Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-21T11:39:00Z No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-23T19:40:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-23T19:40:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Telma Alves Garcia.PDF: 1041199 bytes, checksum: f43838dc7fc3e11fe66d87f8ec48892f (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo Pycnoporus sanguineus foi eficiente na descoloração de alguns corantes empregados na indústria farmacêutica. Os resultados obtidos indicam que o P. sanguineus e principalmente as lacases produzidas por este fungo apresentam grande potencial para aplicações biotecnológicas. Para a produção de lacase (EC 1.10.3.2, p-difenol:dioxigênio oxidoredutase) o fungo foi cultivado em meio contendo 2,5- xilidina e cobre como indutores. Duas isoformas da enzima (Lac 1 e Lac 2) foram identificadas e separadas através de cromatografia de interação hidrofóbica. As enzimas Lac 1 e Lac 2 apresentaram uma massa molecular de 79,7 kDa e 68,1 kDa, respectivamente. As duas isoformas apresentaram características bioquímicas diferentes. A enzima Lac 1, contendo menor atividade especifica, foi parcialmente purificada. Usando seringaldazina como substrato a enzima apresentou um pH ótimo de 4,8, temperatura ótima de 25-30 °C e Km de 10,3 μmol.L-1. A enzima mostrou baixa estabilidade à temperatura de 50 °C, mantendo apenas 10% da atividade após 5 horas de incubação. A enzima Lac 2, contendo maior atividade especifica, foi purificada com um rendimento final de 13,9 %. Usando seringaldazina como substrato a enzima apresentou um pH ótimo de 4,2, temperatura ótima de 50 °C e Km de 8,3 μmol.L-1. A enzima mostrou alta estabilidade a temperatura de 50 °C, mantendo 100 % da atividade após 5 horas de incubação. Ambas as enzimas foram inibidas por azida sódica e fluoreto de sódio. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fungus Pycnoporus sanguineus was efficient in the discoloration of some dyes used in the pharmaceutical industry. Ours results indicated that the P. sanguineus and mainly laccases produced by this fungus presents great potential for biotechnological applications. For the production of laccase (EC 1.10.3.2, p-diphenol:dioxigen oxidoreductase) this fungus was cultivated in medium containing 2,5- xylidine and copper as inducer. Two isoforms of the enzyme (Lac 1 and Lac 2) had been identified and separated through chromatography on hydrophobic interaction. The enzymes Lac 1 and Lac 2 had presented a molecular mass of 68.1 kDa and 79.7 kDa, respectively. The two isoforms presented different biochemical characteristics. The enzyme Lac 1, with lower specific activity, was partially purified. Using syringaldazine as substrate the enzyme showed pH optima of 4.8, temperature optima of 25-30 °C and Km of 10.3 μmol.L-1. The enzyme showed low stability at temperature of 50 °C, keeping only 10% of the activity, after 5 hours of incubation. The enzyme Lac 2, with higher specific activity, was purified with a final yield of 13.9 %. Using syringaldazine as substrate the enzyme presented one pH optima of 4.2, temperature optima of 50 °C and Km of 8.3 μmol.L-1. The enzyme showed high stability at temperature of 50 °C, keeping 100% of the activity even after 5 hours of incubation. Both enzymes were inhibited by sodium azide and sodium fluoride.

Orientador: Nelson C. Duran / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T13:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_CarlosHenriqueLemos_D.pdf: 3836613 bytes, checksum: 4e8a8a8e214397dc07ac2df5de977615 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2016. / Aspergillus terreus é um fungo filamentoso que produz numerosas enzimas com uma vasta gama de aplicações biotecnológicas. Este estudo tem como objetivo caracterizar a produção das enzimas lignocelulolíticas de A. terreus, estirpe BLU24, crescido em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais (bagaço de cana de açúcar, casca do grão de soja e piolho de algodão sujo) e analisar a expressão diferencial desses genes em resposta a essas fontes de carbono. A crescente utilização de resíduos como bagaço de mandioca, bagaço de cana de açúcar, polpa de beterraba, polpa de maçã, farelo de trigo, etc evidencia que diferentes áreas da indústria utilizam estes resíduos como matéria prima para a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ração animal, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, produtos farmacêuticos. A. terreus BLU24 foi crescido à 28 ° C sob agitação (120rpm) ao longo de um período de dez dias. O secretoma foi analisado de acordo com as atividades enzimáticas de xilanase, endoglucanase, mananase, pectinase e FPase identificadas de acordo com o método DNS. Dentre todas as atividades estudadas a que foi mais expressiva foi à atividade relacionada com proteínas do tipo xilanases. A atividade de xilanase após cultivo no meio contendo piolho de algodão sujo atingiu um valor máximo de 0,935 UI.mL-1 no sexto dia de cultivo, já no meio com bagaço de cana de açúcar este valor foi de 1,017 UI.mL-1 no sétimo dia e no meio contendo casca do grão da soja a atividade máxima foi também no sétimo dia, atingindo um valor de 1,019 UI.mL-1. A maior atividade de CMCase foi no bagaço de cana de açúcar que atingiu um valor máximo no quarto dia de cultivo (0,275 UI.mL-1). Já a maior atividade de pectinase foi no substrato casca do grão da soja no terceiro dia de cultivo (0,494 UI.mL-1) e a maior atividade de FPase foi também na casca do grão da soja no sétimo dia de cultivo (0,494 UI.mL-1). O preparo das bibliotecas de cDNA de mRNA do fungo A. terreus foi conduzida utilizando o kit RNA TruSeq Kit v2 (® Illumina, Inc.). A. terreus também mostrou um desempenho significativo como produtor de holocellulases. As bibliotecas de cDNA sequenciadas produziu uma média total de 2,7 GB, com cerca de 27 milhões de leituras. Aproximadamente 81% das leituras exibiram uma boa qualidade (Q> = 30). A caracterização deste transcritoma oferece a descoberta de genes promissores para aplicação em diferentes áreas da indústria biotecnológica. As análises de RNA-seq do isolado A. terreus BLU24 cultivado em bagaço de cana de açúcar identificaram um total de 102 genes CAZy, já em casca do grão da soja o total de genes CAZy foi 159 (padj <0.01). Tanto no tratamento contendo bagaço de cana de açúcar quanto no tratamento contendo casca do grão da soja comparado a glicose, as famílias CAZy mais abundantes foram a GH3 e GH43. Análises das famílias glicosil hidrolases revelou regulação positiva de 6 genes que codificam proteínas da família GH5, 7 genes da família GH43 e 8 genes da família GH3 no tratamento com bagaço de cana de açúcar contra a glicose. Similarmente no tratamento com casca do grão da soja contra a glicose foram relatados 7 genes que codificam proteínas da família GH5, 6 genes da família GH10, 11 genes da família GH3 e 12 genes da família GH43 (p<0,01). Os genes que codificam proteínas relacionadas com a degradação da biomassa são expressos nas duas fontes de carbono estudadas, porém alguns desses genes com expressão diferencial ocorreram apenas no bagaço de cana de açúcar ou apenas na casca do grão da soja nos tempos de 36 e 48 horas. O estudo do transcritoma global do fungo A. terreus BLU24 identificou uma grande quantidade de genes que codificam enzimas utilizadas na degradação da parede celular vegetal e também fatores de transcrição que são importantes neste processo. A. terreus é conhecido por ser um bom produtor de enzimas envolvidas na degradação da biomassa vegetal e uma característica importante deste fungo é o fato dele ser termofílico e com isso poder produzir enzimas termotolerantes com diferentes aplicações na indústria têxtil, biocombustível, papel, alimento e etc. / Aspergillus terreus is a filamentous fungus that produces numerous enzymes with a wide range of biotechnological applications. The aim of this study was to characterize the production of lignocellulolytic enzymes in A. terreus strain BLU 24 following culture in growth media containing agro-industrial residues (sugar cane bagasse, soy bean hulls and cotton louse) and analyze differential gene expression in response to carbon source. Given the abundance of agricultural waste materials such as cassava bagasse, sugar cane bagasse, sugar beet pulp, apple pulp and wheat bran, numerous applications are under development using such residues as raw material. These include utilization in production of ethanol, industrial enzymes, edible mushrooms, animal feed, organic acids, amino acids, secondary metabolites, and pharmaceutical products. A. terreus BLU 24 was grown at 28 ° C under agitation (120rpm) over a period of ten days. The secretome was analyzed for xylanase, endoglucanase, mannanase, pectinase and FPase enzyme activities, according to the DNS method. Among all the activities studied, most significant enzyme activities were related to xylanase, with activity reaching a maximum of 0.935 UI.mL-1 after six days incubation in minimal growth medium plus cotton louse as sole carbon source, 1.017 UI.mL-1 after seven days incubation with sugarcane bagasse as carbon source, and 1,019 UI.mL-1after seven days incubation with soybean hulls as carbon source. Most CMCase activity was observed on sugarcane bagasse, with a peak in activity by the fourth day of cultivation (0.275 UI.mL-1). Pectinase activity was higher on soybean hulls as substrate after cultivation during three days (0.494 UI.mL-1) , with highest FPase activity observed on soybean hulls in seven day old cultures (0.494 IU. ml- 1).Characterization of the fungal transcriptome was conducted to identify candidate genes for application in different areas of the biotechnology industry. cDNA libraries were prepared from A. terreus BLU 24 mRNA following 36 h and 48 h growth on sugarcane bagasse and soybean hull-derived carbon sources. Illumina Hiseq sequencing of cDNA libraries produced a mean total of 2.7 GB, equaling approximately 27 million reads. A total of 81% of the reads exhibited good quality (Q> = 30). RNA-seq analysis of A. terreus BLU 24 identified a total of 102 expressed cazy genes following growth on sugarcane bagasse with 159 identified following growth on media with soybean hull carbon source (padj <0.01). For both carbon source treatments, compared to glucose, the most abundant Cazy gene families were GH3 and GH43. Analysis of the glycosyl hydrolase family revealed up-regulation of six genes encoding GH5, seven GH43 genes and eight GH3-encoding genes following cultivation on sugarcane bagasse against glucose. Similarly, cultivation on soybean hulls against glucose revealed seven genes that encode protein family GH5, six genes encoding GH10, 11 genes encoding GH3 and 12 genes encoding the GH43 family (p<0,01). Genes encoding proteins related to the degradation of biomass were expressed during growth on the two carbon sources studied, with differential expression in relation to glucose occuring for different sets of genes in sugarcane bagasse and soybean hulls at each growth period of 36 and 48 hours. This global analysis of the transcriptome for the fungus A. terreus BLU 24 following cultivation on lignocellulosic carbon sources enabled identification of a number of genes encoding enzymes and transcription factors involved in the degradation of the plant cell wall. A. terreus is recognized as a promising fungal species for production of enzymes involved in the degradation of plant biomass. Given that this fungus is also able to produce thermophilic enzymes, considerable potential exists in the application of the characterized candidate genes in different applications in the textile, biofuel, paper, food and feed industries.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-18T17:05:33Z No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-15T16:54:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-15T16:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) Previous issue date: 2018-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / Os fungos filamentosos saprofíticos representam fontes promissoras de enzimas holocelulolíticas, e o cultivo desses organismos em fontes de carbono indutoras baratas, como resíduos agrícolas, permitiria a obtenção de coquetéis enzimáticos com custos reduzidos. Neste trabalho, o potencial de um isolado de Clonostachys byssicola para a produção de enzimas holocelulolíticas é descrito. A avaliação do secretoma produzido pelo fungo em cultivo submerso com diversas fontes de carbono lignicelulósicas através de eletroforese em BN-PAGE revelou a presença de bandas de alta massa molecular, correspondentes à complexos proteicos putativos. A partir da identificação desses complexos por LC-MS/MS, verificou-se que os complexos abrigam diversas enzimas envolvidas na degradação de holocelulose, como celulases, mananases, xilanases e pectinases. Os complexos também são cataliticamente ativos, uma vez que foi possível identificar atividade enzimática in gel. Em outra etapa do trabalho, o secretoma do fungo obtido em fontes de carbono comerciais (Avicel, carboximetilcelulose-CMC e xilana de aveia) e agroindustriais (sabugo de milho, casca do grão de soja, engaço de bananeira e bagaço de cana-de-açúcar) foi caracterizado por LC-MS/MS. A maior diversidade de proteínas foi identificada no secretoma obtido em Avicel, seguido pelo secretoma obtido em sabugo de milho. Foram identificadas várias enzimas relacionadas à degradação da lignocelulose, o que evidencia que o fungo é capaz de produzir sistemas enzimáticos completos específicos para cada uma das principais frações da holocelulose: celulose, hemiceluloses e pectina. Os secretomas obtidos em resíduos agroindustriais foram empregados para sacarificar sabugo de milho e bagaço de cana-de-açúcar parcialmente delignificados. Os extratos brutos produziram mais açúcares a partir da hidrólise do sabugo, revelando uma maior digestibilidade deste substrato quando comparado ao bagaço, o que pode decorrer do menor teor de lignina observado após o tratamento do sabugo de milho. Os secretomas permitiram a solubilização de grande parte da xilana presente no sabugo de milho, com a liberação de xilobiose como principal produto de hidrólise. O isolado de C. byssicola foi ainda avaliado quanto à capacidade de produção de enzimas pectinolíticas quando cultivado em meio contendo casca de laranja como única fonte de carbono. O fungo foi capaz de secretar pectinases e pectato liases. A caracterização do secretoma feita por LCMS/MS revelou uma grande diversidade de enzimas atuantes na cadeia principal e sobre substituintes laterais. Uma fração parcialmente purificada foi caracterizada quanto ao efeito da temperatura e pH, e a atividade de pectinase foi máxima a 50ºC, e na faixa de pH entre 4,5 e 6,0. Estas características sugerem a aplicação da enzima para o tratamento de sucos de frutas com baixa acidez. Uma das enzimas parcialmente purificada foi identificada por LC-MS/MS, e a partir desta identificação, o transcrito correspondente foi clonado com sucesso em Escherichia coli, e a etapa de expressão em Pichia pastoris se encontra em andamento. Todos os resultados deste trabalho revelam C. byssicola como uma nova fonte de enzimas holocelulolíticas, que ainda precisa ser explorada. / Saprophytic filamentous fungi represent promising sources of holocellulolytic enzymes, and the cultivation of these organisms in inexpensive inducing carbon sources, such as agricultural residues, would allow the production of enzymatic cocktails at reduced costs. In this work, the potential of a Clonostachys byssicola strain for the production of holocellulolytic enzymes is described. The evaluation of the secretome produced by the fungus in submerged culture with several lignicellulosic carbon sources through BN-PAGE electrophoresis revealed the presence of bands of high molecular mass, corresponding to the putative protein complexes. From the identification of these bands by LC-MS / MS, the complexes were found to harbor several enzymes involved in the degradation of holocellulose, such as cellulases, mannanases, xylanases and pectinases. The complexes are also catalytically active, since it was possible to identify in gel enzymatic activity. In another stepe of the work, the secretome of the fungus obtained in commercial (Avicel, carboxymethylcellulose-CMC and oat spealt xylan) and agroindustrial (corn cob, soybean hull, banana and sugarcane bagasse, sugar) carbon sources was characterized by LC-MS / MS. The greatest diversity of proteins was identified in the secretome obtained from Avicel and corn cob, respectively. Several enzymes related to the degradation of lignocellulose were identified, which shows that the fungus is able to produce complete enzymatic systems specific to each of the main holocellulose fractions: cellulose, hemicelluloses and pectin. The secretomes obtained from agroindustrial residues were used to saccharify partially-delignified corn cob and sugarcane bagasse. The crude extracts released more sugars from the hydrolysis of corn cob, revealing a higher digestibility of this substrate when compared to the bagasse, which may be due to the lower lignin content observed after corn cob treatment. The secretomes allowed the solubilization of a large part of the xylan present in the corn cob, with the release of xylobiose as the main hydrolysis product. C. byssicola strain was also evaluated for the production of pectinolytic enzymes when grown in medium containing orange peel as the sole carbon source. The fungus was able to secrete pectinases and pectate lyases. The characterization of the secretome by LC-MS / MS revealed a large diversity of enzymes acting on the main chain and side substituents. A partially purified fraction was characterized regarding the effect of temperature and pH, and the pectinase activity was maximal at 50 ° C and in the pH range between 4.5 and 6.0. These characteristics suggest the application of the enzyme for the treatment of fruit juices with low acidity. One of the partially purified enzymes was identified by LCMS / MS, and from this identification, the corresponding transcript was successfully cloned in Escherichia coli, and the expression step in Pichia pastoris is underway. All the results of this work reveal C. byssicola as a new source of holocellulolytic enzymes, which still needs to be explored.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Programa de Pós-graduação em Nutrição Humana, 2014. / Submitted by Flávia Renata Santos Gasparotto (flavia.gasparotto@gmail.com) on 2014-08-19T17:55:33Z No. of bitstreams: 1 2014_GrazielleGebrimSantos.pdf: 1619726 bytes, checksum: 0ac8d9626c399d548e42280c2b323a27 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-08-20T13:54:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_GrazielleGebrimSantos.pdf: 1619726 bytes, checksum: 0ac8d9626c399d548e42280c2b323a27 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-20T13:54:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_GrazielleGebrimSantos.pdf: 1619726 bytes, checksum: 0ac8d9626c399d548e42280c2b323a27 (MD5) / O tomate industrial destina-se à produção de derivados, como extratos, polpas, molhos e conservas de tomate sem pele. A indústria de processamento de tomates no Brasil apresentou um grande crescimento a partir da década de 1970. O Brasil figura entre os dez maiores produtores de tomate industrial do mundo. A cultura do tomate é afetada por um grande número de doenças causadas por fungos e bactérias. Entre os fungos produtores de toxinas que acometem os tomates industriais destacam-se os do gênero Alternaria. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a qualidade físico-química, microbiológica e a ocorrência de micotoxinas de Alternaria alternata em derivados de tomate e em tomates frescos. Derivados de tomate de três marcas (codificadas como A, B, C) e três tipos (extrato, polpa, catchup) foram adquiridos no comércio local do Distrito Federal. Frutos de tomate foram obtidos em uma indústria de processamento do Estado de Goiás e levados para o Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças para realizar o levantamento da ocorrência de fungos. Os derivados de tomate foram avaliados quanto às características físicas e químicas: teor de água, sólidos totais, sólidos solúveis, pH e acidez titulável. Avaliou-se também a ocorrência de matéria estranha, sujidades, larvas e parasitos, bem como a qualidade da matéria-prima por meio da contagem de fungos filamentosos (Howard) e a adequação, quanto aos parâmetros microbiológicos, à legislação vigente. Os tomates com ocorrência natural de A. alternata e os derivados de tomate foram avaliados quanto à ocorrência das micotoxinas alternariol (AOH) e alternariol monometil éter (AME) por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Quanto aos parâmetros físico-químicos, a polpa da marca A apresentou teores de sólidos solúveis inferiores a 6% (mínimo estabelecido pela legislação brasileira). Houve diferença significativa (p<0,001) entre todas as marcas de catchup e polpa de tomate avaliadas em relação a teor de água, sólidos totais, sólidos solúveis, pH e acidez titulável. Amostras de catchup da marca C apresentaram os menores teores de sólidos totais (24,28 ± 0,48 g/100g) e sólidos solúveis (27,32 ± 0,12 ºBrix), enquanto a marca A apresentou os maiores (sólidos totais: 30,96 ± 0,30 g/100g e sólidos solúveis: 32,47 ± 0,10 ºBrix). Em relação ao extrato de tomate, não foram observadas diferenças significativas quanto ao teor de água, sólidos totais e acidez titulável. Todos os extratos apresentaram teor de sólidos totais inferior ao mínimo (18%) estabelecido pela legislação vigente. Dos produtos avaliados apenas a marca B de extrato de tomate apresentou ausência de sujidades, larvas e parasitos. Nas demais amostras foram encontrados fragmentos de inseto, pelos de rato e ácaros. Pelos de ratos foram encontrados em amostras de polpa de tomate e extrato de tomate, já fragmentos de insetos foram identificados em todos os produtos de todas as marcas, exceto no extrato da marca B. Apenas o catchup da marca C e a polpa da marca A apresentaram ácaros. A legislação brasileira estabelece, para produtos de tomate, a ausência de sujidades, parasitos e larvas e a ausência de pelos de roedores com base na RDC nº 175 de 2003. Em relação à contagem de filamentos micelianos pelo método Howard todos os produtos avaliados se mostraram adequados, porém o extrato de tomate da marca B apresentou contagem de 12,88 ± 2,04%, o que pode indicar a presença de 1,2% de matéria-prima deteriorada (tomates com mofo). Quanto as análises microbiológicas, todas as amostras avaliadas apresentaram ausência de Salmonella sp. por 25 g, contagem de coliformes a 45 ºC inferior a 3 NMP/g e estafilococos coagulase positiva inferior a 10 UFC/g. Nas amostras de polpa e extrato de tomate de todas as marcas não foram identificados níveis detectáveis das micotoxinas. Nas amostras de catchup da marca A foram encontrados teores de AOH variando de 1,22 a 8,45 μg/g e em amostras de tomates naturalmente contaminadas com A. alternata os teores de AOH variaram de 15,98 a 18,18 μg/g. A micotoxina AME foi identificada apenas em uma amostra de 8 catchup em sache da marca C. Concluiu-se que a maioria dos concentrados de tomate está em desacordo com a legislação vigente quanto ao teor de sólidos totais, sólidos solúveis e apresentam fragmentos de inseto e pelos de ratos. Porém, estão livres dos principais microrganismos patogênicos. Micotoxinas de A. alternata foram identificadas apenas no produto catchup e em duas amostras de frutos tomate naturalmente contaminados com esse fungo. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Processing tomatoes are intended for the production of tomato derivatives such as pulps, sauces and canned peeled tomatoes. The tomato processing industry had a great increase from the 1970s in Brazil. The country is among the ten largest processing tomato producers of in the world. Many diseases caused by fungi and bacteria are reported affecting this crop. Species of the genus Alternaria are among the most important toxin-producing fungi attacking processing tomatoes. The objective of the present work was to evaluate the physicochemical and microbiological quality as well as the occurrence of toxins produced by Alternaria alternata in tomato products and in fresh tomato fruits. Tomato products from three distinct brands (codified as A, B, and C) and three processing tomato items (extract, pulp, and ketchup) were obtained in the Federal District of Brasilia local market. Fruits were obtained from a processing industry in the State of Goiás and taken to the Plant Pathology Laboratory at Embrapa Vegetable Crops to confirm the presence of fungal infection. Tomato products were evaluated for the following physical and chemical characteristics: water content, total solids, soluble solids, pH, and titratable acidity. Strange materials, dirtiness, larvae and parasites were also evaluated, as well as the raw material quality by counting filamentous fungi (Howard). The adequacy for microbiological parameters, according to legislation was also assessed. Tomato fruits with natural occurrence of A. alternata and tomato derivatives were evaluated via High Performance Liquid Chromatography for the occurrence of two toxins: alternariol (AOH) and alternariol monomethyl ether (AME). The pulp of brand “A” presented soluble solids content lower than 6% (the minimum established by the Brazilian legislation). Significant differences (p<0,001) were detected among all ketchup and pulp samples evaluated for water content, total solids, soluble solids, pH and titratable acidity. Ketchup samples of the brand “C” had the lowest contents of total solids (24.28 ± 0.48 g/100g) and soluble solids (27.32 ± 0.12 ºBrix), whereas the brand “A” displayed the highest values for total solids (30.96 ± 0.30 g/100g) and soluble solids (32.47 ± 0.10 ºBrix). No significant differences were observed in relation to water content, total solids and titratable acidity in all evaluated tomato extracts. However, all tomato extracts had total solids content lower than the minimum (18%) established by the current legislation. From all products analyzed, brand “B” was the only extract that did not present dirtiness, larvae, and parasites. In the other samples, fragments of insects, rodent’s hair, and mites were found. Rodent hairs were found in samples of pulp and in extract samples, but insect fragments were identified in all products of all brands, except in brand B extract. Mites were detected only in the brand “C” Ketchup and in the brand “A” pulp. The Brazilian legislation establishes the absence of dirt, parasites and larvae and the absence of rodent hairs in tomatoes products, according to the RDC#175 (from 2003). Regarding the counting of mycelium filaments by the Howard method, all products evaluated are adequate; however the B brand extract presented counting of 12,88 ± 2,04%, which may indicate the presence of up to 1.2% of deteriorated raw material (moldy tomatoes). Salmonella (25 g samples) coliforms (counting at 45oC lower than 3 NMP/g) and positive coagulase staphylococcus (lower than 10 UFC/g) were not found is all evaluated processing items. Detectable levels of mycotoxins were not identified in the samples of pulp and extract of all brands. Contents of AOH in the samples of brand “A” ketchup ranged from 1.22 to 8.45 μg/g. In tomato fruit samples naturally contaminated with A. alternata the AOH contents ranged from 15.98 to 18.8 μg/g. AME toxin was identified only in one ketchup (sachet) sample of the brand “C”. Based on our results, the majority of the tomato concentrates were not in accordance with the current Brazilian legislation regarding their total solids content and soluble solids as well as in relation to the presence of insect fragments and rodent hairs. Alternaria alternaria toxins were identified only in ketchup and in two samples of tomato fruits naturally contaminated by this fungus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2011-03-18T17:59:44Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-19T01:01:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-19T01:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliavonGalMilanezi.pdf: 2529712 bytes, checksum: ea3fce7f0a6357dbc0a6e13f6705d142 (MD5) / A holocelulose é o componente mais abundante da biomassa vegetal e é composto principalmente por celulose, hemicelulose e pectina. O bagaço de cana é o maior resíduo da agroindústria brasileira e é uma fonte de carbono economicamente viável para microrganismos produzirem enzimas holocelulolíticas de aplicação industrial. Os fungos filamentosos são eficientes produtores de xilanases, e suas enzimas têm sido utilizadas em todo o mundo em processos industriais. No presente estudo, uma xilanase (Xyl) do fungo Aspergillus niger crescido sobre bagaço de cana foi purificada e caracterizada visando a sua aplicação industrial. A curva de indução enzimática do fungo indicou alta atividade xilanolítica a partir do segundo dia, mantendo-se constante ao longo de 50 dias. A enzima teve sua maior atividade a 50°C e pH 4,5. A meia-vida aumentou 2,3 vezes quando Xyl foi incubada com tampão acetato de sódio pH 4,5. Estes resultados apontam para a possibilidade de aproveitamento desta xilanase na indústria têxtil, na panificação e em biorefinarias. Diversos íons foram testados, mas nenhum foi capaz de estimular a atividade de Xyl. Dentre os modificadores químicos de aminoácidos, o NBS foi o maior inibidor da atividade de Xyl, sugerindo o envolvimento de L-triptofano na ligação ao substrato ou na catálise. O ?- mercaptoetanol e o L-triptofano foram os maiores ativadores da enzima. Os valores de KM e Vmax encontrados foram de 47,08 mg/mL e 3,02 UI/mL, respectivamente, e há indícios de que Xyl dependa das ramificações da xilana para se ancorar ao substrato. A massa molecular estimada foi de cerca de 33 kDa, e o perfil bidimensional revelou a presença de isoformas ou enzimas múltiplas na amostra. Os resultados da espectrometria de massa sugerem que as xilanases são conservadas entre as espécies do gênero Aspergillus. As imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram a degradação do bagaço de cana por enzimas de A. niger. As imagens de microscopia de força atômica sugerem que Xyl pertença à família GH10, mas sua atividade holocelulolítica residual a classificam com GH11. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Holocelulose is the most abundant component of biomass and it is basically composed of cellulose, hemicellulose and pectin. Sugar cane bagasse is the major waste of brazilian agroindustry and it is a cheap carbon source for microorganisms to produce holocellulolytic enzymes of industrial application. Filamentous fungi are good xylanase producers and their enzymes have been used in industrial processes all over the world. In this study a xylanase (Xyl) produced by the fungus Aspergillus niger over sugar cane bagasse was purified and characterized aiming its biotechnological application. The fungus produces higher amounts of xylanolytic activity from the second day on, and this activity remains relatively constant up to the 50th day. The enzyme presented the best activity at 50°C and pH 4,5. The half-life increased 2,3 times when Xyl was incubated with sodium acetate buffer pH 4,5. The results point out to the application of this enzyme in the textile industry, bakery and biorefineries. None of the tested ions was capable of increasing Xyl activity. NBS was Xyl major inhibitor, suggesting that Ltryptophan is involved in the substrate linkage or catalysis. β- mercaptoethanol and L-tryptophan were the best enzyme activators. The KM and Vmax values were 47,08 mg/mL and 3,02 UI/mL, respectively, and it is possible that Xyl depends on xylan side chains to stabilize over the substrate structure. The estimated molecular mass was about 33 kDa, and the 2Delectrophoresis analysis suggested the existence of multiple forms of xylanases. The mass spectrometry results suggest that the xylanases are conserved among the Aspergillus species. The electron scanning microscopy images show the degradation of sugar cane bagasse by A. niger enzymes. The atomic force microscopy images suggest that Xyl belongs to GH10, but its residual holocelulolytic activity classifies Xyl as a member of GH11 family.

Orientadores : Ricardo Sadir e Waldemiro Sgarbieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Balseca_EduardoRoman_M.pdf: 3722827 bytes, checksum: d8c9cbc57624cc4a97814a71a036c657 (MD5) Previous issue date: 1972 / Resumo: A presença da biotina, vitamina do complexo B, em correntes a quânticas e a dificuldade de obter biotina com atividades biológicas pela síntese química, motivaram a busca de novos métodos. Atualmente se obtém biotina por fermentação, aproveitando a faculdade de biossíntese do Esporoboromyces. Nesta investigação bibliográfica se analisa a possibilidade de produzir biotina em lagoas facultativos que recebem os resíduos de indústrias de batatas que são estabilizados por oxidação biológica e utilizados como meios nutrientes. O grupo E. Coli, e em especial Aerobacter aerogenes, tem a faculdade de sintetizar biotina. Nesse processo estão associadas às algas (Chlorella vulgaris) responsáveis pela fotossíntese o as bactérias (Tiocapsa floridana) que consomem o armazenam biotina e, além disso, permitem o desenvolvimento das algas. O tratamento é feito principalmente em lagoas facultativas em que se desenvolvem organismos tanto aeróbios e anaeróbios. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. / Abstract: The presence of biotin in lakes, rivers and sea and the difficulty in obtaining biologically active biotin by chemical synthesis motivated the search for new methods of synthesis. At present biotin can be obtained by fermentation with Esporoboromyces. In this bibliographic investigation the possibility of production of biotin in facultative lagoons receiving potatoes industrial waste is considered. The wastes are first stabilized by oxidation and then fermented by various microorganisms with production of biotin and other vitamins of the B complex. The Escherichia Coli group and specially Aerobacter aerogenes produce biotin and in this process they arc in association with the alga Chlorella vulgaris and the purple sulfur bacterium Tiocapsa floridana that stores most of the vitamin (biotin) produced in their cells. Note: The complete abstract is available with the full electronic document. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador : João Lucio de Azevedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseCarlosda_M.pdf: 1672929 bytes, checksum: e76fae08bfa6b9fd52e8a22a074db432 (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: o presente trabalho foi conduzido com a f1nali-dade de se estudar através do método de Foster, a seleçao de Aspergillus niger, para produção de ácidos, utilizando radiação gama.Também foi estudada a produção de ácidos em meio líquido para confirmação do método de Foster na seleção de melhores produtores.Por fim, procurou-se conhecer possível efeito da radiação gama sobre a instabilidade da linhagem utilizada. Para isso, foi empregada uma linhagem industrial, usada na produção de ácido cítrico. Foram feitos três ciclos de seleção, sendo que cada população foi analisada quant1tativamente quanto ao caráter produção de ácidos, através do fator índice ácido. Dos experimentos realizados, os seguintes resultados a conclusões foram obtidos: a) - Com uma dose de radiação gama de 80 Kr obteve-se 1,61% de sobreviventes. A curva de sobrevivência indicou a existência de conídios binucleados e conídios não irradiados apresentaram porcentagem de sobrevivência inferior a 100%. Por esses resulta-dos foi possível concluir-se que a dose acima citada se presta bem a indução de mutações em A. niger e que a baixa sobrevivência nos conídios pode ser atribuída a existência de mutação letal em um dos núcleos conídiais. b) - Foi encontrada uma correlação negativa entre o índice Ac1do e o diâmetro das colônias em todas as populações irradiadas, o que permitiu concluir que a seleção para produção de ácidos através de altos índices ácidos pode-se selecionar também colônias de crescimento menor. c) - Houve uma diferença estatisticamente significante entre colônias produzidas a partir de conídios irradiados quando comparados com colônias vindas de conídios não irradiados com relação ao índice ácido. A média obtida para o índice ácido aumentou após cada irradiação sendo que o maior valor foi obtido após a terceira irradiação. Os resultados permitiram concluir que a radiação gama como esperado provocou efeitos provavelmente genéticos na linhagem empregada. A população irradiada mostrou maior variabilidade do que a população não irradiada com relação ao Índice ácido, mostrando que irradiação é um efetivo processo de aumento de variabilidade, indispensável para posterior seleção. Conclui-se também através do progresso obtido pela seleção de isolados mais produtivos com relação ao Índice ácido, que o método de seleção empregado foi eficiente. Finalmente o aumento geral no valor de Índice ácido após irradiação foi atribuído a existência de conídios heterocarióticos contendo um núcleo normal e outro contendo um recessivo letal. d) - Não houve correlação entre os valores de Índice ácido em meio de Foster e os resultados obtidos em meio líquido de fermentação. Esses resultados permitem concluir que seleção para Índice ácido em meio de Foster não é condição Sine qua non para que alinhagem tenha alta produtividade em condições industriais. e) - Ensaio de estabilidade das linhagens irradiadas através do número de setores, revelou que a linha-gem que sofreu a primeira irradiação mostrou-se mais estável do que as com segunda e terceira irradiação. Concluiu-se portanto que a obtenção de linhagens estáveis e portanto de interesse industrial poderá ser facilmente conseguida com doses menores de radiação, do que com múltiplas irradiações ou mesmo altas doses do irradiação, embora a explica-ção do fenômeno ainda permaneça obscura / Mestrado / Mestre em Biologia

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Luiz Juliano / Banca: Ana Lúcia Barretto Penna / Resumo: Proteases constituem um dos grupos mais importantes de enzimas industriais, sendo o setor alimentício um dos que mais as utilizam, pois atuam sobre proteínas. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e caracterizar a protease do fungo termofílico Thermoascus aurantiacus. A produção foi em fermentação em estado sólido e o extrato enzimático bruto foi caracterizado. A atividade de protease, no extrato enzimático bruto, foi inibida por ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (60,61%) e por fluoreto fenimetilsulfonil (PMSF) (56,37%) e foi levemente estimulada por Ca2+. Seu padrão de ação hidrolítico sobre a caseína foi estudado por UREA-PAGE, mostrando diferença significativa em relação a uma renina microbiana recombinante. O extrato enzimático bruto foi purificado através de precipitação com álcool a 72% seguido de cromatografias em resinas Sephadex G75 e Sephacryl S100. Apresentou rendimento de 0,4% e um fator de purificação de 80 vezes. A massa molecular de 24,5 KDa foi estimada por SDS-PAGE. A protease pura apresentou inibição somente por EDTA (96,70%) e ativação por sulfato ferroso, revelando-se uma metaloprotease ativada por ferro. O pH ótimo foi 5,5; a temperatura ótima foi 75°C e foi termoestável a 65°C por 1 hora retendo mais de 70% de atividade original. Apresentou aumento de 151,0% de atividade na presença de Tween-20 e, através dos estudos de cinética enzimática, hidrolisou melhor a caseína do que a azocaseína. / Abstract: Proteases are a very important group of industrial enzymes, and are most employed in the food segment due to their action on proteins. This work had the aim to produce, purify and characterize the protease from the thermophilic Thermoascus aurantiacus. The production was carried out in solid state fermentation and the crude enzymatic extract was characterized. The proteolytic activity, in the crude extract, was inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (60.61%) and by phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) (56.37%) and was slightly stimulated by Ca2+. Its hydrolytic action profile on casein was studied by UREA-PAGE, showing significant difference when compared to a recombinant microbial rennet. The crude enzymatic extract was purified through precipitation with ethanol at 72% followed by cromatographies in columns of Sephadex G75 and Sephacryl S100. It was purified 80-fold and exhibited recovery of total activity of 0.4%. SDS-PAGE analysis indicated an estimated molecular mass of 24.5 KDa. The purified protease was only inhibited by EDTA (96.70%) and stimulated by Fe2+ revealing to be a metalloprotease activated by iron. The optimum pH was 5.5, optimum temperature was 75°C and it was thermostable at 65°C for 1 hour maintaining more then 70% of original activity. It showed increase of 151.0% in activity in the presence of Tween-20 and, through enzyme kinetics studies, better hydrolyzed casein than azocasein. / Mestre

Resumo: A xilanase de Thermoascus aurantiacus codificada pelo gene xynA é uma enzima termofílica com uma promissora aplicação industrial. Neste trabalho, foi realizada a clonagem desse gene, que foi isolado pela técnica de RT-PCR, seguido de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Realizada a caracterização da enzima nativa no extrato bruto do fungo filamentoso assim como da enzima recombinante antes e depois da purificação parcial, a qual foi realizada pelo processo de troca iônica. A atividade ótima das enzimas foi em pH 5,0 e as mesmas foram estáveis diante de ampla faixa de pH (3,5- 10,5, por 24h). Em relação à temperatura ótima e termoestabilidade houve algumas diferenças entre as três condições da xilanase. A xilanase nativa apresentou-se mais ativa a 75°C sendo estável na faixa de 35°C a 75°C após 1 hora de incubação, a xilanase recombinante antes e depois do processo de purificação apresentou temperatura ótima em 60°C, no entanto antes da purificação permaneceu estável entre 35°C e 80°C, e após a purificação entre 35°C e 65°C, em ambos os casos após a incubação por 1 hora. Esse foi o primeiro relato de expressão do gene xynA em P. pastoris. Com a purificação da enzima recombinante serão viabilizados estudos estruturais que requerem grandes quantidades da enzima. Além disso as características observadas de XynA em nossas análises mostraram-se bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico. Nossos dados permitirão então outros estudos para adequação a aplicação dessa xilanase em processos industriais / Abstract: A xilanase de Thermoascus aurantiacus codificada pelo gene xynA é uma enzima termofílica com uma promissora aplicação industrial. Neste trabalho, foi realizada a clonagem desse gene, que foi isolado pela técnica de RT-PCR, seguido de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Realizada a caracterização da enzima nativa no extrato bruto do fungo filamentoso assim como da enzima recombinante antes e depois da purificação parcial, a qual foi realizada pelo processo de troca iônica. A atividade ótima das enzimas foi em pH 5,0 e as mesmas foram estáveis diante de ampla faixa de pH (3,5- 10,5, por 24h). Em relação à temperatura ótima e termoestabilidade houve algumas diferenças entre as três condições da xilanase. A xilanase nativa apresentou-se mais ativa a 75°C sendo estável na faixa de 35°C a 75°C após 1 hora de incubação, a xilanase recombinante antes e depois do processo de purificação apresentou temperatura ótima em 60°C, no entanto antes da purificação permaneceu estável entre 35°C e 80°C, e após a purificação entre 35°C e 65°C, em ambos os casos após a incubação por 1 hora. Esse foi o primeiro relato de expressão do gene xynA em P. pastoris. Com a purificação da enzima recombinante serão viabilizados estudos estruturais que requerem grandes quantidades da enzima. Além disso as características observadas de XynA em nossas análises mostraram-se bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico. Nossos dados permitirão então outros estudos para adequação a aplicação dessa xilanase em processos industriais / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fernando Araripe Gonçalves Torres / Banca: Fabio Squina / Banca: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Mestre