchungen zur Modifikation der Strahlenreaktion von Normalgeweben durch Statine 88 5.7 Mögliche Wirkmechanismen von Statinen 90 5.7.1 Hemmung der Rho- und Ras-vermittelten Signaltransduktion 90 5.7.2 Beeinflussung der Entzündungsreaktion 92 5.7.3 Beeinflussung der Gefäßreaktion 93 5.8 Mögliche Wirkung von Lovastatin auf Tumorgewebe 94 6 AUSBLICK 95 7 ZUSAMMENFASSUNG 96 8 SUMMARY 99 9 THESEN 102 10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 104 11 TABELLENVERZEICHNIS 106 12 LITERATURVERZEICHNIS 107 13 ANHANG 127 DANKSAGUNG 131 ERKLÄRUNG ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 132 ERKLÄRUNG ZUR EINHALTUNG RECHTLICHER VORSCHRIFTEN 133

Modification of the radiation response of oral mucosa (mouse) by inhibition of nitric oxide synthase via nitro-L-arginin-methyl-ester (L-NAME)

Die Mucositis enoralis ist eine häufige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind komplex und beinhalten die Reaktionen und Interaktionen von Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Gef¨aßendothelzellen. Dies schließt die vermehrte Bildung von Stickstoff-Monoxid (NO) in Folge einer Stimulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ein. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von L-NAME (nitro-L-Arginin-Methyl-Ester), einem unselektiven Inhibitor der NOS, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. Materialien und Methoden: Die Untersuchungen erfolgen mit Mäusen des InzuchtWildtypstammes C3H/Neu. Als Bestrahlungstechniken kommen die perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) und/oder die lokale Bestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3·3 mm2 großen Testfeldes der Zungenunterseite der Maus zum Einsatz. In Fraktionierungsprotokollen werden 5x3 Gy/Woche über 1 (Tage 04) sowie 2 Wochen (Tage 0-4, 7-11) auf die gesamte Schnauze der Tiere appliziert. Anschließend erfolgt eine lokale Aufsättigungsbestrahlung mit gestaffelten Dosen (5 Dosisgruppen, je 10 Tiere) zur Generierung kompletter Dosis-Effekt-Kurven (Tag 7 bzw. 14). Einzeitbestrahlungen des lokalen Testfeldes finden ebenfalls mit gestaffelten Dosen statt. L-NAME (täglich 0,2 mg/kg i.p.) wird an den Bestrahlungstagen 30 Minuten vor der Bestrahlung appliziert. Bei Einzeitbestrahlung werden 2 verschiedene Behandlungszeiträume getestet: 3 Tage vor der Bestrahlung bis zur Erstdiagnose (-3/D) oder Ausheilung der Ulzerationen (-3/H). In Kombination mit fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche werden 3 Zeiträume untersucht (-3/7, -3/D oder -3/H). Bei 2 Wochen fraktionierter Bestrahlung erfolgt die L-NAME-Gabe in folgenden Intervallen: -3/7, -3/D, -3/H, -3/14 oder 7/14. Als quantaler Endpunkt für Dosis-EffektAnalysen dient die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld. Mittels Logit-Analyse werden Dosis-Effekt-Beziehungen ermittelt. Der ED50-Wert und dessen Standardabweichung σ dienen der Charakterisierung der Dosis-Effekt-Kurven. In histologischen Untersuchungen werden maximal 10 Fraktionen zu 3 Gy über 2 Wochen appliziert, mit/ohne Gabe von L-NAME von Tag -3 bis zur Tötung. Die Zungenentnahme erfolgt bei je 5 Tieren in zweitägigen Abständen (Tag 1 bis 25). Ergebnisse: Für die alleinige Einzeitbestrahlung ergibt sich eine signifikante Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz mit einer ED50 von 13,6±1,0 Gy. Die mittlere Latenzzeit beträgt 10,6±1,1 Tage, die durchschnittliche Ulkusdauer 3,5±1,0 Tage. Nach alleiniger einwöchig fraktionierter Bestrahlung beträgt die ED50 der Testbestrahlung 12,3±0,8 Gy. L-NAME von Tag -3 bis Tag 6 bzw. -3/D hat keinen signifikanten Einfluss (ED50 13,3±1,2 Gy bzw. 12,8±1,0 Gy). Lediglich für den Applikationszeitraum Tag -3/H kann eine signifikante Erhöhung der ED50 auf 14,7±1,7 Gy (p=0,0298) nachgewiesen werden. Die Testbestrahlung nach 2-wöchiger Fraktionierung ohne L-NAME ergibt eine ED50 von 13,0±0,1 Gy. L-NAME hat wiederum keinen signifikanten Einfluss auf die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut (ED50-Werte: -3/6 - 12,9±0,1 Gy, -3/14 - 13,0±0,1 Gy, -3/H - 13,8±1,4 Gy und 7/14 - 13,1±0,8 Gy). Während alleiniger fraktionierter Bestrahlung nimmt die Zellzahl zunächst ab (Tag 11: 70 %). Im Anschluss steigt sie über das Ausgangsniveau (Tag 19: 126 %). F¨ur die L-NAME-behandelte Schleimhaut findet sich ein qualitativ vergleichbarer Verlauf; es zeigt sich lediglich eine geringfügige Erhöhung der Zellzahl in der funktionellen Schicht (150 % statt 140 %). Die Epitheldicke nimmt unter L-NAME-Behandlung in den ersten Tagen der Nachbeobachtungszeit deutlich zu. Schlußfolgerungen: Zusammenfassend erweist sich in der vorliegenden Arbeit nur die L-NAME-Applikation -3/H bei einwöchig fraktionierter Bestrahlung als wirksam, wobei der Grund f¨ur diese selektive Wirkung unklar bleibt. Offensichtlich sind NOvermittelte Prozesse ohne substanzielle Relevanz f¨ur die epitheliale Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist die Hemmung von iNOS durch L-NAME keine aussichtsreiche Strategie zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis, und sollte deshalb auch nicht in klinischen Studien verfolgt werden. Die Frage, ob andere (i)NOS-Hemmstoffe ein mukoprotektives Potential besitzen, sollte in weiteren, translationalen strahlenbiologischen Studien geklärt werden.

Betriebe in Mittelgebirgslagen mit einem hohen Anteil Grassilagefütterung, der damit verbundenen größeren K-Aufnahme sowie höheren DCAD (Dietary-Cation-Anion-Difference) sollten für Gebärparese stärker prädisponiert sein. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Ursachen des Festliegens im Erzgebirge unter Berücksichtigung der DCAD zu ermitteln. Dazu wurden sowohl Fütterungsparameter und die Körperkondition analysiert, als auch Blut- und Harnuntersuchungen ante (a.p.) und post partum (p.p.) durchgeführt. In 21 Betrieben wurden insgesamt 249 Kühe im Zeitraum von 2 Wochen ante partum (a.p.) bis eine Woche p.p. untersucht. Bei 206 gesunden Kühen erfolgte 2 Wochen a.p. eine jeweils einmalige Harn- und Blutentnahmen. Ferner wurden bei 43 peripartal festliegenden Kühen nur Blut- und Harnproben direkt vor der Behandlung analysiert. Die sonographische Ermittlung der Rückenfettdicke (RFD) erfolgte bei je zehn klinisch gesunden Kühen pro Betrieb je 2 Wochen a.p. Die Silageproben (Grundfutteranalyse) wurden hinsichtlich ihrer Inhaltsstoffe untersucht und die DCAD berechnet. Laktationsnummern, Milchleistungen und Krankheitsinzidenzen der Kühe wurden ermittelt. Im Blutserum wurden ß-Hydroxy-Butyrat (BHB), Cholesterol, Bilirubin, Aspartat-Aminotransferase (ASATS), Creatinkinase (CK), Alkalische Phosphatase (AP), Protein (TP), Albumin, Harnstoff, Creatinin, Calcium (Ca), anorganisches Phosphat (Pi), Magnesium (Mg), Natrium (Na), Kalium (K) und im Vollblut die Leukozytenanzahl bestimmt. Im Harn erfolgte die Analyse derselben Mineralstoffe wie im Serum sowie weiterhin des pH-Wertes, der NSBA (Netto-Säure-Basen-Ausscheidung) und des Creatinins. Errechnet wurden die fraktionierten Eliminationen der einzelnen Mineralstoffe, der BSQ (Basen-Säure-QuotienTS) aus den Mengen der Basen, Säuren und Ammoniumionen im Harn sowie der Creatininquotient aus Harn- und Serumcreatinin. Befunde der Klinisch gesunden Kühe zwei Wochen a.p.: Die durchschnittliche RFD der Kühe lag in den Betrieben im Mittel zwischen 19 bis 26 mm. Muskel- und Knochenstoffwechsel charakterisierende Parameter waren physiologisch. Die Mediane der AP-Aktivität im Serum lagen in 15 der 21 Betriebe unter 100 U/l. Energie- und Eiweißstoffwechsel, Leukozytenanzahlen sowie Mineralstoffe in Serum und Harn ergaben keine Hinweise für präpartale Stoffwechselstörungen. Die Mediane von pH-Wert, NSBA sowie K- und Creatininkonzentrationen im Harn überschritten in mindestens fünf Betrieben die Grenzwerte, da die K-Konzentrationen in den Silagen bis fünffach über dem empfohlenen Bereich lagen. Die DCAD lag im Mittel aller Betriebe mit 458 meq/kg T weit über –100 bis +150 meq/kg T. Eine gesicherte Korrelation zur Anzahl der Festlieger bestand nicht. Befunde der Festlieger p.p.: Die Festlieger hatten zu je 60% reduzierte Ca- sowie Pi- und zu 16% verminderte Mg-Konzentrationen. Die Verteilung auf die Gebärparesetypen war wie folgt: Typ I = 42% Typ II= 19%, Typ III = 5%, Typ IV = 12% und Typ V = 21%. Dies entspricht mehrheitlich den Literaturangaben. Die Ca-, Pi- und Mg-Konzentrationen im Harn lagen bei den Festliegern in den physiologischen Bereichen. Die Mehrzahl der Festlieger hatte gleichzeitig erhöhte CK- (74%) und AST-Aktivitäten (53%). In 38% der Fälle war die AP-Aktivität vermindert. Die K- und NSBA-Konzentrationen im Harn der Festlieger zeigten als Folge der reduzierten Futteraufnahme gegenüber den Befunden a.p. eine Abnahme bis in den unteren physiologischen Bereich und z.T. darunter. Störungen des Energiestoffwechsels in Form erhöhter Ketonkörper- (58%) und Bilirubin- (40%) sowie reduzierter Cholesterol- (58%) Konzentrationen hatte die Mehrheit der festliegenden Kühe. Dabei war die kombinierte Ca-Pi-BHB-Stoffwechselstörung die Regel, traf aber nicht in jedem Fall zu. Die moderat veränderten Parameter des Energiestoffwechsels sind offensichtlich Folge der reduzierten Futteraufnahme. Eine Steigerung der Leukozytenzahl als Hinweis auf eine akut-entzündliche Reaktion bestand bei 44% der Festlieger, - die Leukopenie war die Ausnahme. Mit der Leukozytose waren in 36,8% respektive 42,1% der Fälle eine Hypokalz- resp. Hypophosphatämie gekoppelt. Bei dem größeren Teil (47,4%) der Leukozytosen waren die Ca- und Pi-Konzentrationen jedoch physiologisch. Das zeigt in Übereinstimmung mit den klinischen Befunden, dass entzündliche Prozesse und Verletzungen als weitere Ursache des Festliegens angesehen werden mussten. Fazit: Die erhöhte DCAD war in den untersuchten Mittelgebirgsbetrieben kein prädisponierender Faktor für die Gebärparese. Neben den bekannten Ca-Pi-Störungen spielten entzündliche Prozesse dafür eine wichtige Rolle.

Modification of the radiation response of oral mucosa (mouse) by inhibition of nitric oxide synthase via nitro-L-arginin-methyl-ester (L-NAME)

Die Mucositis enoralis ist eine häufige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind komplex und beinhalten die Reaktionen und Interaktionen von Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Gef¨aßendothelzellen. Dies schließt die vermehrte Bildung von Stickstoff-Monoxid (NO) in Folge einer Stimulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ein. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von L-NAME (nitro-L-Arginin-Methyl-Ester), einem unselektiven Inhibitor der NOS, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. Materialien und Methoden: Die Untersuchungen erfolgen mit Mäusen des InzuchtWildtypstammes C3H/Neu. Als Bestrahlungstechniken kommen die perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) und/oder die lokale Bestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3·3 mm2 großen Testfeldes der Zungenunterseite der Maus zum Einsatz. In Fraktionierungsprotokollen werden 5x3 Gy/Woche über 1 (Tage 04) sowie 2 Wochen (Tage 0-4, 7-11) auf die gesamte Schnauze der Tiere appliziert. Anschließend erfolgt eine lokale Aufsättigungsbestrahlung mit gestaffelten Dosen (5 Dosisgruppen, je 10 Tiere) zur Generierung kompletter Dosis-Effekt-Kurven (Tag 7 bzw. 14). Einzeitbestrahlungen des lokalen Testfeldes finden ebenfalls mit gestaffelten Dosen statt. L-NAME (täglich 0,2 mg/kg i.p.) wird an den Bestrahlungstagen 30 Minuten vor der Bestrahlung appliziert. Bei Einzeitbestrahlung werden 2 verschiedene Behandlungszeiträume getestet: 3 Tage vor der Bestrahlung bis zur Erstdiagnose (-3/D) oder Ausheilung der Ulzerationen (-3/H). In Kombination mit fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche werden 3 Zeiträume untersucht (-3/7, -3/D oder -3/H). Bei 2 Wochen fraktionierter Bestrahlung erfolgt die L-NAME-Gabe in folgenden Intervallen: -3/7, -3/D, -3/H, -3/14 oder 7/14. Als quantaler Endpunkt für Dosis-EffektAnalysen dient die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld. Mittels Logit-Analyse werden Dosis-Effekt-Beziehungen ermittelt. Der ED50-Wert und dessen Standardabweichung σ dienen der Charakterisierung der Dosis-Effekt-Kurven. In histologischen Untersuchungen werden maximal 10 Fraktionen zu 3 Gy über 2 Wochen appliziert, mit/ohne Gabe von L-NAME von Tag -3 bis zur Tötung. Die Zungenentnahme erfolgt bei je 5 Tieren in zweitägigen Abständen (Tag 1 bis 25). Ergebnisse: Für die alleinige Einzeitbestrahlung ergibt sich eine signifikante Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz mit einer ED50 von 13,6±1,0 Gy. Die mittlere Latenzzeit beträgt 10,6±1,1 Tage, die durchschnittliche Ulkusdauer 3,5±1,0 Tage. Nach alleiniger einwöchig fraktionierter Bestrahlung beträgt die ED50 der Testbestrahlung 12,3±0,8 Gy. L-NAME von Tag -3 bis Tag 6 bzw. -3/D hat keinen signifikanten Einfluss (ED50 13,3±1,2 Gy bzw. 12,8±1,0 Gy). Lediglich für den Applikationszeitraum Tag -3/H kann eine signifikante Erhöhung der ED50 auf 14,7±1,7 Gy (p=0,0298) nachgewiesen werden. Die Testbestrahlung nach 2-wöchiger Fraktionierung ohne L-NAME ergibt eine ED50 von 13,0±0,1 Gy. L-NAME hat wiederum keinen signifikanten Einfluss auf die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut (ED50-Werte: -3/6 - 12,9±0,1 Gy, -3/14 - 13,0±0,1 Gy, -3/H - 13,8±1,4 Gy und 7/14 - 13,1±0,8 Gy). Während alleiniger fraktionierter Bestrahlung nimmt die Zellzahl zunächst ab (Tag 11: 70 %). Im Anschluss steigt sie über das Ausgangsniveau (Tag 19: 126 %). F¨ur die L-NAME-behandelte Schleimhaut findet sich ein qualitativ vergleichbarer Verlauf; es zeigt sich lediglich eine geringfügige Erhöhung der Zellzahl in der funktionellen Schicht (150 % statt 140 %). Die Epitheldicke nimmt unter L-NAME-Behandlung in den ersten Tagen der Nachbeobachtungszeit deutlich zu. Schlußfolgerungen: Zusammenfassend erweist sich in der vorliegenden Arbeit nur die L-NAME-Applikation -3/H bei einwöchig fraktionierter Bestrahlung als wirksam, wobei der Grund f¨ur diese selektive Wirkung unklar bleibt. Offensichtlich sind NOvermittelte Prozesse ohne substanzielle Relevanz f¨ur die epitheliale Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist die Hemmung von iNOS durch L-NAME keine aussichtsreiche Strategie zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis, und sollte deshalb auch nicht in klinischen Studien verfolgt werden. Die Frage, ob andere (i)NOS-Hemmstoffe ein mukoprotektives Potential besitzen, sollte in weiteren, translationalen strahlenbiologischen Studien geklärt werden.