Bayreuth, Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

A beta-glicosidase digestiva (Mr 50.000) de Spodoptera frugiperda (Sfgli50) possui em seu sítio ativo resíduos de aminoácido que interagem de forma não-covalente com o substrato. Essas interações não-covalentes garantem a especificidade da enzima em relação a seus substratos. Esse trabalho visa estudar o papel desses aminoácidos e suas interações com o substrato na especificidade da Sfgli50. Para isso, um modelo de previsão de especificidade baseado nas energias de interação entre diferentes resíduos de aminoácidos das posições 451 e 39 da Sfgli50 e as hidroxilas 4 e 6 do glicone do substrato foi elaborado e testado através da produção e caracterização de três duplos-mutantes (S451N39, S451E39 e A451E39) da Sfgli50. O modelo mostrou-se apropriado qualitativamente para previsão do comportamento da especificidade frente a glucosídeos e galactosídeos, mas totalmente inadequado para previsões de preferência frente a fucosídeos e galactosídeos. Estas conclusões indicaram que pressupostos iniciais do modelo, como independência das interações com o substrato e conservação estrutural do sítio ativo nos mutantes, estavam errados. Analisou-se também a contribuição de outros dois resíduos do subsítio do glicone para a especificidade da Sfgli50: H142 e N186, cujas energias de interação ainda não haviam sido determinadas. Experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados para introduzir resíduos de Alanina nas posições 142 e 186. Os mutantes H142A e N186A foram expressos em bactéria e em seguida parcialmente purificados. O mutante N186A apresentou baixa atividade catalítica, o que limitou sua caracterização. Por outro lado, a determinação de parâmetros cinéticos (Vmáx e Vmáx/Km) mostrou que, em contraste com a Sfgli50 selvagem, o mutante H142A é menos específico, principalmente no que diz respeito a fucosídeos. / The Mr 50,000 Spodoptera frugiperda beta-glycosidase (Sfgli50) has active site amino acid residues that interact non-covalently with the substrate. These non-covalent interactions determine the enzyme’s specificity towards its substrates. This work aims to study the role of these amino acids and its interactions with the substrate in the specificity of Sfgli50. A specificity prediction model was created for such purpose. This model is based on interaction energies between different amino acid residues in positions 451 and 39 of the enzyme and hydroxyls 4 and 6 of the substrate\'s glycone. The production and characterization of three double-mutants (S451N39, S451E39 and A451E39) were used to test the model, which proved to be qualitatively appropriate to predict the Sfgli50 specificity when comparing glucosides to galactosides. However, the model failed to predict the differences in specificity between fucosides and galactosides. These results indicate that the model\'s assumptions of independent interactions with the substrate and structural conservation of the active site in the mutants were wrong. Sfgli50 glycone residues H142 and N186, whose interaction energies had not been previously determined, were also investigated. Site-directed mutagenesis replaced the former residues in positions 142 and 186 for Alanine. The mutant proteins H142A and N186A were synthesized in bacteria and partially purified. Mutant N186A presented low catalytic activity, hindering its characterization. In contrast, mutant H142A is less specific than the wild-type Sfgli50. Kinetic parameters indicated that it is specially less specific to fucosides.

A beta-glicosidase digestiva (Mr 50.000) de Spodoptera frugiperda (Sfgli50) possui em seu sítio ativo resíduos de aminoácido que interagem de forma não-covalente com o substrato. Essas interações não-covalentes garantem a especificidade da enzima em relação a seus substratos. Esse trabalho visa estudar o papel desses aminoácidos e suas interações com o substrato na especificidade da Sfgli50. Para isso, um modelo de previsão de especificidade baseado nas energias de interação entre diferentes resíduos de aminoácidos das posições 451 e 39 da Sfgli50 e as hidroxilas 4 e 6 do glicone do substrato foi elaborado e testado através da produção e caracterização de três duplos-mutantes (S451N39, S451E39 e A451E39) da Sfgli50. O modelo mostrou-se apropriado qualitativamente para previsão do comportamento da especificidade frente a glucosídeos e galactosídeos, mas totalmente inadequado para previsões de preferência frente a fucosídeos e galactosídeos. Estas conclusões indicaram que pressupostos iniciais do modelo, como independência das interações com o substrato e conservação estrutural do sítio ativo nos mutantes, estavam errados. Analisou-se também a contribuição de outros dois resíduos do subsítio do glicone para a especificidade da Sfgli50: H142 e N186, cujas energias de interação ainda não haviam sido determinadas. Experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados para introduzir resíduos de Alanina nas posições 142 e 186. Os mutantes H142A e N186A foram expressos em bactéria e em seguida parcialmente purificados. O mutante N186A apresentou baixa atividade catalítica, o que limitou sua caracterização. Por outro lado, a determinação de parâmetros cinéticos (Vmáx e Vmáx/Km) mostrou que, em contraste com a Sfgli50 selvagem, o mutante H142A é menos específico, principalmente no que diz respeito a fucosídeos. / The Mr 50,000 Spodoptera frugiperda beta-glycosidase (Sfgli50) has active site amino acid residues that interact non-covalently with the substrate. These non-covalent interactions determine the enzyme’s specificity towards its substrates. This work aims to study the role of these amino acids and its interactions with the substrate in the specificity of Sfgli50. A specificity prediction model was created for such purpose. This model is based on interaction energies between different amino acid residues in positions 451 and 39 of the enzyme and hydroxyls 4 and 6 of the substrate\'s glycone. The production and characterization of three double-mutants (S451N39, S451E39 and A451E39) were used to test the model, which proved to be qualitatively appropriate to predict the Sfgli50 specificity when comparing glucosides to galactosides. However, the model failed to predict the differences in specificity between fucosides and galactosides. These results indicate that the model\'s assumptions of independent interactions with the substrate and structural conservation of the active site in the mutants were wrong. Sfgli50 glycone residues H142 and N186, whose interaction energies had not been previously determined, were also investigated. Site-directed mutagenesis replaced the former residues in positions 142 and 186 for Alanine. The mutant proteins H142A and N186A were synthesized in bacteria and partially purified. Mutant N186A presented low catalytic activity, hindering its characterization. In contrast, mutant H142A is less specific than the wild-type Sfgli50. Kinetic parameters indicated that it is specially less specific to fucosides.

Nematóides entomopatogênicos (NEPS) e bactérias simbiontes representam uma das estratégias não-químicas mais bem sucedidas para o controle de insetos. Os juvenis infectivos dos nematóides Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. buscam o hospedeiro no solo, o penetram através de aberturas naturais e rapidamente matam o inseto pela liberação, na hemocele, de bactérias entomopatogênicas dos gêneros Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp., respectivamente. A lagarta militar, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho (Zea mays) no Brasil e os danos provocados pelo inseto reduzem o rendimento da cultura em até 39% e perdas de 500 milhões de dólares anuais. Isolados nativos de nematóides entomopatogênicos ativos contra S. frugiperda representam uma alternativa promissora ao uso intensivo de inseticidas químicos para o controle da lagarta-militar nas plantações de milho. Este estudo caracterizou a patogenicidade de oito isolados NEPs de incidência regional (denominados NEPETs) para o controle da praga em estádios associados ao solo. Os testes foram realizados com larvas de último ínstar (in vitro) e na fase de pré-pupa (in vitro e no solo). Os dados indicam que os percentuais de mortalidade mais elevados, tanto para lagartas como para pré-pupas, foram produzidos por isolados da família Heterorhabditidae. Estes isolados também foram os que produziram maior número de juvenis infectivos/larva mostrando a capacidade de multiplicação de NEPETs neste hospedeiro. As bactérias simbióticas associada aos nematóides entomopatogênicos foram isoladas, caracterizadas por testes bioquímicos e classificadas com base no seqüenciamento do 16S rDNA. Os isolados bacterianos, identificados como Photorhabdus e Xenorhabdus, quando injetados na hemocele de S. frugiperda produziram altos níveis de letalidade particularmente aqueles obtidos a partir dos nematóides da família Heterorhabditidae. Também avaliou-se a produção de urease de quatro bactérias entomopatogênicas, duas Photorhabdus e duas Xenorhabdus, in vitro e ao longo da infecção promovida pela injeção de bactérias. O padrão de produção de urease in vitro seguiu a curva de crescimento bacteriano e houve acúmulo da enzima na fase estacionária. Os dados sugerem uma correlação positiva entre a produção de urease pela bactéria e os efeitos entomopatogênicos sobre as lagartas. Há correlação direta entre a atividade específica alcançada por ureases ácidas na fase estacionária e mortalidade induzida por bactérias injetadas em lagartas de S. frugiperda. / Entomopathogenic nematodes (EPNs) and symbiotic bacteria represent one of the best non-chemical strategies for insect control. Infective juveniles of Heterorhabditis sp. and Steinernema sp. nematodes actively seek the host in the soil, penetrating through insect’s natural openings to reach the hemocoel where symbiotic bacteria Photorhabdus sp. and Xenorhabdus sp., respectively, are released and rapidly kill the insect host. The fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the major insect pests in corn (Zea mays) crops in Brazil, with infestations resulting in reduction up to 39% yield and losses amounting US$ 500 millions annually. Native strains of entomopathogenic nematodes active against S. frugiperda represent a promising alternative to the intensive use of chemical insecticides to control fall armyworm population in corn plantations. This study characterized the pathogenicity of eight EPNs isolates of regional incidence (denominated NEPETs) in stages where pest is associated to the soil. Tests were conducted with last instar larvae (in vitro) and in prepupae stage (in vitro and in soil). Data indicate that the highest mortality percentages, either for worms or prepupae, were produced by isolates of the Heterorhabditidae family. These isolates were also the ones that produced higher amounts of IJs/larvae showing the multiplication capacity of NEPETs on the host insect. Symbiotic bacteria associated to the entomopathogenic nematodes were successfully isolated and classified taxonomically both by phenotypic-biochemical criteria and sequencing of 16S rDNA. Isolated bacteria, identified as Photorhabdus and Xenorhabdus, injected into S. frugiperda hemocoel produced high levels of lethality particularly those from Heterorhabditidae family. We also studied the urease production of four entomopathogenic bacteria, two Photorhabdus and two Xenorhabdus, both in vitro and during the course of infection caused by injection of the bacteria. The pattern of urease production in vitro followed the bacteria growth curve accumulating in high levels towards the stationary phase. The data suggest a positive correlation between urease production by the bacteria and their entomopathogenic effect. There is direct correlation between the specific activity reached by acidic ureases at the stationary phase and mortality induced by injecting bacteria into S. frugiperda larvae.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-19T13:27:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 406149 bytes, checksum: 4512c9710f3dc585f44f6e1d4b401f97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-19T13:27:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 406149 bytes, checksum: 4512c9710f3dc585f44f6e1d4b401f97 (MD5) Previous issue date: 2001-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram conduzidos testes para avaliar a atividade inseticida de amidas sintéticas análogas à piperina, utilizando a espécie Spodoptera frugiperda como inseto-modelo para estes estudos. A criação de S. frugiperda foi mantida à base de dieta artificial. Inicialmente foram realizados bioensaios que consistiram na aplicação tópica de 0,5 μL das seguintes amidas, pertencentes a dois grupos diferentes: 1) N-alquil-3-(3,4-metilenodioxifenil)-(E)-prop-2- enamidas, que são as amidas: N-isopropil-3-(3,4-metilenodioxifenil-(E)-prop- 2enamida [1], N-isopentil-3(3,4-etilenodioxifenil)-(E)-prop-2-enamida [2], N- hexill-3-(3,4-metilenodioxifenil)-(E)-prop-2-enamida [3], N-pentil-3-(3,4- metiledioxfenil)-(E)-prop-2-enamida [4] e N-dodecil-3(3,4-metilenodioxi- fenil)-(E)-prop-2-enamida [5]; e 2) N-alquil-(3,4-metilenodioxifenil)-amidas, que são as amidas N-isopropil-(3,4-metilenodioxifenil) amida [6], N-isopentill- (3,4-metilenodioxifenil) amida [7], N-hexil-(3,4-metilenodioxifenil) amida [8], N-butil-(3,4-metilenodioxifenil) amida [9], N-etil-(3,4-metilenodioxifenil) amida [10] e N-pentil-(3,4-metilenodioxifenil) amida [11]; além do butóxido de piperonila, com ampla faixa de concentrações de cada amida em larvas de 3 o instar para obtenção de faixas de respostas, que serviram de referencial na preparação dos bioensaios definitivos de dose-resposta. Após esses, um segundo bioensaio foi então realizado, a fim de verificar o efeito de doses mais baixas dos compostos mais promissores ao longo do desenvolvimento do inseto, avaliando os seguintes parâmetros: mortalidade larval (corrigida para a testemunha), ganho de peso em função do tempo, sobrevivência durante o período larval, duração do período larval e dieta assimilada (diferença entre a dieta consumida e fezes). A metodologia de aplicação foi a mesma descrita anteriormente, utilizando acetona como solvente e depositando 0,5 μL das amidas N-isopropil-(3,4-metilenodioxifenil)-amida [6], N-isopentil-(3,4- metilenodioxifenil)-amida [7] e N-hexil-(3,4-metilenodioxifenil)-amida [8] e do butóxido de piperonila, aplicadas nas seguintes concentrações sobre os insetos, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 e 0,05 mg/mL, correspondentes às doses 1.344,0, 268,8, 134,4, 26,88 e 13,44 ppm, respectivamente. As amidas [6], [7] e [8], sintetizadas e avaliadas pelos ensaios de aplicação tópica, apresentaram efeito inseticida para a espécie S. frugiperda. O butóxido de piperonila apresentou baixa toxicidade, além de não comprometer significativamente a sobrevivência larval nas doses utilizadas, ao contrário do que foi observado para as outras amidas. Além da mortalidade das larvas, foram observadas também, quando aplicada a dose de 268,8 ppm, anomalias morfológicas, além de prolongamento dos instares de S. frugiperda. Em relação ao ganho de peso dos insetos expostos às três amidas e ao butóxido de piperonila, foram constatadas diferenças significativas entre os tratamentos. Os resultados dos testes com dieta assimilada apresentaram diferenças significativas com base nas superposições das barras de erro-padrão, sendo a amida [6] a que apresentou o menor valor do assimilado nas doses de 26,88 e 134,4 ppm e a amida [7], a que apresentou o menor valor do assimilado em relação às outras, na dose de 1.344,0 ppm. / Tests were carried out to assess the insecticide activity of synthetic amides derived from piperine using the species Spodoptera frugiperda as insect model for these studies. S. frugiperda was mass reared in laboratory conditions using an artificial diet. At first, bioassays were carried out with topical application of 0.5 μL of each insecticide solution in 3rd instar larvae. We used a broad range of concentrations to be used for establishing dose- response bioassays. After these, a second bioassay was carried out to assess the subtle effects of the most promising insecticide compounds. The following parameters were evaluated in this study final larval mortality (corrected for the control), weight gain, survival during the larval period, duration the larval period and absorbed diet. The insecticides were also topically applied in this second experiment, as previously described, using acetone as solvent and the following concentrations of N-isopentyl-(3,4-methylenodioxiphenyl)-amide, N-isopropyl-(3,4-methylenodioxiphenyl))-amide, N-hexyl-(3,4-methylenodioxiphenyl))-amide, besides piperonyl butoxide: 5.0, 1.0, 0.5,0.1, and 0.05 mg/mL. These four were most toxic amides towards S. frugiperda observed in the first experiment. Among them, piperonyl butoxide was the less toxic compound while the others showed similar and lighter toxicity to this insect species. The toxic effect of these compounds followed the same trend observed for acute toxicity with piperonyl butoxide showing lower larval toxicity than the other three amides which resemble each other and showed greater insecticide effect. There were significant differences in weight gain when the different insecticides were used, but this does not seem to be related weith their acute and sublettal. There was difference in absorbed diet per insect exposed to each compound, with piperonyl butoxide showing higher values and a peak of diet absorption seem to occur when insects are exposed to doses 26.88 and 134.4 ppm, showing lower in the dose de 1,344.0 ppm.

Nematóides entomopatogênicos (NEPS) e bactérias simbiontes representam uma das estratégias não-químicas mais bem sucedidas para o controle de insetos. Os juvenis infectivos dos nematóides Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. buscam o hospedeiro no solo, o penetram através de aberturas naturais e rapidamente matam o inseto pela liberação, na hemocele, de bactérias entomopatogênicas dos gêneros Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp., respectivamente. A lagarta militar, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho (Zea mays) no Brasil e os danos provocados pelo inseto reduzem o rendimento da cultura em até 39% e perdas de 500 milhões de dólares anuais. Isolados nativos de nematóides entomopatogênicos ativos contra S. frugiperda representam uma alternativa promissora ao uso intensivo de inseticidas químicos para o controle da lagarta-militar nas plantações de milho. Este estudo caracterizou a patogenicidade de oito isolados NEPs de incidência regional (denominados NEPETs) para o controle da praga em estádios associados ao solo. Os testes foram realizados com larvas de último ínstar (in vitro) e na fase de pré-pupa (in vitro e no solo). Os dados indicam que os percentuais de mortalidade mais elevados, tanto para lagartas como para pré-pupas, foram produzidos por isolados da família Heterorhabditidae. Estes isolados também foram os que produziram maior número de juvenis infectivos/larva mostrando a capacidade de multiplicação de NEPETs neste hospedeiro. As bactérias simbióticas associada aos nematóides entomopatogênicos foram isoladas, caracterizadas por testes bioquímicos e classificadas com base no seqüenciamento do 16S rDNA. Os isolados bacterianos, identificados como Photorhabdus e Xenorhabdus, quando injetados na hemocele de S. frugiperda produziram altos níveis de letalidade particularmente aqueles obtidos a partir dos nematóides da família Heterorhabditidae. Também avaliou-se a produção de urease de quatro bactérias entomopatogênicas, duas Photorhabdus e duas Xenorhabdus, in vitro e ao longo da infecção promovida pela injeção de bactérias. O padrão de produção de urease in vitro seguiu a curva de crescimento bacteriano e houve acúmulo da enzima na fase estacionária. Os dados sugerem uma correlação positiva entre a produção de urease pela bactéria e os efeitos entomopatogênicos sobre as lagartas. Há correlação direta entre a atividade específica alcançada por ureases ácidas na fase estacionária e mortalidade induzida por bactérias injetadas em lagartas de S. frugiperda. / Entomopathogenic nematodes (EPNs) and symbiotic bacteria represent one of the best non-chemical strategies for insect control. Infective juveniles of Heterorhabditis sp. and Steinernema sp. nematodes actively seek the host in the soil, penetrating through insect’s natural openings to reach the hemocoel where symbiotic bacteria Photorhabdus sp. and Xenorhabdus sp., respectively, are released and rapidly kill the insect host. The fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the major insect pests in corn (Zea mays) crops in Brazil, with infestations resulting in reduction up to 39% yield and losses amounting US$ 500 millions annually. Native strains of entomopathogenic nematodes active against S. frugiperda represent a promising alternative to the intensive use of chemical insecticides to control fall armyworm population in corn plantations. This study characterized the pathogenicity of eight EPNs isolates of regional incidence (denominated NEPETs) in stages where pest is associated to the soil. Tests were conducted with last instar larvae (in vitro) and in prepupae stage (in vitro and in soil). Data indicate that the highest mortality percentages, either for worms or prepupae, were produced by isolates of the Heterorhabditidae family. These isolates were also the ones that produced higher amounts of IJs/larvae showing the multiplication capacity of NEPETs on the host insect. Symbiotic bacteria associated to the entomopathogenic nematodes were successfully isolated and classified taxonomically both by phenotypic-biochemical criteria and sequencing of 16S rDNA. Isolated bacteria, identified as Photorhabdus and Xenorhabdus, injected into S. frugiperda hemocoel produced high levels of lethality particularly those from Heterorhabditidae family. We also studied the urease production of four entomopathogenic bacteria, two Photorhabdus and two Xenorhabdus, both in vitro and during the course of infection caused by injection of the bacteria. The pattern of urease production in vitro followed the bacteria growth curve accumulating in high levels towards the stationary phase. The data suggest a positive correlation between urease production by the bacteria and their entomopathogenic effect. There is direct correlation between the specific activity reached by acidic ureases at the stationary phase and mortality induced by injecting bacteria into S. frugiperda larvae.

Nematóides entomopatogênicos (NEPS) e bactérias simbiontes representam uma das estratégias não-químicas mais bem sucedidas para o controle de insetos. Os juvenis infectivos dos nematóides Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. buscam o hospedeiro no solo, o penetram através de aberturas naturais e rapidamente matam o inseto pela liberação, na hemocele, de bactérias entomopatogênicas dos gêneros Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp., respectivamente. A lagarta militar, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho (Zea mays) no Brasil e os danos provocados pelo inseto reduzem o rendimento da cultura em até 39% e perdas de 500 milhões de dólares anuais. Isolados nativos de nematóides entomopatogênicos ativos contra S. frugiperda representam uma alternativa promissora ao uso intensivo de inseticidas químicos para o controle da lagarta-militar nas plantações de milho. Este estudo caracterizou a patogenicidade de oito isolados NEPs de incidência regional (denominados NEPETs) para o controle da praga em estádios associados ao solo. Os testes foram realizados com larvas de último ínstar (in vitro) e na fase de pré-pupa (in vitro e no solo). Os dados indicam que os percentuais de mortalidade mais elevados, tanto para lagartas como para pré-pupas, foram produzidos por isolados da família Heterorhabditidae. Estes isolados também foram os que produziram maior número de juvenis infectivos/larva mostrando a capacidade de multiplicação de NEPETs neste hospedeiro. As bactérias simbióticas associada aos nematóides entomopatogênicos foram isoladas, caracterizadas por testes bioquímicos e classificadas com base no seqüenciamento do 16S rDNA. Os isolados bacterianos, identificados como Photorhabdus e Xenorhabdus, quando injetados na hemocele de S. frugiperda produziram altos níveis de letalidade particularmente aqueles obtidos a partir dos nematóides da família Heterorhabditidae. Também avaliou-se a produção de urease de quatro bactérias entomopatogênicas, duas Photorhabdus e duas Xenorhabdus, in vitro e ao longo da infecção promovida pela injeção de bactérias. O padrão de produção de urease in vitro seguiu a curva de crescimento bacteriano e houve acúmulo da enzima na fase estacionária. Os dados sugerem uma correlação positiva entre a produção de urease pela bactéria e os efeitos entomopatogênicos sobre as lagartas. Há correlação direta entre a atividade específica alcançada por ureases ácidas na fase estacionária e mortalidade induzida por bactérias injetadas em lagartas de S. frugiperda. / Entomopathogenic nematodes (EPNs) and symbiotic bacteria represent one of the best non-chemical strategies for insect control. Infective juveniles of Heterorhabditis sp. and Steinernema sp. nematodes actively seek the host in the soil, penetrating through insect’s natural openings to reach the hemocoel where symbiotic bacteria Photorhabdus sp. and Xenorhabdus sp., respectively, are released and rapidly kill the insect host. The fall armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the major insect pests in corn (Zea mays) crops in Brazil, with infestations resulting in reduction up to 39% yield and losses amounting US$ 500 millions annually. Native strains of entomopathogenic nematodes active against S. frugiperda represent a promising alternative to the intensive use of chemical insecticides to control fall armyworm population in corn plantations. This study characterized the pathogenicity of eight EPNs isolates of regional incidence (denominated NEPETs) in stages where pest is associated to the soil. Tests were conducted with last instar larvae (in vitro) and in prepupae stage (in vitro and in soil). Data indicate that the highest mortality percentages, either for worms or prepupae, were produced by isolates of the Heterorhabditidae family. These isolates were also the ones that produced higher amounts of IJs/larvae showing the multiplication capacity of NEPETs on the host insect. Symbiotic bacteria associated to the entomopathogenic nematodes were successfully isolated and classified taxonomically both by phenotypic-biochemical criteria and sequencing of 16S rDNA. Isolated bacteria, identified as Photorhabdus and Xenorhabdus, injected into S. frugiperda hemocoel produced high levels of lethality particularly those from Heterorhabditidae family. We also studied the urease production of four entomopathogenic bacteria, two Photorhabdus and two Xenorhabdus, both in vitro and during the course of infection caused by injection of the bacteria. The pattern of urease production in vitro followed the bacteria growth curve accumulating in high levels towards the stationary phase. The data suggest a positive correlation between urease production by the bacteria and their entomopathogenic effect. There is direct correlation between the specific activity reached by acidic ureases at the stationary phase and mortality induced by injecting bacteria into S. frugiperda larvae.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1783_1.pdf: 1620607 bytes, checksum: 740dfdb9a7891e7e5c56e5a81432c826 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram-positiva, que produz um cristal, durante a fase de esporulação, composto por proteínas (toxinas Cry) que possuem ação entomocida principalmente para as ordens Lepidoptera, Diptera e Coleoptera. Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) é um lepidóptero neotropical polífago, praga, de milho, algodão e arroz, responsável por perdas de até 30% na produção destas culturas. Este trabalho teve por finalidade identificar e caracterizar genes em cepas de Bt da Paraíba e Pernambuco, que possuíssem ação contra S. frugiperda. Foram utilizados 81 oligonucleotídeos (primers) das famílias cry1 a cry28 e cyt1 e cyt2 para as reações em cadeia da DNA polimerase (PCR), bem como análise bioquímica através de SDS-PAGE. Os fragmentos que foram obtidos no tamanho esperado foram purificados e seqüenciados. Duzentas e uma cepas foram analisadas no presente trabalho, sendo 30 isoladas a partir de amostras de solos de Pernambuco e 171 isolados da Paraíba. Os bioensaios foram realizados avaliando-se quais cepas possuíam atividade tóxica para S. frugiperda e em seguida, foram determinadas as concentrações letais (CL50) das cepas consideradas tóxicas. Em bioensaios com os isolados de Pernambuco, a cepa I4A7 apresentou mortalidade superior a 50% (94,3%) na concentração de 1x109 esporos/ml e CL50 de 76,58 μg/cm2 contra S. frugiperda. Esta cepa apresentou amplicons para os genes cry4Aa, cry4Ba, cry10Aa, cry11Aa, cyt1Aa e cyt2Ba, e proteínas de 130, 70 e 29 kDa, perfis gênico e protéico idênticos aos do B. thuringiensis israelensis (Bti), o qual é relatado na literatura como tóxico para Diptera. Estes fragmentos foram seqüenciados e apresentaram homologia de 99% a 100% com as seqüências dos genes originais depositadas no banco de dados. Nas amostras da Paraíba, apenas dois isolados, BV-5 e AN2-3, apresentaram fragmentos de tamanho esperado, ambos para o par de iniciadores gerais da família cry1. Estas cepas não apresentaram toxicidade contra S. frugiperda. Através da seqüência parcial de nucleotídeos e da seqüência deduzida de aminoácidos dos genes das cepas BV-5 e AN2-3, verificou-se que estes genes possuem maior identidade com genes da família cry8. A seqüência parcial de aminoácidos deduzida do gene da cepa BV-5 apresentou variabilidade na região do domínio II, que é responsável pelo reconhecimento e ligação da toxina. A cepa I4A7 é promissora, e poderá ser usada no manejo integrado de S. frugiperda e/ou manejo de resistência a toxinas Cry. Já as cepas AN2-3 e BV-5 deverão ser testadas contra pragas da ordem Coleoptera para determinar a especificidade das mesmas

African horsesickness virus (AHSV) belongs to the Orbivirus genus within the family Reoviridae. AHSV is transmitted to vertebrates by Culicoides midges and causes an acute disease in horses with a high mortality rate. The virion consists of an outer layer composed of proteins VP2 and VP5, which surround an icosahedral core containing two major proteins, VP3 and VP7, three minor proteins, VP1, VP4 and VP6, and ten segments of double-stranded (ds)RNA. The VP7 protein is not only important in maintaining the structural integrity of the virus particles, but has been reported to play a key role in Culicoides cell entry. The phenomenon of RNA interference (RNAi), which can be used to selectively silence homologous genes post-transcriptionally, has revolutionized approaches to study gene function and it is also projected as a potential tool to inhibit virus replication. In mammalian cells, RNAi can be triggered by the direct introduction of 21-23 nucleotide duplexes of small interfering RNA (siRNA) that specifically and potently inhibits endogenous and heterogeneous gene expression. Consequently, the aims of the investigation were to develop RNAi assays whereby the expression of the AHSV-9 VP7 gene could be suppressed in Spodoptera frugiperda insect cells and in mammalian BHK-21 cell culture, as well as to determine whether gene-specific siRNAs may prevent AHSV-9 infection in cell culture. To investigate RNAi-mediated silencing of an enhanced green fluorescent protein (eGFP) in S.frugiperda cells, the bacmid expression system was used. Transfection of the insect cells with an eGFP-specific siRNA prior to infection with the recombinant bacmid, inhibited eGFP protein expression by 75%, as quantified by fluorometry. Although the results suggest that RNAi could potentially be used as tool to study the function of an expressed transgene in insect cells, the lack of complete inhibition, coupled with the highly cytolytic nature of the bacmid, may complicate interpretation of the gene interference results. To investigate whether siRNAs targeting the AHSV-9 VP7 mRNA is able to silence VP7 protein expression, two siRNAs were designed that targeted different regions on the VP7 mRNA. siVP7-336 and siVP7-441, directed at nucleotides 336-356 and 441-461 on the VP7 coding strand, respectively, were chemically synthesized. The effect of these siRNAs on VP7 protein expression was evaluated by cotransfection of BHK-21 cells with the respective siRNAs and the VP7 expression plasmid pCMVVP7- eGFP. The results indicated that siVP7-336 and siVP7-441 inhibited VP7-eGFP expression by 88% and 75%, respectively. BHK-21 cells were subsequently transfected with the respective siRNAs in separate experiments followed by viral infection. The VP7 mRNA quantities were measured by quantitative reverse transcription PCR and the effect of the siRNAs on viral replication was evaluated by plaque assays. Of the two siRNAs, siVP7-336 was found to be the most effective inhibitor of VP7 transcription and suppressed VP7 mRNA by 93%. The exposure of BHK-21 cells to the VP7 genespecific siRNA, siVP7-336, also led to a 84% reduction in progeny virions, as measured by a plaque assay. Taken together, the results demonstrate that siRNA-mediated gene silencing is an efficient approach for reducing the level of VP7 transcripts and proteins and for inhibiting virus propagation. / Dissertation (MSc (Microbiology))--University of Pretoria, 2008. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

Fall armyworm larvae (FAW), which are serious pests in the southern United States, show retarded growth when they feed on insect-resistant maize inbreds Mp704 and Mp708. These maize genotypes are not only resistant to FAW, but to a number of other lepidopteran pests. In these genotypes, a unique, extracellular, 33-KDa cysteine protease (Mir1-CP) rapidly accumulates in the whorl in response to insect feeding. Initial morphological studies on larvae feeding on resistant maize plants over-expressing the cysteine protease showed severe damage in insect?s first line of defense, the peritrophic matrix (PM). But it is not known whether the cysteine protease has unprecedented effect on insect defense mechanisms. This study focuses on understanding the functional involvement of the cysteine protease (Mir1-CP) in a plant-herbivore defense mechanism. I used purified, recombinant 33-KDa cysteine protease (Mir1-CP) and its two mutated forms (Mut1 and Mut2) to determine their effects on the permeability of PMs from fall armyworm and other lepidopteran larvae. The purified Mir1-CP was also used to determine its minimal effective dosage on lepidopteran larval growth as well as to qualitatively determine their direct morphological effects on PM and gut regions of fall armyworm larvae. In vitro permeability studies demonstrated that the recombinant Mir1-CP directly permeabilized the PM and requires both cysteine at the active site and the terminal 25 amino acids to achieve complete permeabilization. Dose response study suggested that physiologically relevant concentrations of Mir1-CP in the maize whorl would be effective in controlling a broad range of lepidopteran pests. The study also suggested that stacking Mir1-CP and Bt-toxin (Bt-CryIIA) genes in transgenic plants could broaden the normal range of both Mir1-CP and Bt-toxin. Morphological studies using three different microscopic techniques showed damaged PM in larvae fed on Mir1-CP diet. These results suggest that by directly permeabilizing and damaging the PM, the Mir1-CP provides critical defense in host plants against lepidopteran pests.