Bei der Bestrahlung von Kopf-Hals-Tumoren tritt die orale Mukositis als wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung auf. Verschiedene prophylaktische und therapeutische Maßnahmen wurden untersucht, jedoch konnte bisher keine Methode in der klinischen Routine etabliert werden. Ein neuer Ansatz ist die Verwendung des Cholesterinsynthese-hemmers Lovastatin. Für diesen Wirkstoff konnte in vorhergehenden Untersuchungen ein mukoprotektiver Effekt nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen diesem schleimhaut-schützenden Effekt und der Expression von induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und CD105 betrachtet. Das Enzym iNOS ist an Entzündungsreaktionen beteiligt; NT stellt ein Folgeprodukt des durch iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids dar. CD105 wird von aktivierten Monozyten und Makrophagen exprimiert. Ausgangsmaterial für die vorliegende Studie waren 174 Präparate aus dem vorangegangenen Tierversuch. In diesem wurde bei Mäusen eine fraktionierte Schnauzenbestrahlung zum Teil mit einer Lovastatingabe kombiniert. Zusätzlich wurden Tiere alleinig mit Lovastatin behandelt. Für diesen Versuch wurden Mäuse des Stammes C3H/Neu verwendet. Die Bestrahlung erfolgte mit 5 x 3 Gy über zwei Wochen. Lovastatin wurde in einer Dosis von 16 mg/kg oral verabreicht. Gegenstand der aktuellen Untersuchung war - neben der allgemeinen histologischen Charakterisierung - die immunhistochemische Darstellung von iNOS, NT und CD105 im Epithel der Zungenunterseite sowie im subepithelialen Gewebe. Ausgewertet wurden die Gesamtzellzahl im Epithel, die Zahl iNOS- und NT-positiver Zellkerne in Germinativ- und funktioneller Schicht sowie jeweils die Farbintensität der positiven Epithelzellen. In der L. propria und L. muscularis wurden die CD105-, iNOS-, und NT-positiven Makrophagen sowie die weiteren iNOS- und NT-positiven Immunzellen erfasst und ihre Farbintensität bestimmt. Weiterhin wurde die Homogenität und Intensität der Expression von iNOS im Endothel bewertet. Die Auswertung umfasst die deskriptive Darstellung der Werteverläufe dieser Parameter. Aufgrund der geringen Anzahl von drei Versuchstieren je Tag und Gruppe wurde auf die Berechnung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse verzichtet. Die Gesamtzellzahl im Zungenepithel zeigte bei Bestrahlung eine deutliche Reduktion auf 65 % des Ausgangswertes. Mit Beendigung der Behandlung war eine entsprechende Erholung zu sehen. Die alleinige Lovastatinbehandlung bewirkte dagegen eine Steigerung der Gesamtzell-zahl auf ca. 110 %. Während iNOS sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Epithelgewebe nachweisbar war, war NT im unbehandelten Epithel kaum vorhanden. Die Ausgangswerte betrugen 22 % iNOS-positive Kerne in der Germinativschicht und 8 % in der funktionellen Schicht, sowie 2 % und 1 % für die NT-Färbung. In der Germinativschicht waren sowohl bei alleiniger Bestrahlung als auch bei alleiniger Lovastatintherapie 30 - 50 % der Zell-kerne iNOS-positiv. Bei zweiwöchiger Kombinationstherapie lagen die Werte teils darunter; bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen sie vornehmlich in dem oberen Bereich. In der funktionellen Schicht spiegelten sich diese Verteilungsmuster wider, allerdings lag die Anzahl positiver Kerne insgesamt überwiegend unter 30 %. Die Zahl NT-positiver Zellkerne stieg in beiden Schichten infolge der Bestrahlung auf ca. 50 - 60 %. Unter alleiniger Lovastatintherapie lag sie unter 30 %. Die zweiwöchige Kombination zeigte ebenfalls eine Tendenz zum niederen Bereich. Bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen die Werte geringgradig vermehrt im höheren Bereich. Die Anfärbung der Makrophagen gegen CD105 verdeutlichte bei allen Gruppen eine Reduktion der Makrophagenzahl auf ca. 50 % des Ausgangswertes. Auch die Zahl iNOS-positiver Makrophagen reduzierte sich in allen Behandlungsgruppen einheitlich auf unter 80 % der Norm. Die Zahl NT-positiver Makrophagen lag näher am Ausgangswert. Im Gegensatz dazu waren die restlichen Immunzellen unter Behandlung vermehrt iNOS-positiv. Die Werte lagen häufig weit oberhalb des Referenzbereichs. Dabei zeigte im Vergleich die alleinige Bestrahlung die niedrigsten Werte mit maximal 136 % der Norm. Bei der Färbung gegen NT konnten nur bei alleiniger Lovastatinverabreichung konstant Werte oberhalb des Ausgangswertes festgestellt werden. Innerhalb der Untersuchungen konnte das Endothel nur mit iNOS-AK auswertbar angefärbt werden. Es zeigte in allen Gruppen eine durchgängig homogene Färbung. Die Farbintensität war mittelmäßig und wurde in allen Behandlungsgruppen zum Ende des Untersuchungszeitraums kräftiger. Als Resultat dieser Arbeit ist festzuhalten, dass bei allen vier Behandlungsvarianten iNOS und NT in hohem Maße in der Germinativschicht des Epithels exprimiert wurden. In der funktionellen Schicht war die Expression von iNOS schwächer, während die NT-expression nahezu gleich blieb. Damit muss NT eine längere Halbwertszeit haben. Des Weiteren waren nicht alle aktivierten (CD105-positiven) Makrophagen iNOS-positiv und wiederum produzierte iNOS nicht in allen Zellen NT. Dies wurde auch durch die deutlich höhere Zahl iNOS-positiver Immunzellen in den Ll. propriae und musculares deutlich. Die biochemischen Abläufe, durch welche Lovastatin zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis führt, bleiben daher weiterhin zu erforschen. In der durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein eindeutiger Hinweis auf einen Zusammenhang mit dem iNOS-NT-Signaltransduktionsweg.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100 / During radiation of head-and-neck-cancer oral mucositis is the most important and dose-limiting early side effect. Different preventive and theoretical procedures were investigated, but so far there has been no method established in clinical routine. A new approach is the application of the cholesterol synthesis inhibitor lovastatin. Previous investigtions proved a mucoprotective effect of this agent. In this investigation the correlation between this mucoprotective effect and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and CD105 was observed. The enzyme iNOS takes part in inflammtory reactions; NT is a secondary product of the nitric oxide produced by iNOS. CD105 is expressed by activated monocytes and macrophages. The source material for this study were 174 preparations from previous animal examinations. In this investigation a daily fractionated radiation of the snout was partly combined with lovastatin applications. In addition some mice were treated with lovastatin only. For this research mice of the line C3H/Neu were used. Radiation was performed with 5 x 3Gy over two weeks. Lovastatin was used at an oral dose of 16mg/kg. The matter of the research was - next to general histological characterisation - the immunohistochemical exposure of iNOS, NT and CD105 in the epithelial layer of the undersurface of the tongue and in the subepithelial tissue. The total cell count in the epithelium, the number of iNOS- and NT-positive nuclei in the germinal and the functional layer, as well as the intensity of the staining were evaluated. In the l. propria and l. muscularis CD105-, iNOS-, and NT-positive macrophages and other iNOS- and NT-positive immune cells were identified and the intensity of their staining was determined. Furthermore the homogeneity and intensity of the expression of iNOS in the endothelium were rated. The analysis contains the descriptive presentation of the value patterns of these parameters. Because of the small number of three test animals per day and group the statistical significance of the results was not determined. In consequence of radiotherapy the total cell count in the epithelium decreased to 65% of origin. Recovery was visible after termination of the treatment. With lovastatin medication only, the cell count increased to approximately 110%. While iNOS was present in the untreated as well as in the treated tissue, NT was hardly visible in the untreated one. The basic values were 22% of iNOS-positive nuclei in the germinal layer and 8% in the functional layer, and 2% and 1% for the NT-staining. Both, sole radiation and sole lovastatin therapy, showed 30-50% iNOS-positive nuclei in the germinal layer. With combined therapy for two weeks the values were partially lower, with lovastatin treatment from day 7 they were in the upper range. This group distribution was reflected in the functional layer, although altogether the quantity of positive nuclei was mostly under 30%. Due to radiation the number of NT-positive nuclei increased to 50-60% in both layers. With sole lovastatin therapy it was under 30%. Combined therapy over two weeks showed a tendency to the lower range too. With lovastatin treatment from day 7 the values were situated a little bit more in the upper range. The macrophage staining against CD105 revealed a reduction of macrophage cell count to approximately 50% of origin in all groups. Likewise the number of iNOS-positive macrophages decreased in all groups consistently to less than 80% of normal. The number of NT-positive macrophages was closer to the origin. In contrast to this, the other immunocompetent cells were increasingly iNOS-positive under treatment. Often values were high above the reference range. In comparison sole radiation therapy showed the lowest values with a maximum of 136% of normal. Regarding the staining against NT only sole lovastatin treatment showed values constantly above origin. Within this study the only evaluable staining for the endothelium was with iNOS-antibody. It showed a constant homogeneous staining in all groups. The intensity of the staining was moderate and increased in all treatment groups towards the end of the examination. Therefore it can be concluded that under treatment iNOS and NT were both highly expressed in the germinal layer. In the functional layer the expression of iNOS was reduced whereas the expression of NT remained about the same. So NT must have a longer half-life. In addition not all activated (CD105-positive) macrophages were also iNOS-positive and again iNOS did not produce NT in all cells. This was also proven by the distinct higher number of iNOS-positive immunocompetent cells in the ll. propriae and musculares. Therefore the biochemical processes, because of which lovastatin leads to the reduction of the radiogenic mucositis enoralis, remain to be investigated. During the present investigation there was no distinct hint for a correlation with the iNOS-NT-pathway.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100

Die strahleninduzierte Mucositis enoralis ist eine der bedeutendsten und häufig dosislimitierenden frühen Nebenwirkungen der Strahlentherapie fortgeschrittener Kopf Hals Tumoren. Bis heute hat sich noch kein allgemein gültiges Konzept zur Therapie und Prophylaxe der Mundschleimhautentzündung durchsetzen können. Ein Ansatz zur selektiven, auf der Tumorbiologie beruhenden Beeinflussung der Strahlenempfindlichkeit von Tumoren ist die Blockade des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR). In Kombination mit Strahlentherapie sollen so die lokale Tumorkontrolle und die Heilungschancen verbessert werden. Die Wirkung der Tyrosinkinase-Inhibitoren BIBX1382BF und Erlotinib auf histomorphologische Parameter in der Mundschleimhaut sowie auf die Expression der als Stammzellmarker diskutierten Proteine p63, Integrin β1 und CD44 wurde in der vorliegenden Arbeit im Vergleich zur alleinigen fraktionierten Bestrahlung untersucht. Für die histologischen Studien erfolgte die zweiwöchige fraktionierte Bestrahlung der Schnauzen von Mäusen des Inzuchtstammes C3H/Neu mit zehn Fraktionen zu je 3 Gy (Tag 0-4, Tag 7-11). Die Versuche gliederten sich in vier Gruppen: • I/A (54 Tiere) und II/A (40 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, keine weitere Behandlung • I/B (51 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, zusätzlich orale Gabe von BIBX1382BF, 50 mg/kg KG per os, von Tag 0-14 je 30 min nach der Bestrahlung • II/B (35 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, zusätzlich orale Gabe von Erlotinib, 50 mg/kg KG per os, von Tag 0-11 je 30 min nach der Bestrahlung. Die Entnahme der Zungen erfolgte im Versuch I bei jeweils drei Tieren pro Tag von Tag 0 bis Tag 17. Im Versuch II wurden an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14 jeweils die Zungen von fünf Tieren entnommen. Anschließend folgten die Fixierung der Zungen in Formalin, die Einbettung in Paraffin und die Anfertigung 3 µm dicker Gewebeschnitte. Die Zungenpräparate wurden für die histologischen Untersuchungen mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Für die immunhistochemischen Färbungen wurde die ABC-Methode eingesetzt. Das Epithel der Zungenunterseite wurde lichtmikroskopisch hinsichtlich Zellzahl, Schichtdicke und Expression der potentiellen Stammzellmarker p63, Integrin β1 und CD44 ausgewertet. Aufgrund der geringen Gruppengröße (Versuch I: drei Tiere pro Datenpunkt; Versuch II: fünf Tiere pro Datenpunkt) wurde auf eine eingehende statistische Testung verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschränkt sich auf eine beschreibende Darstellung des Verlaufs der Einzelparameter über den Gesamtzeitraum. Die Zellzahlen verringerten sich während der ersten Bestrahlungswoche auf 60-70 % der Ausgangswerte, stagnierten in der zweiten Woche und stiegen schließlich bis zum Ende der Nachbeobachtung wieder an. Zwischen den nur bestrahlten und den zusätzlich mit BIBX1382BF behandelten Tieren war kein Unterschied feststellbar. Ein gleichsinniger Verlauf war auch in Versuch II zu beobachten, wobei die Zellzahlen der mit Erlotinib behandelten Tiere in der Funktionsschicht durchgängig höher ausfielen als in Versuchsreihe A. Die Dicke des Gesamtepithels bzw. der einzelnen Epithelschichten zeigte im Versuch I unter Bestrahlung große individuelle Schwankungen. Unter zusätzlicher BIBX1382BF-Gabe wurden oft niedrigere Werte gemessen. Im Versuch II blieb die Dicke des Gesamtepithels unter Fraktionierung konstant. Von Tag 0-12 wurden bei zusätzlicher Erlotinib-Applikation geringere Werte der Gesamtdicke gemessen als unter alleiniger Bestrahlung, ansonsten fielen die Veränderungen der Epitheldicke unabhängig von der Erlotinib-Gabe gering aus. Der kurzzeitigen, mit dem allgemeinen Zellverlust einhergehenden Verringerung der p63-Expression zu Beginn der Bestrahlung folgt bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes die Normalisierung der p63-positiven Zellen. Mit EGFR-Blockade sind gegenüber der alleinigen Bestrahlung keine Unterschiede in der p63-Expression festzustellen. Die Integrin β1-Expression nahm im Verlauf der Bestrahlung ab. Unter EGFR-Blockade mit BIBX1382BF zeigte sich an den Tagen 2-9 und 12-16 ein schwächeres Färbesignal als im fraktioniert bestrahlten Epithel, was für eine mögliche Interaktion des EGF-Rezeptors mit Integrin β1 spricht. Im Versuch II waren unabhängig von der Erlotinib-Gabe keine Unterschiede in der Expression von Integrin β1 feststellbar. Die CD44-Expression im Epithel wurde durch Bestrahlung gefördert. Übereinstimmend konnte in der vorliegenden Arbeit in beiden Versuchen eine Steigerung der CD44-Färbeintensität über den jeweiligen Referenzbereich festgestellt werden. Eine Blockade der EGFR-Aktivität durch Erlotinib reduzierte die Expression von CD44, wie in Versuch II/B im initialen Abfall der CD44-Färbeintensität deutlich wurde. Doch schon ab Tag 4 wurden im Versuch II/A und II/B gleich starke Färbesignale für CD44 erfasst. Insgesamt ergaben sich unter EGFR-Inhibition mittels BIBX1382BF oder Erlotinib keine Hinweise auf Veränderungen der untersuchten Parameter während einer zweiwöchigen fraktionierten Bestrahlung. Ob diese Ergebnisse auch auf andere Tyrosinkinase-Inhibitoren bzw. unterschiedliche Wirkstoffklassen (z. B. Anti-EGFR-Antikörper) übertragbar sind, muss in weiteren Studien untersucht werden. / Radiation-induced oral mucositis is one of the most important and often dose limiting early side effects of radiotherapy of advanced tumours in the head-and-neck region. To this day, no general concept for therapy and prophylaxis of the oral mucositis has been established. The inhibition of the epidermal growth factor receptor (EGFR) is one approach to a selective increase of the radiosensitivity of tumours based on the tumour biology. In combination with radiotherapy, application of EGFR-inhibitors is supposed to increase the local tumour control and the chances of cure. The aim of the present study was to investigate the effect of the tyrosine kinase inhibitors BIBX1382BF and Erlotinib on the radiation response of the oral mucosa and on the expression of different proteins that are discussed to be markers of epithelial stem cells. For the histological studies, the snouts of C3H/Neu mice were irradiated with ten daily fractions of 3 Gy over two weeks (on days 0-4, 7-11). The experiments comprised four treatment groups: • I/A (54 animals) and II/A (40 animals): fractionated irradiation, no further treatment • I/B (51 animals): fractionated irradiation, administration of BIBX1382BF, 50 mg/kg per os, once daily (days 0-14) 30 min after the radiation treatment • II/B (35 animals): fractionated irradiation, administration of Erlotinib, 50 mg/kg per os, once daily (days 0-11) 30 min after the radiation treatment. Between day 0 and 17, three animals of the groups I/A and I/B were euthanised per day. In the experimental arms II/A and II/B five mice were killed on day 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14, respectively. The tongues were excised, fixed in formalin, embedded in paraffin and 3 µm thick sections were prepared. Subsequently, the tongue sections were stained with haematoxylin and eosin or with an ABC kit to visualise proteins of interest. The epithelium of the lower tongue was examined by light microscopy regarding the following parameters: cell numbers, thickness of epithelial layers and expression of the potential stem cell markers p63, integrin β1 and CD44. Due to the limited number of animals per data point (experiment I: three mice per data point; experiment II: five mice per data point), a detailed statistical analysis was not performed. The present study is determined to describe the parameter variations over the observation period. Cell numbers decreased to 60-70 % of the pre-treatment control values within the first week of irradiation alone, remained constant in the second week, and then slowly increased until the end of the observation period. There was no difference between radiotherapy alone or combined treatment with BIBX1382BF. In experiment II similar observations were made with higher cell numbers in the functional layer of the epithelium of the Erlotinib treated animals than in the irradiated group. The thickness of the epithelium and its individual layers showed high inter individual differences in experiment I. In treatment group I/B, lower values of thickness were often detected in comparison to group I/A. In experiment II the thickness of the epithelium remained constant under fractionated irradiation. Between day 0 and 12 the Erlotinib treatment slightly decreased the thickness of the whole epithelium in comparison to the irradiated group. Besides, there were only minor changes in the thickness of the different layers. Associated with the general loss of cells, radiation treatment led to a transient decrease in the expression of p63. The number of p63-positive cells recovered until the end of the observation period. A similar expression pattern of p63-positivity was found independent of EGFR inhibition. The expression of integrin β1 decreased during fractionated irradiation. On days 2-9 and 12-16, the changes were more pronounced in combination with BIBX1382BF treatment which indicates a potential interaction of the EGF receptor with integrin β1. In experiment II, no differences between the exclusively irradiated group and the combined treatment with Erlotinib were found for the expression patterns of integrin β1. Irradiation alone resulted in a higher epithelial expression of CD44. Accordingly, a general increase of CD44 staining intensity was observed in both experiments exceeding control values. Due to the EGFR inhibition with Erlotinib, the expression of CD44 initially decreased. However, by day 4 no persisting differences in staining intensity could be observed independent of EGFR inhibition. In summary, EGFR inhibition via BIBX1382BF or Erlotinib did not result in alterations of the analysed parameters during two weeks of fractionated irradiation. Further studies are required to demonstrate if the present findings are transferable to other tyrosine kinase inhibitors or different substance classes (e.g. inhibiting receptor antibodies).

Betriebe in Mittelgebirgslagen mit einem hohen Anteil Grassilagefütterung, der damit verbundenen größeren K-Aufnahme sowie höheren DCAD (Dietary-Cation-Anion-Difference) sollten für Gebärparese stärker prädisponiert sein. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Ursachen des Festliegens im Erzgebirge unter Berücksichtigung der DCAD zu ermitteln. Dazu wurden sowohl Fütterungsparameter und die Körperkondition analysiert, als auch Blut- und Harnuntersuchungen ante (a.p.) und post partum (p.p.) durchgeführt. In 21 Betrieben wurden insgesamt 249 Kühe im Zeitraum von 2 Wochen ante partum (a.p.) bis eine Woche p.p. untersucht. Bei 206 gesunden Kühen erfolgte 2 Wochen a.p. eine jeweils einmalige Harn- und Blutentnahmen. Ferner wurden bei 43 peripartal festliegenden Kühen nur Blut- und Harnproben direkt vor der Behandlung analysiert. Die sonographische Ermittlung der Rückenfettdicke (RFD) erfolgte bei je zehn klinisch gesunden Kühen pro Betrieb je 2 Wochen a.p. Die Silageproben (Grundfutteranalyse) wurden hinsichtlich ihrer Inhaltsstoffe untersucht und die DCAD berechnet. Laktationsnummern, Milchleistungen und Krankheitsinzidenzen der Kühe wurden ermittelt. Im Blutserum wurden ß-Hydroxy-Butyrat (BHB), Cholesterol, Bilirubin, Aspartat-Aminotransferase (ASATS), Creatinkinase (CK), Alkalische Phosphatase (AP), Protein (TP), Albumin, Harnstoff, Creatinin, Calcium (Ca), anorganisches Phosphat (Pi), Magnesium (Mg), Natrium (Na), Kalium (K) und im Vollblut die Leukozytenanzahl bestimmt. Im Harn erfolgte die Analyse derselben Mineralstoffe wie im Serum sowie weiterhin des pH-Wertes, der NSBA (Netto-Säure-Basen-Ausscheidung) und des Creatinins. Errechnet wurden die fraktionierten Eliminationen der einzelnen Mineralstoffe, der BSQ (Basen-Säure-QuotienTS) aus den Mengen der Basen, Säuren und Ammoniumionen im Harn sowie der Creatininquotient aus Harn- und Serumcreatinin. Befunde der Klinisch gesunden Kühe zwei Wochen a.p.: Die durchschnittliche RFD der Kühe lag in den Betrieben im Mittel zwischen 19 bis 26 mm. Muskel- und Knochenstoffwechsel charakterisierende Parameter waren physiologisch. Die Mediane der AP-Aktivität im Serum lagen in 15 der 21 Betriebe unter 100 U/l. Energie- und Eiweißstoffwechsel, Leukozytenanzahlen sowie Mineralstoffe in Serum und Harn ergaben keine Hinweise für präpartale Stoffwechselstörungen. Die Mediane von pH-Wert, NSBA sowie K- und Creatininkonzentrationen im Harn überschritten in mindestens fünf Betrieben die Grenzwerte, da die K-Konzentrationen in den Silagen bis fünffach über dem empfohlenen Bereich lagen. Die DCAD lag im Mittel aller Betriebe mit 458 meq/kg T weit über –100 bis +150 meq/kg T. Eine gesicherte Korrelation zur Anzahl der Festlieger bestand nicht. Befunde der Festlieger p.p.: Die Festlieger hatten zu je 60% reduzierte Ca- sowie Pi- und zu 16% verminderte Mg-Konzentrationen. Die Verteilung auf die Gebärparesetypen war wie folgt: Typ I = 42% Typ II= 19%, Typ III = 5%, Typ IV = 12% und Typ V = 21%. Dies entspricht mehrheitlich den Literaturangaben. Die Ca-, Pi- und Mg-Konzentrationen im Harn lagen bei den Festliegern in den physiologischen Bereichen. Die Mehrzahl der Festlieger hatte gleichzeitig erhöhte CK- (74%) und AST-Aktivitäten (53%). In 38% der Fälle war die AP-Aktivität vermindert. Die K- und NSBA-Konzentrationen im Harn der Festlieger zeigten als Folge der reduzierten Futteraufnahme gegenüber den Befunden a.p. eine Abnahme bis in den unteren physiologischen Bereich und z.T. darunter. Störungen des Energiestoffwechsels in Form erhöhter Ketonkörper- (58%) und Bilirubin- (40%) sowie reduzierter Cholesterol- (58%) Konzentrationen hatte die Mehrheit der festliegenden Kühe. Dabei war die kombinierte Ca-Pi-BHB-Stoffwechselstörung die Regel, traf aber nicht in jedem Fall zu. Die moderat veränderten Parameter des Energiestoffwechsels sind offensichtlich Folge der reduzierten Futteraufnahme. Eine Steigerung der Leukozytenzahl als Hinweis auf eine akut-entzündliche Reaktion bestand bei 44% der Festlieger, - die Leukopenie war die Ausnahme. Mit der Leukozytose waren in 36,8% respektive 42,1% der Fälle eine Hypokalz- resp. Hypophosphatämie gekoppelt. Bei dem größeren Teil (47,4%) der Leukozytosen waren die Ca- und Pi-Konzentrationen jedoch physiologisch. Das zeigt in Übereinstimmung mit den klinischen Befunden, dass entzündliche Prozesse und Verletzungen als weitere Ursache des Festliegens angesehen werden mussten. Fazit: Die erhöhte DCAD war in den untersuchten Mittelgebirgsbetrieben kein prädisponierender Faktor für die Gebärparese. Neben den bekannten Ca-Pi-Störungen spielten entzündliche Prozesse dafür eine wichtige Rolle.

Zu den wichtigsten Werkzeugen in der medizinischen Diagnostik gehören bildgebende Verfahren, wie die Magnetresonanztomographie. Ein weiteres diagnostisches Hilfsmittel ist die Palpation, die es erlaubt, Veränderungen oberflächennaher Organe qualitativ zu erfassen. Die Magnetresonanzelastographie (MRE) stellt eine Kombination dieser Techniken dar. Das Prinzip der MRE besteht darin Gewebedeformationen aufgrund extern induzierter Scherwellen mittels bewegungssensitiver MR-Bildgebung darzustellen und über die Art der Deformation auf die Elastizität des Gewebes zu schließen. Einen großen Anteil schwerwiegender Erkrankungen bilden Störungen des Herz-Kreislaufsystems. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, die in-vivo MRE am menschlichen Herzen ermöglicht. Die Weiterentwicklung der mechanischen Anregungseinheit ergab mit Einführung eines Audio-Lautsprechers das nötige Instrument, Vibrationen in innere Organe zu übertragen. Der entscheidende Faktor bei der Herz-MRE war die Geschwindigkeit der Aufnahme, die zur Entwicklung der ''fraktionierten MRE'' führte. Die Basis waren schnelle Herzbildgebungstechniken, wie die balancierte Steady-State- (bSSFP) und Spoiled Steady-State-Technik (SPGRE). Die Einführung eines unbalancierten Phasenpräparationsgradienten in der bSSFP-Aufnahmetechnik lieferte ein verbessertes SNR und zusammen mit der SPGRE-MRE-Aufnahmetechnik ließen sich damit MRE-Studien auch am menschlichen Herzen durchführen. Es gelang erstmals, extern induzierte mechanische Schwingungen in das Herz zu koppeln und mittels fraktionierter MRE mit hoher zeitlicher Auflösung zu detektieren. Die in 6 gesunden Probanden beobachtete Modulation der Scherwellenamplituden innerhalb des Myokards korrelierte sehr gut mit den Kontraktionszuständen des Herzens. Die entwickelten Techniken und Methoden sind ein Schritt hin zur routinemäßigen klinischen Anwendung der MRE am Herzen und deuten auf ein hohes Potential im Bereich der Diagnostik kardialer Erkrankungen hin. / Imaging techniques, including magnetic resonance imaging, belong to the most important tools in modern medical diagnostics. Another diagnostic aid is palpation, which is suitable for the qualitative characterization of pathological changes in organs near the surface. Magnetic resonance elastography (MRE) is a combination of these techniques. In principle, MRE uses motion-sensitive MR-imaging to depict tissue deformation caused by externally induced shear waves. The type of deformation supply useful information about the elasticity of the tissue. Cardiac disorders are among the most common diseases. The goal of this study was to develop a method of applying in-vivo MRE to the human heart. The development of the mechanical stimulus, ultimately resulting in the introduction of an audio speaker as the source of vibration, provided the necessary means to introduce vibrations into inner organs. A crucial factor in applying MRE to the heart is the speed of the recording, which led to the development of "fractional MRE". The currently conventional fast heart imaging techniques were used as a starting point. The use of an unbalanced phase preparation gradient in the balanced steady-state imaging technique resulted in an improved phase-to-noise ratio. Along with the spoiled steady-state MRE imaging technique, initial MRE-studies on the human heart were performed. For the first time, externally induced mechanical vibrations were successfully introduced into the heart and were detected using fractional MRE with a high temporal resolution. The modulation of the shear wave amplitudes observed in the myocard of 6 healthy subjects correlated with the phases of the cardiac cycle. The techniques and methods developed here are a step toward routine clinical application of MRE of the heart and indicate high potential in the area of early diagnosis of cardiac disease.