Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante. / MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) and DGDG (digalactosyldiacylglycerol) are the most abundant membrane lipids of the chloroplast. They are synthesized exclusively in the chloroplast envelope by the action of MGDG synthases (MGD1, MGD2 and MGD3) and DGDG synthases (DGD1 and DGD2). Galactolipids are known to be essential for the structure (and function) of the photosystems and for the biogenesis of thylakoids. In phosphate deprivation, galactolipids become a source of lipid for other cell membranes, outside the chloroplast. Based on a high throughput chemical screen, a new molecule called galvestine-1 has been identified and characterized as an inhibitor of MGDG synthases. Galvestine-1 competes with the binding of the diacylglycerol substrate to MGDs. This molecular tool can be used to disturb the system comprising all lipid biosynthesis reactions, conversions, and lipid trafficking, responsible for the membrane lipid steady state observed at the whole cell level, or membrane lipid homeostasis. Perturbation of the system occurs at the level of MGDG synthases. The aim of this thesis is to use the effect of galvestine-1 to identify new actors or new pathways involved in the control of lipid homeostasis in plant cells. To this purpose, I designed and performed a screening of a collection of EMS (ethyl methanesulfonate) mutants, in order to isolate galvestine-1-resistant mutants and to identify mutated genes conferring this resistance. Transcriptomic data (Affymetrix genome array genechip, ATH1) of Arabidopsis thaliana treated in the presence of galvestine-1 had been obtained prior to the PhD project. These data were used to identify genes whose expression varied and possibly involved in lipid homeostasis. Based on a complementary candidate gene approach, I focused on Ala10, a putative flippase, which gene is over-expressed after treatment with galvestine-1 and following phosphate deprivation. The purpose of this second part of this thesis is to understand the relationship between the expression of ALA10 and genes involved in galactolipid synthesis in plants.

Au cours de la reproduction sexuée chez les plantes supérieures, les grains de pollen adhérent aux stigmates, se réhydratent et produisent des tubes polliniques qui se développent à travers le tissu de transmission femelle afin d’assurer la fécondation. Les tubes polliniques sont des cellules dont la croissance est rapide et polarisée à l’apex du tube. Ils représentent de bons modèles pour étudier la dynamique de la croissance cellulaire. Les tubes polliniques sont aussi capables de percevoir des signaux de guidage et d’adhérer à la matrice extracellulaire du tissu femelle. Afin de comprendre le mécanisme cellulaire de la croissance et de l'adhésion du tube pollinique, deux approches différentes ont été utilisées. Premièrement, un criblage de 258 molécules a permis d’isoler deux composés qui perturbent in vitro la croissance des tubes polliniques de tabac, de tomate et d' Arabidopsis thaliana. Les effets d’un inhibiteur des monogalactosyldiacylglycérol synthases, la galvestine-1, ont également été étudiés sur la croissance des tubes. Nous avons montré que ces trois composés réduisent la longueur du tube pollinique et induisent des phénotypes anormaux de façon dose-dépendante. La germination du pollen était réduite avec les deux composés isolés du criblage. Ils ont également affecté la distribution des polymères de la paroi des tubes polliniques. Les composés ont perturbé la production de ROS, ont désorganisé la dynamique des filaments d'actine et de la protéine RIC4 suggérant qu'ils pourraient perturber le trafic de vésicules à l'extrémité du tube pollinique. Dans un second temps, nous avons mis au point une approche de déconstruction enzymatique d’une matrice enrichie en polysaccharides afin d’étudier les phénomènes d’adhésion in vitro des tubes polliniques. Ce test a été développé sur des plaques 96 puits pour les tubes polliniques d'A. thaliana, en utilisant différents extraits de parois cellulaires de fleurs et de feuilles d'A. thaliana comme matrice ou des pectines commerciales de citron avec différents degrés de méthylestérification. Les traitements avec une polygalacturonase et une endo-galactanase des pectines commerciales et de l'extrait de paroi cellulaire de feuilles ont totalement ou partiellement perturbé l'adhésion des tubes polliniques. Ces résultats montrent que les tubes polliniques d’A. thaliana sont capables d'adhérer à des pectines d'origines diverses (espèces et organes) et suggèrent que les chaînes d’homogalacturonanes, les chaînes latérales du rhamnogalacturonane-I, en particulier les galactanes, avec un poids moléculaire minimum seraient nécessaires à l'adhésion des tubes polliniques. / During plant sexual reproduction pollen grains land on the stigma, rehydrate and produce pollen tubes that grow through the female transmitting-tract tissue to assure a proper fertilization. Pollen tubes are fast tip-growing cells and represent a good model to study growth dynamics. Pollen tubes are able to perceive female guidance signals and to adhere to the extracellular matrix of the female transmitting tract. In order to improve our knowledge on the cell mechanisms implicated during pollen tube growth and adhesion, two different approaches have been used. First, 258 compounds were screened and two small compounds were isolated. They disrupted in vitro pollen tube growth of tobacco, tomato and Arabidopsis thaliana. The effects of an inhibitor of monogalactosyldiacylglycerol synthases, galvestine-1, on pollen tube growth were also studied. We showed that these 3 compounds reduced pollen tube length and induced abnormal phenotypes in a dose dependent manner. Pollen germination was significantly reduced with the two compounds isolated from the screen. They also affected cell wall material arrangement in pollen tube cell wall. The compounds modified ROS production and were able to disorganized actin filaments as well as the dynamic changes of the protein RIC4 suggesting that they might perturb vesicle trafficking at the pollen tube tip. Secondly, using a plant-made adhesion matrix in 96 –well plates, we studied the in vitro adhesion of A. thaliana pollen tubes. Different cell wall extracts from A. thaliana flowers and leaves or commercial lemon pectins with different degree of methylesterification were tested and the adhesive fractions were deconstructed by enzymatic treatments. Polygalacturonase or endo-galactanase treatments of commercial pectins and pectin-enriched cell wall extracts totally or partially disrupted pollen tube adhesion. Our results pointed out that A. thaliana pollen tubes are capable of adhering on pectins from diverse origins (species and organs) and suggested that homogalacturonan, the side chains of rhamnogalacturonana-I, especially galactans, as well as a minimum molecular weight may be necessary for pollen tube adhesion.

Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante.