Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-15Bitstream added on 2014-06-13T19:05:29Z : No. of bitstreams: 1 assaf_ss_dr_botfmvz.pdf: 407133 bytes, checksum: 8fe91af8256db3240cd15b87f06d8c5f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Uma variedade de fatores extrinsecos como ions organicos, tampoes, composicao atmosferica gasosa, aminoacidos, fatores de crescimento, vitaminas, a acao de proteinas e macromoleculas desconhecidas podem afetar a viabilidade embrionaria. A implantacao de um sistema artificial de manutencao e desenvolvimento embrionario que simule um ambiente compativel com o fisiologico ainda e o objetivo de diversos grupos de pesquisa. O tamponamento dos meios e dependente da composicao gasosa da atmosfera de cultivo e o desenvolvimento embrionario, principalmente na fase de cultivo, sofre com as variacoes de pH verificadas durante as manipulacoes realizadas fora da estufa. Os experimentos desenvolvidos tiveram como objetivo avaliar diferentes sistemas de tamponamento para os meios de cultivo, comparando-os entre si quanto a capacidade de proporcionarem maior estabilidade de pH aos embrioes produzidos in vitro. As modificacoes propostas na composicao dos meios de cultivo foram avaliadas em duas atmosferas gasosas. Um total de 3200 ovocitos foram maturados em gotas de 100 ÊL cobertas com oleo mineral por periodo de 24 horas, agrupados em numero de 20 ovocitos por gota de meio TCM-199 com sais de Hankfs (Sigma Aldrich.), acrescido de 0,5 Êg/mL de FSH e 0,03 UI/mL de LH, 10% SFB, 20mM HEPES e antibioticos. Apos a fertilizacao, os possiveis zigotos foram submetidos ao cultivo e distribuidos de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1: grupo controle com sistema tampao de bicarbonato de sodio do meio HTF Irvine Scientific. acrescido de aminoacidos; T2: meio SOFaa com sistema tampao composto de 25 mM de bicarbonato de sodio; T3: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 4 mM de HEPES e T4: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 12 mM de fosfato de sodio. Os embrioes dispostos nos / A variable interation of intrinsic and extrinsic factors such as organics ions, buffers, atmosphere composition, aminoacids, growth factors, vitamins, proteins and other unknown components may play an important role increasing the developmental potential of in vitro produced bovine embryos. The importance of the development of an artificial system to maintain embryo viability, similar and comparable with physiologic environment, has been the objective of several studies. Therefore, the majority of those studies that focus on culture media formulations were based on the physiology of in vivo produced embryo. However, the development of commercial protocols that ensure embryo quality after in vitro production (IVP) demands some adaptations while considering the differences between in vivo and in vitro produced embryos. Media buffering depends on the gaseous atmosphere utilized during culture and embryo development is sensitive to pH variation during culture, especially in manipulations in the bench. The aim of the present study was to investigate the effect of different buffer systems in the pH stability of culture medium and in the developmental capacity of IVP embryos. 3200 COCs were cultured for 24h, using 20 oocytes per 100£gL droplet in TCM 199 (with HanksLOEsalts: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), containing 10% fetal bovine serum, 20mM HEPES and antibiotics under sterile paraffin oil. After fertilization, the zygotes were cultivated according with treatments (T): T1- control group with NaHCO3 (sodium bicarbonate) in medium HTF Irvine ScientificãÊ; T2- group with 25 mM NaHCO3 in medium SOFaa; T3 LV group with 9mM NaHCO3 and 4 mM HEPES in medium SOFaa and T4 LV group with 9mM NaHCO3 and 12 mM sodium phosphate in medium SOFaa. The embryos were exposed in two ambient: atmosphere with 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2 at 39ØX C ...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Eunice Oba / Banca: Yeda Watanabe / Banca: Mayra D'Avila Assumpção / Banca: Fernanda Landim Alvarenga / Banca: Sony Dimas Bicudo / Resumo: Uma variedade de fatores extrinsecos como ions organicos, tampoes, composicao atmosferica gasosa, aminoacidos, fatores de crescimento, vitaminas, a acao de proteinas e macromoleculas desconhecidas podem afetar a viabilidade embrionaria. A implantacao de um sistema artificial de manutencao e desenvolvimento embrionario que simule um ambiente compativel com o fisiologico ainda e o objetivo de diversos grupos de pesquisa. O tamponamento dos meios e dependente da composicao gasosa da atmosfera de cultivo e o desenvolvimento embrionario, principalmente na fase de cultivo, sofre com as variacoes de pH verificadas durante as manipulacoes realizadas fora da estufa. Os experimentos desenvolvidos tiveram como objetivo avaliar diferentes sistemas de tamponamento para os meios de cultivo, comparando-os entre si quanto a capacidade de proporcionarem maior estabilidade de pH aos embrioes produzidos in vitro. As modificacoes propostas na composicao dos meios de cultivo foram avaliadas em duas atmosferas gasosas. Um total de 3200 ovocitos foram maturados em gotas de 100 ÊL cobertas com oleo mineral por periodo de 24 horas, agrupados em numero de 20 ovocitos por gota de meio TCM-199 com sais de Hankfs (Sigma Aldrich.), acrescido de 0,5 Êg/mL de FSH e 0,03 UI/mL de LH, 10% SFB, 20mM HEPES e antibioticos. Apos a fertilizacao, os possiveis zigotos foram submetidos ao cultivo e distribuidos de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1: grupo controle com sistema tampao de bicarbonato de sodio do meio HTF Irvine Scientific. acrescido de aminoacidos; T2: meio SOFaa com sistema tampao composto de 25 mM de bicarbonato de sodio; T3: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 4 mM de HEPES e T4: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 12 mM de fosfato de sodio. Os embrioes dispostos nos (Resumo completo, clicar acesso eletronico abaixo) / Abstract: A variable interation of intrinsic and extrinsic factors such as organics ions, buffers, atmosphere composition, aminoacids, growth factors, vitamins, proteins and other unknown components may play an important role increasing the developmental potential of in vitro produced bovine embryos. The importance of the development of an artificial system to maintain embryo viability, similar and comparable with physiologic environment, has been the objective of several studies. Therefore, the majority of those studies that focus on culture media formulations were based on the physiology of in vivo produced embryo. However, the development of commercial protocols that ensure embryo quality after in vitro production (IVP) demands some adaptations while considering the differences between in vivo and in vitro produced embryos. Media buffering depends on the gaseous atmosphere utilized during culture and embryo development is sensitive to pH variation during culture, especially in manipulations in the bench. The aim of the present study was to investigate the effect of different buffer systems in the pH stability of culture medium and in the developmental capacity of IVP embryos. 3200 COCs were cultured for 24h, using 20 oocytes per 100£gL droplet in TCM 199 (with HanksLOEsalts: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), containing 10% fetal bovine serum, 20mM HEPES and antibiotics under sterile paraffin oil. After fertilization, the zygotes were cultivated according with treatments (T): T1- control group with NaHCO3 (sodium bicarbonate) in medium HTF Irvine ScientificãÊ; T2- group with 25 mM NaHCO3 in medium SOFaa; T3 LV group with 9mM NaHCO3 and 4 mM HEPES in medium SOFaa and T4 LV group with 9mM NaHCO3 and 12 mM sodium phosphate in medium SOFaa. The embryos were exposed in two ambient: atmosphere with 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2 at 39ØX C ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

The embryonic development and pregnancy rates are influenced by variations in embryo in vitro production (IVP) systems and protocols for bovine embryos, such as gaseous atmosphere, culture media and the protein supply adopted in the different steps of IVP. Two studies were performed to evaluate the effect of O2 tension on in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) of bovine oocytes, and the protein supply in the embryonic in vitro culture. Immature Cumulusoocytes complexes (COC) were recovered by transvaginal ultrasound guided follicular aspiration (OPU) from Bos taurus indicus donors from commercial programs and randomly assigned according to the number and quality of the COC. Standard bovine IVM procedure was carried out in modified TCM-199, added of FSH, LH, Oestradiol, EGF, insulin and 10% bovine fetal serum (FCS), for 24h. Frozen semen was selected by Percoll gradient (90, 60 and 30%). The insemination was performed with 2x106 spermatozoa/mL in Fert-Talp with heparin and PHE, for 18 to 22h. Presumptive zygotes were in vitro cultured (IVC) in SOFaaci during 6 to 9 days with 5%CO2, 5%O2 and 90% N2 in air. All steps of IVC were performed in an incubator at 39ºC with satured humidity. The cleavage and blastocyst rates were analysed by GLM procedure. Hatching, quality I blastocyst and pregnancy rates were compared by Chi-square Test with 5% of significance. In experiment I (11 replicates) IVM and IVF of COC (n=1092) were conducted under 5% CO2 (20% O2) in air or in 5%CO2, 5%O2 and 90% N2 (5%O2). Experiment II was divided in two steps (IIa and IIb). In experiment IIa (n=1745 COC), the IVM and IVF was followed by in vitro culture (IVC) in SOFaaci added of 4mg/mL bovine serum albumin (BSA) or 4mg/mL BSA+2% bovine fetal serum (BSA+FCS). In experiment IIb (n=704 COC), after standard IVM and IVF, IVC was performed in the two media of Experiment IIa (BSA and BSA+FCS) and in a third group the SOFaaci was added of 4mg/mL BSA+2% FCS (BSA+FCSD4) on day 4 of IVC. The viability was accessed by morphological evaluation in D2 (cleavage), D7 (blastocysts and quality categories), D9 (hatched blastocysts), D45 (experiment I) and D60 (experiment II; pregnancy rates), considering day zero (D0) as the fertilization day. In experiment I, no differences were found (P>0.05) in cleavage rates (69 and 70%), blastocyst in D7 (37 and 38%) and blastocyst quality I (79 and 74%) in an atmosphere of 5% or 20%O2, respectively. The hatching rate in D9 considering all COC submitted to IVM was higher (P<0.05) for the 5%O2 group (21%) compared to the IVM and IVF group under 20%O2 (11%). A pregnancy rate of transferred embryos at 45 days (n=278) was similar (P=0.15) between treatments (25.8 e 33.6% for 5%O2 e 20%O2 ,respectively ). In experiment IIa blastocyst rates (51%) and quality I blastocysts (41%) in D7, was higher (P<0.05) in BSA+FCS group compared to the BSA group (42 and 30%), respectively. In experiment IIb, blastocyst rates were higher (P<0.05) in group BSA+FCS (47%) and similar between BSA (34%) and BSA+FCSD4 (43%) groups. Blastocyst rates quality I were higher (P<0.05) for groups BSA+FCS (34%) and BSA+FCSD4 (32%), compared to the BSA group (19.9%). A pregnancy rate of the transferred embryos (n=820) was similar between treatments in experiments IIa and IIb. Considering pregnancy rates corresponding only to IVM COC (Experiment IIa), the rates were higher (P<0.05) for the BSA+FCS group (16%) than the BSA group (12%). There was no detrimental effect in IVP of bovine embryos and their pregnancy rates when IVM, IVF and IVC were performed in 5%O2, 5%CO2 and 90%N2. IVP of bovine embryos is increased by the addition of 2% FCS to the IVC medium without any detrimental effect on their morphological quality and pregnancy rates. On the other hand, pregnancy rates related to IVM of COC incremented by the addition of 2% de Fc to the IVC medium SOFaaci+BSA. / Diferenças nos protocolos e sistemas de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos incluindo atmosfera gasosa, meios de cultivo e suplementação de proteína utilizados nas diferentes etapas da PIV, influenciam diretamente os resultados finais de desenvolvimento embrionário e prenhez. Dois experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a influência da concentração de oxigênio na maturação in vitro (MIV) e fecundação in vitro (FIV) de oócitos bovinos e da suplementação protéica no cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. Complexos cumulus-oócitos imaturos (COC) obtidos de fêmeas Bos taurus indicus por aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-sonografia (OPU) foram divididos homogeneamente quanto ao número e a qualidade entre os tratamentos, sendo maturados por 24h, em TCM-199 modificado, acrescido FSH, LH, Estradiol, EGF, Insulina e 10% de SFB. Sêmen congelado selecionado por gradientes de Percoll (2 x 106 células/mL) foi utilizado para a fecundação em Fert-TALP com heparina e PHE, por 18 a 22h. Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em SOFaaci por 6 a 9 dias em atmosfera de 5%CO2, 5%O2 e 90% N2. Todas as etapas foram conduzidas em estufa a 39ºC com umidade saturada. Os percentuais de clivagem e de blastocistos foram analisados pelo procedimento GLM. As taxas de eclosão dos blastocistos e de prenhez foram comparadas por Qui-quadrado com significância de 5%. No experimento I (11 repetições), a MIV e FIV dos COC (n=1092) foram realizadas sob atmosfera de 5% de CO2 em ar (20%O2) ou em 5%CO2, 5%O2 e 90% N2 (5%O2). O experimento II foi dividido em 2 etapas (IIa e IIb). No experimento IIa (n=1745 COC) após a MIV e FIV foi realizado o CIV em meio SOFaaci acrescido de 4mg/mL albumina sérica bovina (BSA) ou 4mg/mL de BSA + 2% de soro fetal bovino (BSA+SFB). No experimento IIb (n=704 COC), após a MIV e FIV, o CIV foi conduzido nos dois meios do experimento IIa (BSA e BSA+SFB) e um terceiro grupo onde o SOFaaci+BSA foi suplementado com 2% de SFB no quarto dia de cultivo (BSA+SFBD4). As avaliações morfológicas foram efetuadas no D2 (clivagem), D7 (blastocistos e grau de qualidade), D9 (blastocistos eclodidos) e taxa de prenhez aos 45 (experimento I) e 60 dias (experimento II), considerando-se o dia da fecundação como D0. No experimento I, não houve diferença (P>0,05) nas taxas de clivagem (69 e 70%), blastocistos em D7 (37 e 38%) e blastocistos qualidade I (79 e 74%) entre atmosfera de 5%O2 ou 20% de O2, respectivamente. A taxa de eclosão em D9 sob o total de oócitos MIV foi superior (P<0,05) no grupo 5%O2 (21%) comparado ao grupo MIV e FIV sob 20%O2 (11%). A taxa de prenhez aos 45 dias dos embriões transferidos (n=278) foi semelhante (P=0,15) entre os tratamentos (25,8 e 33,6% para 5%O2 e 20%O2 respectivamente). No experimento IIa, a taxa de blastocistos (51,5%) e de blastocistos qualidade I (41%) em D7, foi superior (P<0,05) para o grupo BSA+SFB em relação ao BSA (42 e 30%), respectivamente. No experimento IIb, a taxa de blastocistos foi superior (P<0,05) no grupo BSA+SFB e semelhante (P>0,05) entre o grupo BSA e BSA+SFBD4. A taxa de blastocistos qualidade I foi superior para os grupos BSA+SFB (34%) e BSA+SFBD4 (32,2%) em comparação ao grupo BSA (19,9%). A taxa de prenhez em relação aos embriões transferidos (n=820) foi semelhante entre os tratamentos nos experimentos IIa e IIb. A taxa de prenhez correspondente aos oócitos colocados para MIV foi superior (P<0,05) para o grupo BSA+SFB (16%) comparado ao grupo BSA (12%) no experimento IIa. Não há comprometimento da PIV de embriões bovinos bem como da taxa de prenhez quando a MIV, FIV e CIV são conduzidas com 5%O2, 5%CO2 e 90%N2. A produção in vitro de embriões é incrementada pela adição de 2% de SFB ao meio de CIV, sem prejudicar a qualidade morfológica dos mesmos e a taxa de prenhez. A porcentagem de prenhez produzida em relação aos COC colocados para MIV é aumentada pela adição de 2% de SFB ao meio de cultivo in vitro SOFaaci+BSA.