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Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introdução: Fusarium spp. representa um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil e no mundo. Nos seres humanos pode causar diversos tipos de doenças, que vão desde infecções superficiais em pacientes imunocompetentes, até infecções invasivas e disseminadas como as fungemias em pacientes imunocomprometidos. Objetivos: (1) Avaliar de forma descritiva as características fenotípicas de 157 cepas de Fusarium spp. isoladas de episódios de infecções em humanos e coletas ambientais; (2) Descrever a prevalência de diferentes espécies de Fusarium encontradas nestas amostras. (3) Definir o perfil de susceptibilidade dessas cepas utilizando o método de microdiluição em caldo descrito no documento M38-A2 publicado pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), frente aos antifúngicos Anfotericina B, Fluconazol, Itraconazol, 5-fluorocitosina e Voriconazol. Material e Métodos: Foram avaliadas 126 cepas clínicas e 31 cepas ambientais de Fusarium spp. que foram coletadas entre os anos de 1996 e 2008. Estas cepas estavam armazenadas no banco de microrganismos do Laboratório Especial de Micologia na Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Os isolados foram identificados por análise das características macro- e micromorfológicas, seguindo a chave de identificação publicada por De Hoog et al, (2000). A avaliação da susceptibilidade in vitro dos isolados foi realizada pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com as normas de padronização publicadas no documento M38-A2 do CSLI (2008). Foram realizadas leituras de 24, 48 e 72h de incubação. Resultados: Analisou-se um total de 157 amostras clínicas e ambientais, incluindo 143 cepas do complexo Fusarium solani (91,1%), 07 do complexo Fusarium dimerum (4,5%), 04 do complexo Fusarium incarnatum (2,5%), 02 de Fusarium verticillioides (1,3%) e 01 do complexo Fusarium oxysporum (0,6%). A maioria dos isolados (98 a 100%) apresentou baixa ou nula susceptibilidade a fluconazol, itraconazol e 5-fluorocitosina, independente dos períodos de incubação dos ensaios. Para anfotericina B e voriconazol, foi documentado aumento substancial no percentual de cepas inibidas em concentrações de droga superiores a 2,0µg/mL entre as leituras realizadas após 24 versus leituras realizadas após 48h/72h de incubação. Em relação aos ensaios de susceptibilidade aos antifúngicos observamos que para voriconazol leituras realizadas após 24h de incubação apresentam maior correlação com as taxas de sucesso terapêutico descritas em séries abertas tratadas com este medicamento. Conclusões: Verificamos que há predomínio de cepas do complexo Fusarium solani tanto nas amostras de micoses superficiais como nas amostras de micoses invasivas. Finalmente, tendo em vista os dados do perfil de susceptibilidade obtidos in vitro, anfotericina B apresenta maior atividade que voriconazol contra as cepas do complexo Fusarium solani e o oposto é observado entre as cepas de Fusarium não-solani avaliadas neste estudo. / Introduction: Fusarium spp. represents a phytopathogen of great economic importance in Brazil and worldwide. In humans it can cause different forms of diseases, ranging from superficial infections in immunocompetent patients to invasive and disseminated infections such as fungemia in immunocompromised patients. Objectives: (1) To identify phenotypic characteristics of 157 strains of Fusarium spp. recovered from human infections episodes and environmental samples, (2) To describe the prevalence of different species of Fusarium found in these samples. (3) To define the susceptibility pattern of Fusarium spp. strains using the broth microdilution method described in the document M38-A2 (2008) published by the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) against amphotericin B, fluconazole, itraconazole, 5-fluorocytosine and voriconazole. Methods: We analyzed 126 clinical strains and 31 environmental strains of Fusarium spp. which were collected from 1996 and 2008. The strains were stored at -80ºC in the fungi culture collection of the Laboratório Especial de Micologia of Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. The isolates were identified by macro and micromorphological characteristics analysis based on the identification keys published by De Hoog et al, (2000). The evaluation of in vitro susceptibility of the isolates was performed by the microdilution method according to standardization CLSI M38-A2 document. Visual readings were performed after 24, 48 and 72 hours of incubation. Results: We analyzed a total of 157 clinical and environmental samples, including 143 (91.1%) of Fusarium solani complex strains, 07 (4.5%) of Fusarium dimerum complex, 04 (2.5%) of Fusarium incarnatum complex, 02 (1.3%) of Fusarium verticillioides and 01 (0.6%) of the Fusarium oxysporum complex. Most isolates (98 to 100%) showed low or zero susceptibility to fluconazole, itraconazole and 5- fluorocytosine, regardless of the periods of incubation of the tests. For amphotericin B and voriconazole, it was observed a substantial increase in the percentage of strains inhibited at drugs concentrations higher than 2.0µg/mL between the readings taken after 24 versus readings taken after 48h/72h of incubation. In the antifungal susceptibility tests with amphotericin B and voriconazole we observed that readings taken after 24 hours of incubation generate results more similar to those described in open series of therapeutic success rates treated with this medicine. Conclusions: We verified that there is a predominance of Fusarium solani complex strains in both samples of superficial and invasive mycoses. Finally, the data obtained by in vitro susceptibility showed that amphotericin B is more effective than voriconazole against the strains of the Fusarium solani complex and the opposite is observed for the strains of Fusarium non-solani evaluated in this study. / CNPq: 135219-2006-0. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

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Os fungos fitopatogênicos pertencentes ao gênero Fusarium são conhecidos causadores de doenças de plantas em diversos hospedeiros. Dentre os quais se destaca o tomateiro, atacado pelas três raças conhecidas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), causadoras da murcha vascular. Para o controle dessa doença, o emprego de microrganismos, como os isolados antagonistas de Trichoderma sp. pode ser uma alternativa ao emprego de agroquímicos. No presente trabalho foi avaliada a patogenicidade de dez isolados de Fol em cultivares diferenciadoras de tomateiro, sendo que apenas quatro se mostraram patogênicos a cultivar suscetível, e nenhum deles foi diagnosticado como pertencente à raça 3. Os resultados obtidos nos testes de confronto direto com os isolados de Trichoderma sp. apresentaram alta variabilidade em relação à capacidade micoparasítica, com os melhores resultados de sobreposição para os isolados T3, T8 e T17. Nestes casos foi observada evidência de sobreposição da colônia do hospedeiro para pelo menos seis dos nove isolados antagonistas. Em relação à capacidade inibitória destes isolados, os resultados de maior inibição de crescimento da colônia do fitopatógeno foram obtidos para os isolados T2 e T3. A linhagem 34970 de Fol foi a mais resistente às ações antagonistas dos isolados de Trichoderma sp., e o isolado TO 11 sofreu as maiores médias de inibição. Em teste de produção de metabólitos voláteis somente os isolados Fusarium 23, Fusarium 27 e 34970 de Fol, foram inibidos após 120 horas de teste. No controle biológico da fusariose do tomateiro, provocada pelo isolado TO 245 de Fol, as plântulas tratadas com os isolados T6 e T17 de Trichoderma sp. apresentaram menor incidência de doença, com notas iguais a 1,25 e 0,75 respectivamente em comparação a 1,87 do grupo controle, de acordo com a escala de severidade de doença de Vakalounakis et al. (2004). Os tratamentos com os isolados T6 e T17 em substrato contaminado com o isolado 1205/2 de Fol apresentaram valor de 0,50 e 0,38, de acordo com a escala, em comparação com 0,50 do tratamento controle. As médias de alturas, comprimento e peso seco das raízes não apresentaram diferença estatística para nenhum dos tratamentos, porém o peso seco da parte aérea foi significativamente maior para as plantas tratadas com o isolado T6 em substrato infestado pelo isolado 1205/2 de Fol. Todos os isolados patogênicos pareados com as linhagens padrão dos grupos de compatibilidade vegetativa apresentaram sinais de heterocariose com a linhagem padrão 34970 correspondente ao GCV 0030, indicando uma possível similaridade genética entre os isolados utilizados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-16T11:38:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carolina Fialho Pereira.pdf: 2001718 bytes, checksum: 632dd2c23a45df8ec1d67dd4cb96810f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-16T11:38:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carolina Fialho Pereira.pdf: 2001718 bytes, checksum: 632dd2c23a45df8ec1d67dd4cb96810f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Phytopathogenic fungi belonging to Fusarium genera are known as the agents responsible of many diseases in plants. Among these, tomato plants are attacked by the 3 races of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), which causes vascular wilt. To control this disease, many techniques have been employed, mostly the use of resistant cultivars and chemical fungicides. Alternatively, the use of antagonistic microorganisms for biological control and decrease of inoculum of plant pathogens by introducing mass production of Trichoderma sp. has been studied for many years. In this study we evaluated the pathogenicity of 10 isolates of Fol on differential cultivars of tomato, where only four of ten isolates proved pathogenic to susceptible cultivar to this disease and none of which was diagnosed as belonging to race 3. The results obtained in tests of direct confrontation with Trichoderma sp. isolates showed high variability in relation to mycoparasitism, with the best results for agressiveness the isolates T3, T8 and T17. In these cases it was observed evidence of growth of the host colony for at least six of nine isolates tested. Regarding the inhibitory effect of these isolates, the results of greater inhibition of colony growth of plant pathogenic fungus were obtained for the isolated T3 and T2. The strain 34970 of Fol was the least inhibited by isolates of Trichoderma sp., and isolated TO 11 showed the highest average of inhibition. With regards to the production of volatile metabolites, only the isolates Fusarium 23, Fusarium 27 and 34970 of Fol were inhibited after 120 hours of testing. In the biological control of Fusarium wilt of tomato caused by isolate TO 245, seedlings treated with isolates T6 and T17 of Trichoderma sp. showed a lower incidence of disease, with 1.25 and 0.75 respectively compared to 1.87 of the control group in accordance with scale of severity of disease by Vakalounakis et al. (2004). The treatments with the isolates T6 and T17 in substrate inoculated with isolate 1205/2 showed values of 0.5 and 0.375 according to the scale, compared with 0.5 in the control treatment without the presence of Trichoderma sp. The average height, length and dry weight of roots did not differ significantly for any treatment. The dry weight of shoot was significantly higher for plants treated with isolate T6 in substrate infested by the isolated 1205/2. All the pathogenic isolates of Fol were paired with the standard strains of vegetative compatibility groups and showed signs of heterokaryosis with the standard strain 34970 corresponding to VCG 0030, indicating a possible genetic similarity among the isolates used.

A maior preocupação com micotoxinas em grãos de milho tem ganhado importância devido às podridões da espiga causadas por Fusarium spp. Este estudo teve como objetivos: 1) levantar a incidência de Fusarium spp. e determinar níveis de fumonisinas em grãos de milho (safras 2009 e 2010) em municípios do estado do Rio Grande do Sul; 2) identificar as espécies de Fusarium associadas com os grãos; 3) determinar o potencial toxigênico dos isolados por método moleculare e 4) avaliar características fisiológias e patogênicas em uma seleção de 12 isolados. Vinte e nove amostras de grãos foram avaliadas quanto à incidência de espécies dos complexos Gibberella fujikuroi e G. zeae, além de fumonisina (FB1 e FB2), por HPLC. Foi observada uma dominância de espécies do complexo G. fujikuroi (96%), em comparação à G. zeae (18%). Análises químicas mostraram a presença de FB1 em 27/29 amostras (média = 1,38 μg.g-1) e FB2 em 13/29 amostras, (média de 0,42 μg.g- 1). Foram obtidos 304 isolados monospóricos em quatro populações (regional 2009; regional 2010; Cruz Alta e Veranópolis), os quais foram identificados com base na morfologia e PCR usando primers específicos para G. fujikuroi (F. verticillioides, F. subglutinans e F. proliferatum) e G. zeae (F. graminearum = Fg). PCR foi usada para detectar o gene FUM+, preditivo da síntese de fumonisina e os genes Tri3 e Tri12, preditivos dos genótipos tricotecenos: 3-ADON, 15-ADON e NIV. F. verticillioides foi encontrada em maior prevalência (86,8%), seguido de F. graminearum (6,9%), F. subglutinans (1,3%) e F. proliferatum (0,7%). Em 30/264 isolados de F. verticillioides o gene FUM+ não foi detectado. Em 12 isolados de F. graminearum houve dominância do genótipo NIV (8/12), seguido de 15-ADON (3/12) e 3-ADON (1/12). Todos os isolados selecionados para avaliação das características fisiológicas e patogênicas mostraram diferenças na taxa de crescimento micelial (TCM) e sensibilidade ao tebuconazole. Os isolados de F. verticillioides apresentaram os menores valores de TCM e mais alta sensibilidade ao fungicida, seguido dos isolados Fg NIV e Fg 15-ADON. Todos foram eficientes na infecção das sementes com efeitos negativos na germinação e emergência de plântulas. Ambas as espécies colonizaram o colmo de plantas de 20 dias, com destaque para um isolado Fg NIV. A análise multivariada permitiu identificar três grupos distintos de isolados. / The increasing concern to mycotoxins in maize kernels is related to a frequent occurrence of epidemics of ear rot of corn caused by Fusarium spp in Brazil. This study aimed to: 1) assess the incidence of Fusarium spp. and determine fumonisin levels in maize samples (harvest seasons 2009 and 2010) from several municipalities of the Rio Grande do Sul state, Brazil; 2) identify Fusarium species associated with the maize kernels; 3) determine the toxigenic potential of isolates using molecular markers; and 4) evaluate the physiological and pathogenic characteristics in a group 12 selected isolates. Twenty-nine commercial grain samples were evaluated for the incidence of Gibberella fujikuroi and G. zeae species complex, and fumonisin (FB1 and FB2) levels by using HPLC. We observed a dominance of G. fujikuroi (96%) over G. zeae (18%) species. Chemical analysis showed the presence of FB1 in 27/29 samples (mean = 1,38 μg.g-1) and FB2 in 13/29 samples (mean 0,42 μg.g-1). A sample of 304 single-spore isolates was obtained and separated into four populations (regional 2009, regional 2010, Cruz Alta and Veranópolis), which were identified based on morphology and PCR using specific primers for three species of the G. fujikuroi complex (F. verticillioides, F. subglutinans and F. proliferatum) and G. zeae (F. graminearum sensu lato). PCR was also used to detect FUM+ gene, predictive of fumonisina synthesis and Tri3 and Tri12 genes, predictive of three trichothecene genotypes: 3-ADON, 15-ADON and NIV. F. verticillioides was found in higher prevalence (86,8%), followed by F. graminearum (6.9%), F. subglutinans (1.3%) and F. proliferatum (0,7%). FUM+ gene was not detected in 30/264 F. verticillioides isolates. For the 12 F. graminearum isolates, NIV was the dominant genotype (8/12), followed by 15-ADON (3/12) and 3-ADON (1/12). All isolates selected for assessment of physiological and pathogenic characteristics showed differences in mycelial growth rate (MGR) and sensitivity to tebuconazole. All F. verticillioides isolates had the lowest MGR and a much higher sensitivity to the fungicide, followed by 15-ADON and NIV isolates. All isolates successfully infected and colonized the seeds, with negative effects on seed viability and seedling emergence. Both species colonized the stems of 20-days old plants using a toothpick inoculation method, and one F. graminearum NIV strain was the most aggressive. Multivariate analysis identified three distinct groups of isolates.