O gênero Lactobacillus é o principal grupo de bactérias contaminantes em dornas de fermentação para produção de etanol em larga escala. A alta proliferação destes microrganismos prejudica a viabilidade de cepas de Saccharomyces cerevisiae selecionadas, podendo diminuir a produção de etanol nas dornas de fermentação. Os métodos mais utilizados para identificação destes microrganismos são bioquímicos e moleculares baseados na sequência do DNA, que são muito demorados, onerosos e muitas vezes remetem a resultados ambíguos. MALDI-TOF MS é uma poderosa ferramenta de identificação microbiana e foi testada neste trabalho para identificação de diferentes isolados de Lactobacillus e S. cerevisiae presentes no processo de produção de etanol. Os métodos de preparo e aplicação da amostra para aquisição espectral foram estabelecidos, tanto para bactérias quanto para leveduras. Vinte e sete isolados de Lactobacillus foram identificados pela região 16S rDNA e dois genes housekeeping, pheS e groEL e, três cepas de leveduras selecionadas do processo foram identificadas pela região ITS e 28S nr-LSU. As identificações genômicas foram contrastadas com as identificações obtidas com o perfil proteico por MALDI-TOF MS e 97% dos Lactobacillus tiveram a mesma classificação molecular que o gene pheS, eleito como o mais discriminatório, e 100% das cepas de leveduras foram classificadas como S. cerevisiae por ambas as técnicas. A técnica MALDI- TOF MS se mostrou altamente eficiente para discriminação intraespecífica de leveduras e interespecífica de Lactobacillus, não havendo apenas discriminação para isolados classificados como L. casei pelos genes housekeeping. Além disso, quando comparado o poder discriminatório da técnica MALDI-TOF MS em relação ao banco de dados espectral disponível no Biotyper e, posteriormente, ao banco de dados complementar criado neste trabalho com os microrganismos próprios do processo de produção de etanol, houve um aumento de 57 a 100% das repetições que foram identificadas ao nível de espécie com alta confiabilidade. Desta forma, os resultados deste estudo mostraram que a técnica MALDI-TOF MS pode ser utilizada como uma alternativa rápida e eficaz para identificação de Lactobacillus e Saccharomyces do processo etanólico. / The genus Lactobacillus is the main group of contaminating bacteria in fermentation tanks for large-scale ethanol production. The high proliferation of these organisms affect the viability of selected strains of Saccharomyces cerevisiae, which can reduce the production of ethanol in fermentation tanks. The most used methods for identifying these microorganisms are biochemical and molecular based on DNA sequence, which are very time-consuming, costly and often revert to ambiguous results. MALDI-TOF MS is a powerful microbial identification tool and it was tested in this work to identify different isolates of Lactobacillus and S. cerevisiae present in the ethanol production process. The sample preparation and application in the MALDI plate for spectral acquisition were established for both bacteria and yeasts. Twenty-seven isolates of Lactobacillus were identified by the 16S rDNA region and two housekeeping genes (pheS and groEL genes) and three yeast strains selected from the process were identified by the ITS and 28S nr-LSU regions. The genomic identifications were compared with the MALDI-TOF MS protein profiles and 97% of the Lactobacillus had the same molecular classification as the pheS gene, which was chosen as the most discriminatory gene, and 100% of the yeast strains were classified as S. cerevisiae by both techniques. The MALDI-TOF MS technique proved highly efficient for intraspecific yeast and interspecific discrimination of Lactobacillus, and there was no discrimination for isolates classified as L. casei by housekeeping genes. Furthermore, when compared to the discriminatory power of MALDI-TOF MS technique in relation to spectral database available on Biotyper and subsequently, the complementary database created in this work with the microorganisms themselves in the ethanol production process, there was an increase from 57 to 100% of the repetitions that were identified at the species level with high reliability. Thus, the results of this study showed that the MALDI-TOF MS technique can be used as a fast and efficient alternative for the identification of Lactobacillus and Saccharomyces of the ethanolic process.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2018-07-30T18:34:11Z No. of bitstreams: 1 Itiane Barcellos Jaskulski.pdf: 1235418 bytes, checksum: 9fdf9c1822423763aa421923556d593c (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2018-07-31T19:15:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Itiane Barcellos Jaskulski.pdf: 1235418 bytes, checksum: 9fdf9c1822423763aa421923556d593c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T19:15:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Itiane Barcellos Jaskulski.pdf: 1235418 bytes, checksum: 9fdf9c1822423763aa421923556d593c (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Na última década, a ciência contribuiu significativamente para inúmeros avanços e progressos em relação ao tratamento e prevenção do câncer colorretal (CCR), porém, a prevalência global e taxa de mortalidade ainda permanecem altos. Há relatos sobre efeitos benéficos de espécies de Bifidobacterium e Lactobacillus com potencial probiótico na prevenção de CCR, no entanto, a bactéria probiótica Lactococcus lactis subps. lactis é comumente utilizada para fins industriais, não havendo comprovações in vivo sobre seu potencial anticarcinogênico. Visto o interesse emergente dos efeitos benéficos dos probióticos a fim de prevenir ou tratar o CCR, o presente estudo objetivou explorar os efeitos protetores de Lactococcus lactis subsp. lactis sobre o CCR. Ratos da linhagem Wistar receberam doses subcutâneas de 1,2 dimetilhidrazina (DMH), suspensão de Lactococcus lactis subsp. lactis por via oral e dieta hipercalórica. Após 20 semanas, os tecidos intestinais foram analisados histologicamente, além de controle ponderal e consumo de alimentos, parâmetros hematológicos e bioquímicos, estresse oxidativo e estado redox do tecido hepático. De acordo com o resultado, o isolado demonstrou potencial anticarcinogênico contra CCR, estabilizou o ganho de peso, reduziu adiposidade abdominal, apresentou ligeira melhora da resposta imune, exerceu atividade antioxidante frente ao estresse oxidativo e, demonstrou proteção à peroxidação lipídica. Estes resultados são promissores para a ciência frente às pesquisas relacionadas ao tratamento e prevenção de CCR. / In the last decade, science has contributed significantly to numerous advances and advances in treating and preventing colorectal cancer (CRC), but the overall prevalence and mortality rate remain high. There are reports on the beneficial effects of Bifidobacterium and Lactobacillus species with probiotic potential in the prevention of CRC, however, the probiotic bacterium Lactococcus lactis subps. lactis is commonly used for industrial purposes, and there is no in vivo evidence for its anticarcinogenic potential. Given the emerging interest in the beneficial effects of probiotics in preventing or treating CRC, the present study aimed to explore the protective effects of Lactococcus lactis subsp. lactis in the CRC. Wistar rats received subcutaneous doses of 1,2-dimethylhydrazine (DMH), suspension of Lactococcus lactis subsp. lactis orally and a hypercaloric diet. After 20 weeks, intestinal tissues were analyzed histologically, in addition to weight control and food consumption, hematological and biochemical parameters, oxidative stress and redox status of the hepatic tissue. According to the results, the isolate demonstrated anticarcinogenic potential against CRC, stabilized the weight gain, reduced abdominal adiposity, showed a slight improvement in the immune response, exerted antioxidant activity against oxidative stress and demonstrated protection of lipid peroxidation. These results are promising for science regarding the treatment and prevention of CRC.

A produção de etanol nas destilarias brasileiras é baseada na atividade fermentativa da levedura Saccharomyces cerevisiae que utiliza o caldo da cana-de-açúcar e/ou o melaço como substrato. Bactérias contaminantes da fermentação alcoólica competem com as leveduras pelos açúcares, afetando o rendimento do sistema produtivo e, consequentemente, causando perdas econômicas significativas às usinas. Biofilmes formados nos tanques de fermentação alcoólica agem como reservatórios de bactérias, contribuindo para contaminações persistentes e de difícil controle. Os biofilmes proporcionam aos seus habitantes certo grau de proteção contra diversas ameaças do meio, incluindo a ação dos antibióticos. Desta forma, o conhecimento da comunidade bacteriana dos biofilmes é fundamental para as medidas que visam o controle das contaminações na produção do bioetanol. No primeiro estudo, a composição e dinâmica da comunidade bacteriana foram determinadas pela análise de sequências do gene 16S rRNA de biofilmes com diferentes períodos de crescimento, correspondentes aos estágios iniciais de estabelecimento destes biofilmes dentro dos tanques de fermentação alcóolica Os resultados mostraram que estas comunidades foram compostas predominantemente pelas bactérias ácido-lácticas (LAB), com destaque para o gênero Lactobacillus. A visualização da estrutura dos biofilmes por microscopia eletrônica de varredura evidenciou que estes são formados por bactérias e leveduras (biofilmes mistos). No segundo estudo, a suscetibilidade aos antimicrobianos (monensina, virginiamicina e beta-ácido derivado do lúpulo) e a capacidade de formação de biofilmes em culturas puras foram avaliadas para isolados de Lactobacillus spp. provenientes de biofilmes (células sésseis) e de vinho bruto (células planctônicas) coletados dos tanques de fermentação. A partir dos resultados foi possível observar que as diferenças na suscetibilidade aos antimicrobianos e na habilidade de formar biofilmes foram estirpe-dependentes e que, em alguns casos, o perfil apresentado para algumas espécies mostrou-se relacionado à fonte de isolamento. Este foi o primeiro estudo sobre biofilmes contaminantes da fermentação alcoólica, em escala industrial, para a produção de etanol a partir da cana-de-açúcar / Bioethanol production in Brazilian distilleries is based on fermentative activity of the yeast Saccharomyces cerevisiae which uses sugarcane juice and/or molasses as a substrate. Bacterial contaminants of alcoholic fermentation compete with yeasts for sugars, affecting ethanol yield and consequently causing relevant economic losses to the fuel ethanol industry. Biofilms formed into fermentors act as bacterial reservoirs, contributing to persistent contaminations that are difficult to control. Biofilms provide a certain degree of protection for their inhabitants against some environmental threats, including antibiotics. Thus, understanding bacterial community within biofilms is essential for actions to control contaminations in bioethanol production. In the first study, composition and dynamic of bacterial community were determined by 16S rRNA gene sequences analysis of biofilms with different growth periods, corresponding to initial stages of biofilm establishment in fermentation tanks. Results showed that these communities were dominated by lactic acid bacteria (LAB), mainly of the genus Lactobacillus. Visualization of biofilm structure by scanning electron microscopy revealed a mixed-species biofilm composed by bacteria and yeasts. In the second study, susceptibility to antimicrobials (monensina, virginiamicina and beta-acids from hops) and capacity to form biofilm in pure culture were evaluated for Lactobacillus spp. isolated from biofilms (sessile cells) and wine (planktonic cells) collected from fermentors. The results showed that differences in the susceptibility to antimicrobials and the ability to form biofilms were strain-specific and, in certain cases, the response of some species was related to the isolation source. This was the first investigation of contaminant biofilms from sugarcane-based alcoholic fermentation on an industrial scale

A produção de etanol nas destilarias brasileiras é baseada na atividade fermentativa da levedura Saccharomyces cerevisiae que utiliza o caldo da cana-de-açúcar e/ou o melaço como substrato. Bactérias contaminantes da fermentação alcoólica competem com as leveduras pelos açúcares, afetando o rendimento do sistema produtivo e, consequentemente, causando perdas econômicas significativas às usinas. Biofilmes formados nos tanques de fermentação alcoólica agem como reservatórios de bactérias, contribuindo para contaminações persistentes e de difícil controle. Os biofilmes proporcionam aos seus habitantes certo grau de proteção contra diversas ameaças do meio, incluindo a ação dos antibióticos. Desta forma, o conhecimento da comunidade bacteriana dos biofilmes é fundamental para as medidas que visam o controle das contaminações na produção do bioetanol. No primeiro estudo, a composição e dinâmica da comunidade bacteriana foram determinadas pela análise de sequências do gene 16S rRNA de biofilmes com diferentes períodos de crescimento, correspondentes aos estágios iniciais de estabelecimento destes biofilmes dentro dos tanques de fermentação alcóolica Os resultados mostraram que estas comunidades foram compostas predominantemente pelas bactérias ácido-lácticas (LAB), com destaque para o gênero Lactobacillus. A visualização da estrutura dos biofilmes por microscopia eletrônica de varredura evidenciou que estes são formados por bactérias e leveduras (biofilmes mistos). No segundo estudo, a suscetibilidade aos antimicrobianos (monensina, virginiamicina e beta-ácido derivado do lúpulo) e a capacidade de formação de biofilmes em culturas puras foram avaliadas para isolados de Lactobacillus spp. provenientes de biofilmes (células sésseis) e de vinho bruto (células planctônicas) coletados dos tanques de fermentação. A partir dos resultados foi possível observar que as diferenças na suscetibilidade aos antimicrobianos e na habilidade de formar biofilmes foram estirpe-dependentes e que, em alguns casos, o perfil apresentado para algumas espécies mostrou-se relacionado à fonte de isolamento. Este foi o primeiro estudo sobre biofilmes contaminantes da fermentação alcoólica, em escala industrial, para a produção de etanol a partir da cana-de-açúcar / Bioethanol production in Brazilian distilleries is based on fermentative activity of the yeast Saccharomyces cerevisiae which uses sugarcane juice and/or molasses as a substrate. Bacterial contaminants of alcoholic fermentation compete with yeasts for sugars, affecting ethanol yield and consequently causing relevant economic losses to the fuel ethanol industry. Biofilms formed into fermentors act as bacterial reservoirs, contributing to persistent contaminations that are difficult to control. Biofilms provide a certain degree of protection for their inhabitants against some environmental threats, including antibiotics. Thus, understanding bacterial community within biofilms is essential for actions to control contaminations in bioethanol production. In the first study, composition and dynamic of bacterial community were determined by 16S rRNA gene sequences analysis of biofilms with different growth periods, corresponding to initial stages of biofilm establishment in fermentation tanks. Results showed that these communities were dominated by lactic acid bacteria (LAB), mainly of the genus Lactobacillus. Visualization of biofilm structure by scanning electron microscopy revealed a mixed-species biofilm composed by bacteria and yeasts. In the second study, susceptibility to antimicrobials (monensina, virginiamicina and beta-acids from hops) and capacity to form biofilm in pure culture were evaluated for Lactobacillus spp. isolated from biofilms (sessile cells) and wine (planktonic cells) collected from fermentors. The results showed that differences in the susceptibility to antimicrobials and the ability to form biofilms were strain-specific and, in certain cases, the response of some species was related to the isolation source. This was the first investigation of contaminant biofilms from sugarcane-based alcoholic fermentation on an industrial scale