O gênero Lactobacillus é o principal grupo de bactérias contaminantes em dornas de fermentação para produção de etanol em larga escala. A alta proliferação destes microrganismos prejudica a viabilidade de cepas de Saccharomyces cerevisiae selecionadas, podendo diminuir a produção de etanol nas dornas de fermentação. Os métodos mais utilizados para identificação destes microrganismos são bioquímicos e moleculares baseados na sequência do DNA, que são muito demorados, onerosos e muitas vezes remetem a resultados ambíguos. MALDI-TOF MS é uma poderosa ferramenta de identificação microbiana e foi testada neste trabalho para identificação de diferentes isolados de Lactobacillus e S. cerevisiae presentes no processo de produção de etanol. Os métodos de preparo e aplicação da amostra para aquisição espectral foram estabelecidos, tanto para bactérias quanto para leveduras. Vinte e sete isolados de Lactobacillus foram identificados pela região 16S rDNA e dois genes housekeeping, pheS e groEL e, três cepas de leveduras selecionadas do processo foram identificadas pela região ITS e 28S nr-LSU. As identificações genômicas foram contrastadas com as identificações obtidas com o perfil proteico por MALDI-TOF MS e 97% dos Lactobacillus tiveram a mesma classificação molecular que o gene pheS, eleito como o mais discriminatório, e 100% das cepas de leveduras foram classificadas como S. cerevisiae por ambas as técnicas. A técnica MALDI- TOF MS se mostrou altamente eficiente para discriminação intraespecífica de leveduras e interespecífica de Lactobacillus, não havendo apenas discriminação para isolados classificados como L. casei pelos genes housekeeping. Além disso, quando comparado o poder discriminatório da técnica MALDI-TOF MS em relação ao banco de dados espectral disponível no Biotyper e, posteriormente, ao banco de dados complementar criado neste trabalho com os microrganismos próprios do processo de produção de etanol, houve um aumento de 57 a 100% das repetições que foram identificadas ao nível de espécie com alta confiabilidade. Desta forma, os resultados deste estudo mostraram que a técnica MALDI-TOF MS pode ser utilizada como uma alternativa rápida e eficaz para identificação de Lactobacillus e Saccharomyces do processo etanólico. / The genus Lactobacillus is the main group of contaminating bacteria in fermentation tanks for large-scale ethanol production. The high proliferation of these organisms affect the viability of selected strains of Saccharomyces cerevisiae, which can reduce the production of ethanol in fermentation tanks. The most used methods for identifying these microorganisms are biochemical and molecular based on DNA sequence, which are very time-consuming, costly and often revert to ambiguous results. MALDI-TOF MS is a powerful microbial identification tool and it was tested in this work to identify different isolates of Lactobacillus and S. cerevisiae present in the ethanol production process. The sample preparation and application in the MALDI plate for spectral acquisition were established for both bacteria and yeasts. Twenty-seven isolates of Lactobacillus were identified by the 16S rDNA region and two housekeeping genes (pheS and groEL genes) and three yeast strains selected from the process were identified by the ITS and 28S nr-LSU regions. The genomic identifications were compared with the MALDI-TOF MS protein profiles and 97% of the Lactobacillus had the same molecular classification as the pheS gene, which was chosen as the most discriminatory gene, and 100% of the yeast strains were classified as S. cerevisiae by both techniques. The MALDI-TOF MS technique proved highly efficient for intraspecific yeast and interspecific discrimination of Lactobacillus, and there was no discrimination for isolates classified as L. casei by housekeeping genes. Furthermore, when compared to the discriminatory power of MALDI-TOF MS technique in relation to spectral database available on Biotyper and subsequently, the complementary database created in this work with the microorganisms themselves in the ethanol production process, there was an increase from 57 to 100% of the repetitions that were identified at the species level with high reliability. Thus, the results of this study showed that the MALDI-TOF MS technique can be used as a fast and efficient alternative for the identification of Lactobacillus and Saccharomyces of the ethanolic process.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-12T13:09:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao_MitalleMatos_PPGG.pdf: 3448234 bytes, checksum: fe598459348fe967a8f1c2e5067f7d99 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-12T13:09:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertacao_MitalleMatos_PPGG.pdf: 3448234 bytes, checksum: fe598459348fe967a8f1c2e5067f7d99 (MD5) Previous issue date: 2015-03-02 / CNPq / Danos causados por doenças virais estão entre os principais fatores limítrofes da produtividade do feijão-caupi. Em condições de estresse os fatores de transcrição (TFs) participam ativamente das etapas iniciais do processo de detecção e sinalização, regulando a expressão de vários grupos gênicos. Neste sentido, objetivou-se caracterizar TFs da família MYB e avaliar sua expressão diferencial frente à infecção viral, bem como determinar genes de referência (RGs) para normalização dos dados em RT-qPCR sob diferentes condições de estresse e controles. Por meio de análises in silico no banco NordEST, identificamos no transcriptoma do feijão-caupi um total de 86 candidatos a TF MYB, classificados em três subfamílias. A análise dos componentes estruturais do domínio R2R3-MYB permitiu observar a conservação dos aminoácidos característicos desta classe protéica em feijão-caupi. Por sua vez, o padrão de distribuição em pseudocromossomos de Phaseolus vulgaris indicou que genes MYB sofreram duplicações em tandem e intercromossomais, contribuindo para sua expansão no feijão-caupi. A análise filogenética formou 18 subclados, apoiados pela estrutura dos motivos funcionais da região C-terminal das proteínas. Das tags SuperSAGE diferencialmente expressas sob infecção viral, três foram reguladas positivamente, indicando a participação de candidatos MYB na resposta ao estresse viral. Dos sete RGs avaliados em três conjuntos experimentais, β-tubulina, Skip16 e Act2/7 + Skip16 foram as melhores combinações para seca, salinidade e vírus, respectivamente, podendo ser recomendados como normalizadores para estudos de expressão diferencial em feijão-caupi. Neste estudo identificamos a maior família de TFs em plantas observando sua participação ativa na resposta de defesa contra estresses em feijão-caupi. / Damages caused by viral diseases are among the main factors affecting the cowpea productivity. Under stress conditions, transcription factors (TFs) actively participate in the initial stages of the detection and signaling process by regulating the expression of various gene groups. In this sense, the objective of the present work was to characterize members of the MYB TF-family and evaluate their differential expression under viral infection, also determining reference genes (RGs) for data normalization in RT-qPCR under different stress and control conditions. Using in silico approaches to analyze the NordEST databank, a total of 86 MYB TF-candidates could be identified, being classified into three subfamilies. An analysis of the structural components of the R2R3-MYB domain allowed the identification of conserved amino acid residues of this protein class in cowpea. In turn, the MYB distribution pattern in the pseudochromosomes of Phaseolus vulgaris indicated that MYB members suffered in tandem and interchromosomal duplications, contributing to their expansion in cowpea. Phylogenetic analysis formed 18 subclades, supported by structural features of motifs in the C-terminal region of the protein. Of differentially expressed SuperSAGE tags under viral infection, three were upregulated, indicating the involvement of MYB candidates in response to viral stress. Considering the seven tested RGs under three experimental conditions, β-tubulin, Skip16 and Act2/7 + Skip16 were the best combinations for drought, salinity and viruses, respectively, recommended as normalizer genes in studies of differential expression in cowpea. In the present work we identified members of the largest family of TFs in plants observing their active participation in defense against stress response in cowpea.

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto. / Irregular Gram positive rods (coryneform bacteria; IGPRs) comprise a group of species that has a wide phenotypic diversity and makes the conventional identification limited and that may be present in the environment, humans and animals hosts. In order to provide further accurate identification of these microorganisms in a genus and species terms it is recommended the use of molecular methods. In this study, we analyzed the 16S rRNA gene sequences and other conserved genes (housekeeping) in order to elucidate the identification of clinical isolates, pharmaceutical and clean room areas. We have documented a nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant (MDR) C. striatum in Rio de Janeiro. C. striatum identification was confirmed by 16S rRNA and rpoB gene sequencing. C. striatum was mostly isolated in pure culture from tracheal aspirates of adults undergoing endotracheal intubation procedures. The analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) indicated the presence of four PFGE profiles, including two related clones of MDR strains (PFGE I and II). The data demonstrated the predominance of PFGE I, mostly isolated from patients of intensive care units and surgical wards. A potential causal link between death and MDR C. striatum (PFGE I and II) infection was observed in five cases. We also performed the identification of Nocardia species of human infections by multilocus sequence analysis (MLSA) and characterized their antimicrobial and phenotypic profiles. An overview from 1970 to 2013 of the case reports on Nocardia species related to human infections, except mycetomas, in Brazil, was also accomplished. Molecular characterization by four-locus (gyrB-16S-secA1-hsp65) has provided the species identification N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica and N. exalbida/gamkensis. N. nova strains isolated from different clinical specimens of one patient showed identical antimicrobial susceptibility patterns. PFGE analysis performed to determine the genetic relatedness of these N. nova strains two distinct profiles, which were designated A and B. This is the first report on identification of Nocardia species by MLSA in Brazil. The IGPRs obtained in clean room environments that could not be identified by conventional criteria were studied by 16S rRNA gene sequence analysis that allowed the identification of 95.83% at genus level and of 35.42% at the species level. The most common genus found in the clean room environments were Microbacterium and Streptomyces. The analysis of rpoB and recA genes sequence of seventeen Microbacterium strains contributed to the identification of three strains at species level. MLSA of seven Streptomyces strains identified a single sample at the species level. Moreover, the rpoB gene sequence analysis was effective in identifying Corynebacterium strains at species level. A new genus and species were found among clean room environmental strains belonging to the Actinobacteria class. Based on the morphological, genotypic and biochemical data presented in this study the 3117BRRJ strain represent a novel specie of the genus Nocardioides, for which the name Nocardioides brasiliensis sp. nov. was proposed and the 3712BRRJ and 3371BRRJ represent a new genus and species for which the name Guaraldella brasiliensis nov. were proposed.

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto. / Irregular Gram positive rods (coryneform bacteria; IGPRs) comprise a group of species that has a wide phenotypic diversity and makes the conventional identification limited and that may be present in the environment, humans and animals hosts. In order to provide further accurate identification of these microorganisms in a genus and species terms it is recommended the use of molecular methods. In this study, we analyzed the 16S rRNA gene sequences and other conserved genes (housekeeping) in order to elucidate the identification of clinical isolates, pharmaceutical and clean room areas. We have documented a nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant (MDR) C. striatum in Rio de Janeiro. C. striatum identification was confirmed by 16S rRNA and rpoB gene sequencing. C. striatum was mostly isolated in pure culture from tracheal aspirates of adults undergoing endotracheal intubation procedures. The analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) indicated the presence of four PFGE profiles, including two related clones of MDR strains (PFGE I and II). The data demonstrated the predominance of PFGE I, mostly isolated from patients of intensive care units and surgical wards. A potential causal link between death and MDR C. striatum (PFGE I and II) infection was observed in five cases. We also performed the identification of Nocardia species of human infections by multilocus sequence analysis (MLSA) and characterized their antimicrobial and phenotypic profiles. An overview from 1970 to 2013 of the case reports on Nocardia species related to human infections, except mycetomas, in Brazil, was also accomplished. Molecular characterization by four-locus (gyrB-16S-secA1-hsp65) has provided the species identification N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica and N. exalbida/gamkensis. N. nova strains isolated from different clinical specimens of one patient showed identical antimicrobial susceptibility patterns. PFGE analysis performed to determine the genetic relatedness of these N. nova strains two distinct profiles, which were designated A and B. This is the first report on identification of Nocardia species by MLSA in Brazil. The IGPRs obtained in clean room environments that could not be identified by conventional criteria were studied by 16S rRNA gene sequence analysis that allowed the identification of 95.83% at genus level and of 35.42% at the species level. The most common genus found in the clean room environments were Microbacterium and Streptomyces. The analysis of rpoB and recA genes sequence of seventeen Microbacterium strains contributed to the identification of three strains at species level. MLSA of seven Streptomyces strains identified a single sample at the species level. Moreover, the rpoB gene sequence analysis was effective in identifying Corynebacterium strains at species level. A new genus and species were found among clean room environmental strains belonging to the Actinobacteria class. Based on the morphological, genotypic and biochemical data presented in this study the 3117BRRJ strain represent a novel specie of the genus Nocardioides, for which the name Nocardioides brasiliensis sp. nov. was proposed and the 3712BRRJ and 3371BRRJ represent a new genus and species for which the name Guaraldella brasiliensis nov. were proposed.