A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) associa-se a RNA e transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polirribossomos. No SNC, tem um importante papel como reguladora traducional atuando na maturação e eliminação sináptica. A exclusão do éxon 14 de transcritos do FMR1, associada ao uso do terceiro sítio de splicing do éxon 15 do FMR1, acarreta mudança da fase de leitura dos códons subsequentes, produzindo potencialmente isoformas da FMRP com nova região C-terminal, sem o sinal de localização nuclear e o domínio RGG, principal efetor de sua associação a RNAs. Sua importância funcional ainda não foi estudada. Neste trabalho, avaliamos por RT-qPCR a expressão dos transcritos que incluem e excluem o éxon 14 do Fmr1 no SNC de ratos e identificamos o córtex cerebral no décimo nono dia embrionário (E19) e no segundo dia pós-natal (P2) como tecido e fases do desenvolvimento em que são observados transcritos do Fmr1 com junção entre o éxon 13 e o terceiro sítio de splicing do éxon 15. Demonstramos que transcritos com essa junção exônica associam-se à proteína 4E de iniciação da tradução de eucarioto (eIF4E), indicando sua estabilidade no citoplasma. Geramos um anticorpo que identifica proteína de fusão com nova região C-terminal da FMRP. Paralelamente, a triagem por elementos em cis (transcritos) e fatores proteicos em trans trouxeram candidatos a inibirem o splicing do éxon 14 do FMR1 / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), encoded by the Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is an RNA-binding protein with nucleus-to-cytoplasm shuttling, and polyribosome association. In the central nervous system (CNS), FMRP is a translation regulator with important roles in synaptic maturation and elimination. In primary FMR1 transcripts, exon 14 skipping followed by selection of the exon 15 third splicing acceptor site, shifts the open reading frame of the downstream codons creating a putative FMRP isoform with a novel C-terminus, which lacks the nuclear localization signal and the major RNA binding domain, RGG box. The relevance of such isoform is as yet unknown. In the present study, we assessed, by RT-qPCR, the expression of rat Fmr1 transcripts in the CNS, relative to the inclusion of exon 14. We identified the cerebral cortex in the nineteenth embryonic day (E19) and the second postnatal day (P2) as the most prominent sources of transcripts bearing a splicing junction between exon 13 and the third splicing acceptor site in exon 15. Those transcripts are associated with the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), indicating its cytoplasmic stability. We generated an antibody that recognizes a fusion protein carrying the novel FMRP C-terminus. Concurrently, a search for ci (transcript) and trans (protein) elements identified putative inhibitors of FMR1 exon 14 splicing

A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) associa-se a RNA e transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polirribossomos. No SNC, tem um importante papel como reguladora traducional atuando na maturação e eliminação sináptica. A exclusão do éxon 14 de transcritos do FMR1, associada ao uso do terceiro sítio de splicing do éxon 15 do FMR1, acarreta mudança da fase de leitura dos códons subsequentes, produzindo potencialmente isoformas da FMRP com nova região C-terminal, sem o sinal de localização nuclear e o domínio RGG, principal efetor de sua associação a RNAs. Sua importância funcional ainda não foi estudada. Neste trabalho, avaliamos por RT-qPCR a expressão dos transcritos que incluem e excluem o éxon 14 do Fmr1 no SNC de ratos e identificamos o córtex cerebral no décimo nono dia embrionário (E19) e no segundo dia pós-natal (P2) como tecido e fases do desenvolvimento em que são observados transcritos do Fmr1 com junção entre o éxon 13 e o terceiro sítio de splicing do éxon 15. Demonstramos que transcritos com essa junção exônica associam-se à proteína 4E de iniciação da tradução de eucarioto (eIF4E), indicando sua estabilidade no citoplasma. Geramos um anticorpo que identifica proteína de fusão com nova região C-terminal da FMRP. Paralelamente, a triagem por elementos em cis (transcritos) e fatores proteicos em trans trouxeram candidatos a inibirem o splicing do éxon 14 do FMR1 / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), encoded by the Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is an RNA-binding protein with nucleus-to-cytoplasm shuttling, and polyribosome association. In the central nervous system (CNS), FMRP is a translation regulator with important roles in synaptic maturation and elimination. In primary FMR1 transcripts, exon 14 skipping followed by selection of the exon 15 third splicing acceptor site, shifts the open reading frame of the downstream codons creating a putative FMRP isoform with a novel C-terminus, which lacks the nuclear localization signal and the major RNA binding domain, RGG box. The relevance of such isoform is as yet unknown. In the present study, we assessed, by RT-qPCR, the expression of rat Fmr1 transcripts in the CNS, relative to the inclusion of exon 14. We identified the cerebral cortex in the nineteenth embryonic day (E19) and the second postnatal day (P2) as the most prominent sources of transcripts bearing a splicing junction between exon 13 and the third splicing acceptor site in exon 15. Those transcripts are associated with the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), indicating its cytoplasmic stability. We generated an antibody that recognizes a fusion protein carrying the novel FMRP C-terminus. Concurrently, a search for ci (transcript) and trans (protein) elements identified putative inhibitors of FMR1 exon 14 splicing

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANDREIA PIRES AMANCIO.pdf: 1468482 bytes, checksum: cfd035e6b0a287fb6f6c412088f7aa20 (MD5) Previous issue date: 2013-01-31 / The Intellectual Disability (DM) is defined as an incomplete level of intellectual development, and its manifestation usually occurs before 18 years of age. It is one of the most common neuropsychiatric disorders, with a prevalence of 5% in our population. The Fragile X syndrome (FXS) is the most common cause of inherited mental retardation worldwide, and the second most common genetic cause of mental retardation. The phenotype of FXS is associated with mutations in FMR1 (Fragile X Mental Retardation-linked type 1), which is caused by the expansion of repetition of a trinucleotide sequence (CGG) in the regulatory region of the FMR1 gene, located on chromosome X (Xq27 .3). The importance of clinical recognition and specific diagnosis of FXS comes from the fact that theoretically all cases are hereditary and familial. In this context, this study aimed to validate the molecular genetic diagnosis simplified and cost, for patients suspected of FXS in the Laboratory of Cytogenetics and Molecular Genetics (LaGene) of the Department of Health of the State of Goiás in Goiânia using the PCR technique. We selected 35 patients referred by medical service of public health to LaGene with clinical indication for diagnosis of FXS. The patients' DNA was extracted and subjected to two PCR methods, here called PCR Screening (PCR-T) and PCR for Pre-mutation (PCR-P). The new methodology, PCRT, 88% produced conclusive results against 100% conclusiveness of the standard technique (PCR-P) and getting a p> 0.11. The alleles amplified by PCR-P allowed the diagnosis of pre-mutation in a sample. From these observations we propose a strategy for the diagnosis of the syndrome using PCR-P research in pre-mutation individuals in parents with inconclusive results. Given the successful results and improved the PCR, including the new and easy diagnosis of pre-mutation samples not completed by the technique of drawing, we suggest the implementation of both PCR genetics laboratory in the State of Goiás (LaGene ) for the diagnosis of FXS. / A Deficiência Mental (DM) é definida como sendo um nível incompleto do desenvolvimento intelectual, e sua manifestação ocorre normalmente antes dos 18 anos de idade. É um dos transtornos neuropsiquiátricos mais comuns, com uma prevalência de 5% na população brasileira. A síndrome do X-Frágil (SXF) é a causa mais comum de retardo mental hereditário em todo o mundo, e a segunda causa genética mais frequente de deficiência mental. O fenótipo da SXF está associado a mutações no gene FMR1 (Fragile X-linked Mental Retardation type 1), que é causada pela expansão da repetição de uma sequência de trinucleotídeos (CGG) na região reguladora do gene FMR1, localizado no cromossomo X (Xq27.3). A importância do reconhecimento clínico e diagnóstico específico da SXF vem do fato de que teoricamente todos os casos são hereditários e familiais. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo validar o diagnóstico genético-molecular simplificado e de baixo custo, para pacientes com suspeita da SXF no Laboratório de Citogenética e Genética Molecular (LaGene) da Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Goiás, na cidade de Goiânia, utilizando a técnica de PCR. Foram selecionados 35 pacientes encaminhados pelo serviço médico da rede pública de saúde ao LaGene com indicação clínica de diagnóstico da SXF. O DNA desses pacientes foi extraído e submetido a dois métodos de PCR, aqui denominados PCR de Triagem (PCR-T) e PCR para Pré-mutação (PCR-P). A nova metodologia, PCRT, produziu 88% de resultados conclusivos contra 100% de conclusividade pela técnica padrão (PCR-P) e obtendo um p>0,11. Os alelos amplificados pela PCR-P possibilitou o diagnóstico de pré-mutação em uma amostra. A partir destas observações propõe-se uma estratégia para o diagnóstico da síndrome utilizando a PCR-P na pesquisa de pré-mutação em pais de indivíduos com resultados inconclusivos. Considerando os resultados bem sucedidos e aprimorados da técnica de PCR, incluindo o novo e fácill diagnóstico da pré-mutação de amostras não concluídas pela técnica de triagem, sugere-se a implementação de ambas as PCR no laboratório de genética do Estado de Goiás (LaGene) para o diagnóstico da SXF.

Expansion of the CGG repeat region of the FMR1 gene from less than 45 repeats to between 55 and 200 repeats is known as the FMR1 premutation. Carriers of the FMR1 premutation may develop a neurodegenerative disease called fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS), which involves progressive symptoms of tremor, ataxia and cognitive decline. Evidence also suggests that premutation carriers experience other psychiatric difficulties throughout their lifespan. The present study aimed to investigate and delineate neurodegenerative and neurodevelopmental aspects of the premutation utilising primarily fMRI, clinical assessments and molecular measurements in 17 premutation carrier participants and 17 age-matched control participants, aged between 20 and 70 years. The functional imaging protocol included a motor task and an emotional processing task. A battery of clinical and neuropsychological tests outside of the scanner and blood-based measurements of FMR1 CGG repeat length, FMRP levels and FMR1 mRNA levels were also carried out. In the motor task, premutation carriers demonstrated significantly less cerebellar activation than controls during sequential versus random finger tapping (FWEcorr < 0.001). In addition, there was a significant age by group interaction in the hippocampus, inferior parietal cortex and temporal cortex originating from a more negative relationship between brain activation and age in the carrier group compared to the controls (FWEcorr < 0.001). Quantative real-time PCR analysis revealed that mean age-matched FMR1 mRNA levels display a trend towards being higher in carriers and clinical testing of motor skills additionally showed significantly worse tremor and co-ordination scores in non-FXTAS carriers. No significant associations were seen between these measurements and neuroimaging data. During the emotional processing task, carriers exhibited significantly lower activation compared to controls (FWEcorr < 0.001) at the bilateral superior parietal lobe, bilateral Brodmann Area (BA) 17 (V1), right intraparietal area and right BA18 (V2) when comparing high arousal and low arousal conditions. Group by age interaction analyses indicated no significant between group differences at a whole brain level. Clinical assessment revealed that carriers displayed significantly worse symptoms of obsessive-compulsiveness, anxiety, global severity of psychiatric symptoms, facial emotion recognition and autistic traits compared to controls and FMRP levels were comparable between groups. No significant associations were seen between these measurements and neuroimaging data. Here, we present for the first time functional imaging-based evidence for early movement-related neurodegeneration in Fragile X premutation carriers. These changes pre-exist the diagnosis of FXTAS and are greatest in older carriers suggesting that they may be indicative of FXTAS vulnerability. Additionally, we show significantly altered emotional processing at neuropsychological, clinical and functional neuroimaging levels in carriers compared to controls, which appear to display stability over age. Overall, we present new evidence in keeping with possible neurodegenerative and neurodevelopmental traits in FMR1 premutation carriers.

Este estudo teve como objetivo geral a análise do gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation gene 1) quanto a sua relação com a insuficiência ovariana primária (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). No Capítulo I, apresentamos revisão da literatura sobre FXPOI. A pré-mutação do gene FMR1 constitui a mais frequente causa genética de predisposição para menopausa precoce e entre os casos familiais, cerca de 10% estão associados à pré-mutação do gene FMR1. Entretanto, pouco se conhece sobre a expressão do gene no ovário de mamíferos e os mecanismos pelos quais a pré-mutação causa POI permanecem desconhecidos. O Capítulo II apresenta os resultados do estudo da expressão do gene FMR1 nos ovários adultos, humano e murino. As enormes dificuldades inerentes à obtenção e ao estudo de células germinativas femininas nos levaram a estudar células da granulosa humana (HGC), que são de fácil obtenção, como subprodutos de procedimentos de fertilização in vitro. Também estudamos a expressão do Fmr1 em células da granulosa de camundongos da linhagem CD1 (MGC), coletadas nos ovidutos, após estimulação da ovulação. As células da granulosa interagem intensamente com os ovócitos durante a foliculogênese, transmitindo sinais através do ovário e apoiando o crescimento e a maturação dos ovócitos durante as últimas fases do crescimento folicular. É, portanto, possível que alterações celulares induzidas pela pré-mutação do gene FMR1 nas HGC afetem o crescimento folicular, a taxa de ovulação e a fecundidade. Padronizamos os protocolos de isolamento e de cultivo das HGC do fluido folicular e confirmamos a origem das células isoladas pela expressão de marcadores de HGC, por RT-PCR, e pela natureza lipídica dos grânulos citoplasmáticos, pela coloração com o corante lipofílico DiI. Demonstramos, por RT-PCR que as HGC isoladas do líquido folicular expressam o mRNA do FMR1. Em camundongos, também por RT-PCR, evidenciamos a expressão do mRNA do Fmr1 em ovócitos e nas MGC, coletados do oviduto após hiper-estimulação da ovulação. Por hibridação in situ de RNA em HCG cultivadas, detectamos o mRNA do FMR1 disperso no citoplasma e no núcleo, concentrado em regiões cujas características indicaram ser nucléolos. Essa mesma distribuição foi observada em fibroblastos cultivados. Essa provável localização nucleolar sugere que o transcrito do FMR1, nessas células, constitua ribonucleoproteínas mensageiras, para seu direcionamento do nucléolo para sítios citoplasmáticos específicos, onde ocorre sua tradução. Verificamos, por Western blotting, que as HGC expressam, em níveis elevados, isoformas da FMRP, com massa molecular entre 60 e 95 kDa. Determinamos a localização subcelular da FMRP nas HGC e da Fmrp nas MGC, por imunocoloração. Os sinais de hibridação foram visualizados dispersos, em grânulos finos, no citoplasma das HGC e das MGC, de maneira semelhante ao padrão de distribuição da proteína em neurônios. Nos filopódios das MGC, observamos marcação concentrada em alguns pontos, de forma semelhante ao padrão, previamente descrito, de distribuição da Fmrp em espinhas dendríticas de neurônios de hipocampo de rato, constituindo grânulos de RNA, que promovem o transporte de mRNA e controlam a tradução. O padrão de distribuição semelhante entre neurônios e MGC pode refletir similaridade da função da Fmrp nos dois tecidos. A indução de estresse oxidativo nas HGC por tratamento com arsenito sódico, levou a proteína a deixar de ter distribuição citoplasmática difusa e passar a fazer parte de grânulos de estresse perinucleares, colocalizando-se com TIA-1, marcador dessas estruturas. Resultados semelhantes foram anteriormente obtidos em células HeLa e no hipocampo de rato. Esses resultados apoiam a hipótese de que a FMRP participa do mecanismo transitório de parada da tradução após estresse. No Capítulo III, descrevemos nossas tentativas para obtenção de linhagem de células tronco embrionárias (ESC) de camundongo knockin (KI) quanto a pré-mutação do gene Fmr1. Para a obtenção de embriões KI, fêmeas selvagens (WT; linhagem C57) foram cruzadas com machos KI (linhagem C57/BL6) e fêmeas KI foram cruzadas com machos WT. Pretendíamos comparar a expressão do gene Fmr1 na linhagem de ESC KI e linhagem de ESC WT, inclusive durante a diferenciação Não tivemos sucesso, o que pode ser atribuído às dificuldades inerentes à obtenção de ESC. No acompanhamento dos primeiros quatro dias do desenvolvimento in vitro dos embriões, alterações de clivagem e parada de desenvolvimento foram mais frequentemente observadas nos embriões obtidos de fêmeas KI. Entretanto as taxas médias de sobrevivência de ovócitos para blastocistos e de embriões com 8 a 16 células para blastocistos não diferiram estatisticamente entre as fêmeas KI e selvagens; a grande variabilidade entre o número de blastocistos obtidos por fêmea e o pequeno número delas nos grupos KI (seis) e selvagem (sete) indicam que esses resultados devem ser interpretados com cautela. A análise da proteína Fmrp nos blastocistos, por imunocoloração, mostrou distribuição provavelmente citoplasmática, com padrão granular de marcação, sendo as granulações mais frequentes nos blastocistos de fêmeas WT, porém mais grosseiras nos blastocistos de fêmeas KI. Esse conjunto de dados é sugestivo de efeito da pré-mutação do gene Fmr1 em fêmea murina sobre o início do desenvolvimento de seus embriões. Esse aspecto necessita investigação mais aprofundada / This study aimed at investigating the FMR1 gene (Fragile X Mental Retardation gene 1), regarding its relationship with primary ovarian insufficiency (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). In Chapter I, we present a literature review on FXPOI. The FMR1 premutation is the most frequent genetic cause of predisposition to premature ovary insufficiency (POI) and, among the POI familial cases, about 10% are associated with the FMR1 gene premutation. However, little is known about the gene expression in the mammal ovary, and the mechanisms by which the premutation causes POI remain unknown. Chapter II presents the study of the FMR1 gene expression in the human and murine adult ovaries. The enormous difficulties inherent in obtaining and studying female germ cells led us to study human granulosa cells (HGC), which are easily obtained as byproducts of in vitro fertilization procedures. We also studied the FMR1 expression in granulosa cells of mice of the CD1 strain (MGC), collected from the oviducts after ovulation induction. Granulosa cells interact functionally with oocytes during folliculogenesis, transmitting signals through the ovary and supporting growth and maturation of oocytes during the later stages of follicular growth. It is, therefore, possible that cellular changes induced by the FMR1 premutation in HGCs affect follicular growth, ovulation rate and fecundity. We standardized protocols for isolation and culture of HGCs obtained from follicular fluid and confirmed the origin of the isolated cells by the expression of HGC markers, using RT-PCR, and by the lipid nature of the cytoplasmic granules, as demonstrated by the staining with the lipophilic dye DiI. We demonstrated, by RT-PCR, that HGCs isolated from follicular fluid express the FMR1 mRNA. In mice, also by RT-PCR, we detected the Fmr1 mRNA in oocytes and in the MGCs, collected from the oviduct after ovulation hyperstimulation. Using RNA in situ hybridization on cultured HCGs, we detected the FMR1 mRNA dispersed in the cytoplasm and, in the nucleus, concentrated in regions whose features indicated to be nucleoli. This same distribution was observed in cultured fibroblasts. This probable nucleolar localization of the FMR1 transcript in these cells suggests that it constitutes messenger ribonucleoproteins for further targeting to specific cytoplasmic sites where translation occurs. We verified, by Western blotting, that HGCs express high levels of the main FMRP isoforms, with molecular mass between 60 and 95 kDa. We determined the FMRP subcellular localization in HGCs and that of Fmrp in MGCs, by immunostaining. The hybridization signals were seen scattered in fine granules in the cytoplasm of both HGCs and MGCs, in a pattern of distribution similar to that observed in neurons. In the MGC filopodia, the protein labeling was concentrated at some sites, similar to the previously described pattern of Fmrp distribution in neuronal dendritic spines of rat hippocampus, where it is part of RNA granules, promoting mRNA transport and translation control. The similar distribution pattern between neurons and MGC may reflect the similarity of FMRP function in both tissues. The induction of oxidative stress in the HGC by treatment with sodium arsenite led the protein to leave its diffuse cytoplasmic distribution to become part of perinuclear stress granules, co-localized with TIA-1, a marker of these structures. Similar results were previously obtained in HeLa cells and in rat hippocampus. These results support the hypothesis that FMRP participates in the mechanism of the transient translation arrest after stress. In Chapter III, we describe our attempts to obtain an embryonic stem cell line (ESC) from knock-in mice (KI) for the FMR1 premutation. To obtain KI embryos, wild females (WT, strain C57) were crossed with males KI (strain C57/BL6), and KI females were crossed with WT males. We planned to compare the expression of the fmr1 gene in the ESCs from the KI and WT strains, including during differentiation. We did not succeed in obtaining an ESC KI line, which can be attributed to difficulties inherent to the procedure. At follow-up of the first four days of in vitro development of embryos, changes in cleavage and developmental arrest were more frequently observed in embryos obtained from KI females. Meanwhile, the average survival rates of oocytes to blastocysts, and 8-16 cell embryos to blastocysts were not statistically different between the KI and WT females. The great variability among the numbers of blastocysts obtained per female and the small size of the KI (six females) and WT (seven females) groups indicate that these results should be interpreted with caution. Immunostaining analysis of the Fmrp in blastocysts showed a probably cytoplasmic distribution, with a granular pattern of labeling, the grains being more common in blastocysts from WT females, but coarser in blastocysts from KI females. These data are suggestive that the Fmr1 premutation in murine females affects the early development of their embryos. This aspect needs further investigation

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-10-03T17:52:20Z No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Gonçalves dos Reis - 2017.pdf: 5970849 bytes, checksum: e7504d09f87c5499323f6d7c66e10a0f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-04T12:07:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Gonçalves dos Reis - 2017.pdf: 5970849 bytes, checksum: e7504d09f87c5499323f6d7c66e10a0f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-04T12:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Gonçalves dos Reis - 2017.pdf: 5970849 bytes, checksum: e7504d09f87c5499323f6d7c66e10a0f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Neurological disorders are a group of conditions that manifest early in the development of the child, so that delayed neuropsychomotor development (ADNPM) and intellectual disability (ID) can impair cognitive, language, motor and social behavior. The etiology of ID is quite heterogeneous and prenatal, perinatal and postnatal factors are associated with an increased risk of this deficiency. However, 30 to 50% of the cases remain with the unknown etiology. In this context, the main objective of this study was to identify submicroscopic genomic alterations (<5Mb) by means of microarray chromosomal analysis (CMA) in patients with clinical indication of ADNPM and/or ID, sent by attending physicians of the state public health network of Goiás. We analyzed 149 cases of both sexes. Of the total number of patients, 47 had the diagnosis clarified using cytogenetics by G banding. Of 102 patients with an incomplete diagnosis, 72 agreed to participate in the present study and, therefore, performed the CMA. The elucidation of the diagnosis by CMA was possible in 22 patients. Among the results obtained, three rare cases were selected to compose this thesis. The first case is from a patient in whom a de novo microduplication of 0.45 Mb in the 5q35.2q35.3 region containing the NSD1 gene was identified. The effect of the dosing of this gene has been related to Sotos Syndrome and its inverted phenotype. The second case shows the molecular detection of an absent allele on the X chromosome and the presence of 28 CGG repeats in FMR1 gene in the present allele. The CMA showed that the patient had a de novo microdeletion of 4.176 Mb in the Xq27.3-q28 region that affected 34 genes, including five genes (TMEM185A, TMEM257, FMR1, IDS, and FMR2) that were directly correlated with ID phenotypes and neurological disorders. The third case is a de novo microdeletion of 1.59 Mb in the 1p32.3 region involving the DHCR24 gene, which causes a gene dosage effect influencing the activation of enzymes that cause desmosterolosis, which is a desmosterol conversion disorder in cholesterol. Thus, the results of this thesis showed the relevance of the use of the CMA technology to diagnose patients with clinical signs of ADNPM and/or ID that presented karyotype without alterations, evidencing the importance of this technology for public health. / Os distúrbios neurológicos constituem um grupo de condições que se manifestam precocemente durante o desenvolvimento da criança, de forma que o atraso do desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) e a deficiência intelectual (DI) podem acarretar prejuízo às funções cognitivas, de linguagem, motricidade e comportamento social. A etiologia da DI é bastante heterogênea e fatores pré-natais, perinatais e pós-natais estão associados ao aumento do risco dessa deficiência. No entanto, 30 a 50% dos casos permanecem com a etiologia desconhecida. Neste contexto, o objetivo principal deste estudo foi identificar alterações genômicas submicroscópicas (<5Mb) por meio da análise cromossômica por microarranjos (CMA) em pacientes com indicação clínica de ADNPM e/ou DI, encaminhados por médicos assistentes da rede pública de saúde do Estado de Goiás. Foram analisados 149 casos, de ambos os sexos. Do total de pacientes, 47 tiveram o diagnóstico esclarecido utilizando-se a citogenética por bandeamento G. Dos 102 com diagnóstico não concluído, 72 concordaram em participar da presente pesquisa e, portanto, realizaram o CMA. A elucidação do diagnóstico pelo CMA foi possível em 22 pacientes. Dentre os resultados obtidos, foram selecionados três casos raros para compor esta tese. O primeiro caso é de um paciente em que foi identificada uma microduplicação de novo de 0,45 Mb na região 5q35.2q35.3, contendo o gene NSD1. O efeito da dosagem deste gene tem sido relacionado à síndrome de Sotos e ao seu fenótipo invertido. O segundo caso apresenta a detecção molecular de um alelo ausente no cromossomo X e a presença de 28 repetições CGG no gene FMR1 no alelo presente. O CMA mostrou que a paciente tem uma microdeleção de novo de 4,176 Mb na região Xq27.3-q28 que afetou 34 genes, dentre estes, cinco genes (TMEM185A, TMEM257, FMR1, IDS, and FMR2) que foram correlacionados diretamente com os fenótipos de DI e distúrbios neurológicos. O terceiro caso é de uma microdeleção de novo de 1,59 Mb na região 1p32.3 envolvendo o gene DHCR24, que acarreta um efeito de dosagem gênica influenciando na ativação de enzimas que causam a desmosterolose, que é um transtorno de conversão do desmosterol em colesterol. Assim, os resultados desta tese mostraram a relevância da utilização da tecnologia do CMA para diagnosticar pacientes com indicação clínica de ADNPM e/ou DI que apresentaram cariótipo sem alterações, evidenciando a importância desta tecnologia para a saúde pública.

Este estudo teve como objetivo geral a análise do gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation gene 1) quanto a sua relação com a insuficiência ovariana primária (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). No Capítulo I, apresentamos revisão da literatura sobre FXPOI. A pré-mutação do gene FMR1 constitui a mais frequente causa genética de predisposição para menopausa precoce e entre os casos familiais, cerca de 10% estão associados à pré-mutação do gene FMR1. Entretanto, pouco se conhece sobre a expressão do gene no ovário de mamíferos e os mecanismos pelos quais a pré-mutação causa POI permanecem desconhecidos. O Capítulo II apresenta os resultados do estudo da expressão do gene FMR1 nos ovários adultos, humano e murino. As enormes dificuldades inerentes à obtenção e ao estudo de células germinativas femininas nos levaram a estudar células da granulosa humana (HGC), que são de fácil obtenção, como subprodutos de procedimentos de fertilização in vitro. Também estudamos a expressão do Fmr1 em células da granulosa de camundongos da linhagem CD1 (MGC), coletadas nos ovidutos, após estimulação da ovulação. As células da granulosa interagem intensamente com os ovócitos durante a foliculogênese, transmitindo sinais através do ovário e apoiando o crescimento e a maturação dos ovócitos durante as últimas fases do crescimento folicular. É, portanto, possível que alterações celulares induzidas pela pré-mutação do gene FMR1 nas HGC afetem o crescimento folicular, a taxa de ovulação e a fecundidade. Padronizamos os protocolos de isolamento e de cultivo das HGC do fluido folicular e confirmamos a origem das células isoladas pela expressão de marcadores de HGC, por RT-PCR, e pela natureza lipídica dos grânulos citoplasmáticos, pela coloração com o corante lipofílico DiI. Demonstramos, por RT-PCR que as HGC isoladas do líquido folicular expressam o mRNA do FMR1. Em camundongos, também por RT-PCR, evidenciamos a expressão do mRNA do Fmr1 em ovócitos e nas MGC, coletados do oviduto após hiper-estimulação da ovulação. Por hibridação in situ de RNA em HCG cultivadas, detectamos o mRNA do FMR1 disperso no citoplasma e no núcleo, concentrado em regiões cujas características indicaram ser nucléolos. Essa mesma distribuição foi observada em fibroblastos cultivados. Essa provável localização nucleolar sugere que o transcrito do FMR1, nessas células, constitua ribonucleoproteínas mensageiras, para seu direcionamento do nucléolo para sítios citoplasmáticos específicos, onde ocorre sua tradução. Verificamos, por Western blotting, que as HGC expressam, em níveis elevados, isoformas da FMRP, com massa molecular entre 60 e 95 kDa. Determinamos a localização subcelular da FMRP nas HGC e da Fmrp nas MGC, por imunocoloração. Os sinais de hibridação foram visualizados dispersos, em grânulos finos, no citoplasma das HGC e das MGC, de maneira semelhante ao padrão de distribuição da proteína em neurônios. Nos filopódios das MGC, observamos marcação concentrada em alguns pontos, de forma semelhante ao padrão, previamente descrito, de distribuição da Fmrp em espinhas dendríticas de neurônios de hipocampo de rato, constituindo grânulos de RNA, que promovem o transporte de mRNA e controlam a tradução. O padrão de distribuição semelhante entre neurônios e MGC pode refletir similaridade da função da Fmrp nos dois tecidos. A indução de estresse oxidativo nas HGC por tratamento com arsenito sódico, levou a proteína a deixar de ter distribuição citoplasmática difusa e passar a fazer parte de grânulos de estresse perinucleares, colocalizando-se com TIA-1, marcador dessas estruturas. Resultados semelhantes foram anteriormente obtidos em células HeLa e no hipocampo de rato. Esses resultados apoiam a hipótese de que a FMRP participa do mecanismo transitório de parada da tradução após estresse. No Capítulo III, descrevemos nossas tentativas para obtenção de linhagem de células tronco embrionárias (ESC) de camundongo knockin (KI) quanto a pré-mutação do gene Fmr1. Para a obtenção de embriões KI, fêmeas selvagens (WT; linhagem C57) foram cruzadas com machos KI (linhagem C57/BL6) e fêmeas KI foram cruzadas com machos WT. Pretendíamos comparar a expressão do gene Fmr1 na linhagem de ESC KI e linhagem de ESC WT, inclusive durante a diferenciação Não tivemos sucesso, o que pode ser atribuído às dificuldades inerentes à obtenção de ESC. No acompanhamento dos primeiros quatro dias do desenvolvimento in vitro dos embriões, alterações de clivagem e parada de desenvolvimento foram mais frequentemente observadas nos embriões obtidos de fêmeas KI. Entretanto as taxas médias de sobrevivência de ovócitos para blastocistos e de embriões com 8 a 16 células para blastocistos não diferiram estatisticamente entre as fêmeas KI e selvagens; a grande variabilidade entre o número de blastocistos obtidos por fêmea e o pequeno número delas nos grupos KI (seis) e selvagem (sete) indicam que esses resultados devem ser interpretados com cautela. A análise da proteína Fmrp nos blastocistos, por imunocoloração, mostrou distribuição provavelmente citoplasmática, com padrão granular de marcação, sendo as granulações mais frequentes nos blastocistos de fêmeas WT, porém mais grosseiras nos blastocistos de fêmeas KI. Esse conjunto de dados é sugestivo de efeito da pré-mutação do gene Fmr1 em fêmea murina sobre o início do desenvolvimento de seus embriões. Esse aspecto necessita investigação mais aprofundada / This study aimed at investigating the FMR1 gene (Fragile X Mental Retardation gene 1), regarding its relationship with primary ovarian insufficiency (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). In Chapter I, we present a literature review on FXPOI. The FMR1 premutation is the most frequent genetic cause of predisposition to premature ovary insufficiency (POI) and, among the POI familial cases, about 10% are associated with the FMR1 gene premutation. However, little is known about the gene expression in the mammal ovary, and the mechanisms by which the premutation causes POI remain unknown. Chapter II presents the study of the FMR1 gene expression in the human and murine adult ovaries. The enormous difficulties inherent in obtaining and studying female germ cells led us to study human granulosa cells (HGC), which are easily obtained as byproducts of in vitro fertilization procedures. We also studied the FMR1 expression in granulosa cells of mice of the CD1 strain (MGC), collected from the oviducts after ovulation induction. Granulosa cells interact functionally with oocytes during folliculogenesis, transmitting signals through the ovary and supporting growth and maturation of oocytes during the later stages of follicular growth. It is, therefore, possible that cellular changes induced by the FMR1 premutation in HGCs affect follicular growth, ovulation rate and fecundity. We standardized protocols for isolation and culture of HGCs obtained from follicular fluid and confirmed the origin of the isolated cells by the expression of HGC markers, using RT-PCR, and by the lipid nature of the cytoplasmic granules, as demonstrated by the staining with the lipophilic dye DiI. We demonstrated, by RT-PCR, that HGCs isolated from follicular fluid express the FMR1 mRNA. In mice, also by RT-PCR, we detected the Fmr1 mRNA in oocytes and in the MGCs, collected from the oviduct after ovulation hyperstimulation. Using RNA in situ hybridization on cultured HCGs, we detected the FMR1 mRNA dispersed in the cytoplasm and, in the nucleus, concentrated in regions whose features indicated to be nucleoli. This same distribution was observed in cultured fibroblasts. This probable nucleolar localization of the FMR1 transcript in these cells suggests that it constitutes messenger ribonucleoproteins for further targeting to specific cytoplasmic sites where translation occurs. We verified, by Western blotting, that HGCs express high levels of the main FMRP isoforms, with molecular mass between 60 and 95 kDa. We determined the FMRP subcellular localization in HGCs and that of Fmrp in MGCs, by immunostaining. The hybridization signals were seen scattered in fine granules in the cytoplasm of both HGCs and MGCs, in a pattern of distribution similar to that observed in neurons. In the MGC filopodia, the protein labeling was concentrated at some sites, similar to the previously described pattern of Fmrp distribution in neuronal dendritic spines of rat hippocampus, where it is part of RNA granules, promoting mRNA transport and translation control. The similar distribution pattern between neurons and MGC may reflect the similarity of FMRP function in both tissues. The induction of oxidative stress in the HGC by treatment with sodium arsenite led the protein to leave its diffuse cytoplasmic distribution to become part of perinuclear stress granules, co-localized with TIA-1, a marker of these structures. Similar results were previously obtained in HeLa cells and in rat hippocampus. These results support the hypothesis that FMRP participates in the mechanism of the transient translation arrest after stress. In Chapter III, we describe our attempts to obtain an embryonic stem cell line (ESC) from knock-in mice (KI) for the FMR1 premutation. To obtain KI embryos, wild females (WT, strain C57) were crossed with males KI (strain C57/BL6), and KI females were crossed with WT males. We planned to compare the expression of the fmr1 gene in the ESCs from the KI and WT strains, including during differentiation. We did not succeed in obtaining an ESC KI line, which can be attributed to difficulties inherent to the procedure. At follow-up of the first four days of in vitro development of embryos, changes in cleavage and developmental arrest were more frequently observed in embryos obtained from KI females. Meanwhile, the average survival rates of oocytes to blastocysts, and 8-16 cell embryos to blastocysts were not statistically different between the KI and WT females. The great variability among the numbers of blastocysts obtained per female and the small size of the KI (six females) and WT (seven females) groups indicate that these results should be interpreted with caution. Immunostaining analysis of the Fmrp in blastocysts showed a probably cytoplasmic distribution, with a granular pattern of labeling, the grains being more common in blastocysts from WT females, but coarser in blastocysts from KI females. These data are suggestive that the Fmr1 premutation in murine females affects the early development of their embryos. This aspect needs further investigation

A Síndrome do X frágil (SXF) é a forma mais comum de deficiência intelectual herdada. É causada por uma mutação no gene FMR1; (Fragile X Mental Retardation 1;), que resulta na deficiência da proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein;). O gene FMR1;, localizado no braço longo do cromossomo X, em Xq27.3, possui uma repetição de trinucleotídeos (CGG)n em sua região 5\' não traduzida (região reguladora). Na população geral, o tamanho dessa repetição varia entre 5 a 44 trincas de bases. Uma expansão superior a 200 trinucleotídeos leva à hipermetilação e consequente silenciamento da transcrição do gene. Quando isso ocorre, tem-se uma mutação completa, a causa da SXF. Se a repetição expandida tem de 55 a 200 trincas de bases, chamada de pré-mutação, não ocorre hipermetilação e a proteína FMRP é produzida; portanto, a pré-mutação não está associada à SXF, porém está relacionada a outros quadros clínicos, particularmente à síndrome de tremor/ataxia associada ao X frágil (FXTAS; Fragile-X associated Tremor Ataxia Syndrome;) e à insuficiência ovariana primária associada ao X frágil (FXPOI; Fragile-X associated Primary Ovarian Insufficiency;). O objetivo deste trabalho foi investigar duas famílias cujos casos-índice foram encaminhados para o Centro de Pesquisa sobre o Genoma Humano e Células-Tronco para investigar ataxia espinocerebelar e nos quais a avaliação clínica e a história familial sugeriram a possibilidade de FXTAS; em ambos os pacientes, pré-mutação do gene FMR1; foi detectada. Na Família 1, foi feito o diagnóstico de SXF em um neto da propósita e foi identificada a mutação completa em várias filhas e netas, todas com dificuldade de aprendizado. Na Família 2 não foram identificadas mutações completas e em um dos netos do propósito detectou-se mosaicismo de alelo intermediário e pré-mutação. Assim, diante da variada apresentação fenotípica, a possibilidade de condição associada ao gene FMR1; deve ser considerada frente aos fenótipos de deficiência intelectual, dificuldade de aprendizado, falência ovariana prematura e síndrome de tremor-ataxia. O diagnóstico de FXTAS em famílias em que não há registro de SXF não é frequente, provavelmente diante do desconhecimento dessa possibilidade, mas tem importância fundamental para o aconselhamento genético, particularmente quanto à ocorrência de deficiência intelectual / RIBEIRO, M. D. O. From top to bottom: genetic counseling in families ascertained through fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) 2017. 64 f. Dissertação (Mestrado em Aconselhamento Genético e Genômica Humana) - Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Fragile X syndrome (FXS) is the most common form of inherited intellectual disability. It is caused by a mutation in the Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1;) gene located on the long arm of the X chromosome at Xq27.3 that results in FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) deficiency. The FMR1; gene has a trinucleotide repeat (CGG)n at the 5\' untranslated region (regulatory region); in the general population, this repeat varies in size from 5 to 44 CGG triplets. An expanded repeat of more than 200 trinucleotides leads to hypermethylation and consequent silencing of the gene transcription - the full mutation that causes FXS. The repeat containing 55 to 200 triplets characterizes a premutation; there is no hypermethylation, the gene is transcribed, and the FMRP is produced; then premutations are not associated with FXS, but are related to other clinical conditions: Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) and Fragile X-associated Primary Ovarian Insufficiency (FXPOI). The objective of this study was to investigate two families whose index cases were referred to the Centro de Pesquisa sobre o Genoma Humano e Células-Tronco to investigate spinocerebellar ataxia, whose clinical evaluation and family history suggested the possibility of FXTAS. Both probands were found to carry FMR1; premutations. In Family 1, the diagnosis of FXS was established in a grandson of the proband, and the full mutation was also identified in several of her daughters and granddaughters, all presenting with learning difficulties. In Family 2, no full mutations were detected; a proband\'s grandson had size mosaicism for FMR1; ; alleles, carrying an intermediate allele and a premutation. Although uncommon, possibly due to lack of knowledge about the syndrome, the diagnosis of FXTAS in families without FXS is important for genetic counseling, particularly regarding the occurrence of intellectual disability

A Síndrome do X frágil (SXF) é a forma mais comum de deficiência intelectual herdada. É causada por uma mutação no gene FMR1; (Fragile X Mental Retardation 1;), que resulta na deficiência da proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein;). O gene FMR1;, localizado no braço longo do cromossomo X, em Xq27.3, possui uma repetição de trinucleotídeos (CGG)n em sua região 5\' não traduzida (região reguladora). Na população geral, o tamanho dessa repetição varia entre 5 a 44 trincas de bases. Uma expansão superior a 200 trinucleotídeos leva à hipermetilação e consequente silenciamento da transcrição do gene. Quando isso ocorre, tem-se uma mutação completa, a causa da SXF. Se a repetição expandida tem de 55 a 200 trincas de bases, chamada de pré-mutação, não ocorre hipermetilação e a proteína FMRP é produzida; portanto, a pré-mutação não está associada à SXF, porém está relacionada a outros quadros clínicos, particularmente à síndrome de tremor/ataxia associada ao X frágil (FXTAS; Fragile-X associated Tremor Ataxia Syndrome;) e à insuficiência ovariana primária associada ao X frágil (FXPOI; Fragile-X associated Primary Ovarian Insufficiency;). O objetivo deste trabalho foi investigar duas famílias cujos casos-índice foram encaminhados para o Centro de Pesquisa sobre o Genoma Humano e Células-Tronco para investigar ataxia espinocerebelar e nos quais a avaliação clínica e a história familial sugeriram a possibilidade de FXTAS; em ambos os pacientes, pré-mutação do gene FMR1; foi detectada. Na Família 1, foi feito o diagnóstico de SXF em um neto da propósita e foi identificada a mutação completa em várias filhas e netas, todas com dificuldade de aprendizado. Na Família 2 não foram identificadas mutações completas e em um dos netos do propósito detectou-se mosaicismo de alelo intermediário e pré-mutação. Assim, diante da variada apresentação fenotípica, a possibilidade de condição associada ao gene FMR1; deve ser considerada frente aos fenótipos de deficiência intelectual, dificuldade de aprendizado, falência ovariana prematura e síndrome de tremor-ataxia. O diagnóstico de FXTAS em famílias em que não há registro de SXF não é frequente, provavelmente diante do desconhecimento dessa possibilidade, mas tem importância fundamental para o aconselhamento genético, particularmente quanto à ocorrência de deficiência intelectual / RIBEIRO, M. D. O. From top to bottom: genetic counseling in families ascertained through fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) 2017. 64 f. Dissertação (Mestrado em Aconselhamento Genético e Genômica Humana) - Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Fragile X syndrome (FXS) is the most common form of inherited intellectual disability. It is caused by a mutation in the Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1;) gene located on the long arm of the X chromosome at Xq27.3 that results in FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) deficiency. The FMR1; gene has a trinucleotide repeat (CGG)n at the 5\' untranslated region (regulatory region); in the general population, this repeat varies in size from 5 to 44 CGG triplets. An expanded repeat of more than 200 trinucleotides leads to hypermethylation and consequent silencing of the gene transcription - the full mutation that causes FXS. The repeat containing 55 to 200 triplets characterizes a premutation; there is no hypermethylation, the gene is transcribed, and the FMRP is produced; then premutations are not associated with FXS, but are related to other clinical conditions: Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) and Fragile X-associated Primary Ovarian Insufficiency (FXPOI). The objective of this study was to investigate two families whose index cases were referred to the Centro de Pesquisa sobre o Genoma Humano e Células-Tronco to investigate spinocerebellar ataxia, whose clinical evaluation and family history suggested the possibility of FXTAS. Both probands were found to carry FMR1; premutations. In Family 1, the diagnosis of FXS was established in a grandson of the proband, and the full mutation was also identified in several of her daughters and granddaughters, all presenting with learning difficulties. In Family 2, no full mutations were detected; a proband\'s grandson had size mosaicism for FMR1; ; alleles, carrying an intermediate allele and a premutation. Although uncommon, possibly due to lack of knowledge about the syndrome, the diagnosis of FXTAS in families without FXS is important for genetic counseling, particularly regarding the occurrence of intellectual disability