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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-15Bitstream added on 2014-06-13T20:14:32Z : No. of bitstreams: 1 cavallari_cfb_dr_botib.pdf: 11188149 bytes, checksum: 24b647e298f1eb3bf8bb5a8051a4aa89 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A caracterização de promotores ubíquos, tecido-específicos ou induzidos sob determinada condição é importante para a produção e liberação comercial de plantas geneticamente modificadas. Este trabalho apresenta a identificação e caracterização de promotores de genes de café (Coffea arabica), uma cultura de grande importância sócio-econômica. Foram selecionados 41 genes candidatos com padrão de expressão constitutivo, fruto-específico ou relacionados com o mecanismo de defesa, através de dados da literatura e da análise in silico em bancos de ESTs disponíveis. A expressão constitutiva ou específica foi confirmada através de PCR quantitativa para somente 10 dos genes analizados. Os experimentos foram realizados em 5 diferentes tecidos/órgãos (raiz, caule, folha, flor e fruto) ou em plantas tratadas com o fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Regiões promotoras de 4 genes foram isoladas através de genome walking: CaGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase como candidato constitutivo), CaAN2 (anthocyanin 2 específico de fruto), CaPR1b e CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 e Nonexpressor of PR genes, correspondentes a genes induzidos mediante a presença de agentes patogênicos). As regiões cis-reguladoras foram caracterizadas in silico e a funcionalidade dos promotores foi avaliada in planta através da expressão do gene repórter uidA em experimentos de transformação transiente em plantas de tabaco ou tomate. Além do interesse fundamental para a compreensão dos mecanismos de regulação gênica em eucariotos, os resultados desta pesquisa são importantes para o desenvolvimento de plantas transgênicas, apresentando também potencial em programas de melhoramento genético do cafeeiro. Palavras-chaves: Coffea arabica, expressão gênica, promotores, genes ubíquos, frutos, resistência de plantas / The choice of promoter, to confer constitutive, spatial and/or temporal transgene expression, is important in plant biotechnology applications. This study presents the identification and characterization of different gene promoters in coffee (Coffea arabica), a species of major socioeconomic characteristics. Forty one constitutive, fruit-specific or pathogen defense-related genes were identified following literature data or in silico analyses in available EST databases. The expression levels of these genes were verified by quantitative PCR and only 10 genes presented a constitutive or specific expression condition. The expression levels assays were carried out in 5 coffee organs/tissues (root, stem, leaves, flowers and fruits) or in coffee plants challenged with Hemileia vastatrix. The promoter region of 4 genes were isolated and characterized in silico: CaGAPDH (glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase as inner control), CaAN2 (anthocyanin 2 fruitspecific), CaPR1b and CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 and Nonexpressor of PR genes, both pathogen-inducible). The functional analyses of the DNA sequence upstream of these genes were assessed with regard to the uidA reporter gene, via Agrobacterium-mediated transient expression assay in tobacco or tomato plants. The characterization of promoters is not only an approach towards coffee breeding programs, but also provides fundamental data for understanding the mechanisms regulating gene expression in perennial plants

Orientador: Ivan G. Maia / Orientador: Diana Fernandez / Banca: Anne-Lise Haenni / Banca: Pierre Marraccini / Banca: Michel Vincentz / Banca: Luis Vieira / Resumo: A caracterização de promotores ubíquos, tecido-específicos ou induzidos sob determinada condição é importante para a produção e liberação comercial de plantas geneticamente modificadas. Este trabalho apresenta a identificação e caracterização de promotores de genes de café (Coffea arabica), uma cultura de grande importância sócio-econômica. Foram selecionados 41 genes candidatos com padrão de expressão constitutivo, fruto-específico ou relacionados com o mecanismo de defesa, através de dados da literatura e da análise in silico em bancos de ESTs disponíveis. A expressão constitutiva ou específica foi confirmada através de PCR quantitativa para somente 10 dos genes analizados. Os experimentos foram realizados em 5 diferentes tecidos/órgãos (raiz, caule, folha, flor e fruto) ou em plantas tratadas com o fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Regiões promotoras de 4 genes foram isoladas através de genome walking: CaGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase como candidato constitutivo), CaAN2 (anthocyanin 2 específico de fruto), CaPR1b e CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 e Nonexpressor of PR genes, correspondentes a genes induzidos mediante a presença de agentes patogênicos). As regiões cis-reguladoras foram caracterizadas in silico e a funcionalidade dos promotores foi avaliada in planta através da expressão do gene repórter uidA em experimentos de transformação transiente em plantas de tabaco ou tomate. Além do interesse fundamental para a compreensão dos mecanismos de regulação gênica em eucariotos, os resultados desta pesquisa são importantes para o desenvolvimento de plantas transgênicas, apresentando também potencial em programas de melhoramento genético do cafeeiro. Palavras-chaves: Coffea arabica, expressão gênica, promotores, genes ubíquos, frutos, resistência de plantas / Abstract: The choice of promoter, to confer constitutive, spatial and/or temporal transgene expression, is important in plant biotechnology applications. This study presents the identification and characterization of different gene promoters in coffee (Coffea arabica), a species of major socioeconomic characteristics. Forty one constitutive, fruit-specific or pathogen defense-related genes were identified following literature data or in silico analyses in available EST databases. The expression levels of these genes were verified by quantitative PCR and only 10 genes presented a constitutive or specific expression condition. The expression levels assays were carried out in 5 coffee organs/tissues (root, stem, leaves, flowers and fruits) or in coffee plants challenged with Hemileia vastatrix. The promoter region of 4 genes were isolated and characterized in silico: CaGAPDH (glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase as inner control), CaAN2 (anthocyanin 2 fruitspecific), CaPR1b and CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 and Nonexpressor of PR genes, both pathogen-inducible). The functional analyses of the DNA sequence upstream of these genes were assessed with regard to the uidA reporter gene, via Agrobacterium-mediated transient expression assay in tobacco or tomato plants. The characterization of promoters is not only an approach towards coffee breeding programs, but also provides fundamental data for understanding the mechanisms regulating gene expression in perennial plants / Mestre

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Les chimiokines sont des protéines appartenant à la famille des cytokines. A l'origine, ces molécules ont été étudiées pour leur implication dans la régulation du trafic leucocytaire. Depuis une dizaine d'années, de nombreuses études ont cependant démontré que les chimiokines sont aussi impliquées dans les différentes étapes de la cancérogénèse : inhibition de l'immunité anti-tumorale, rôle de facteur de croissance des cellules tumorales, régulation de l'angiogénèse et particulièrement induction de la migration des métastases. En effet, les chimiokines sont capables de guider les cellules métastatiques de la tumeur primaire vers leur lieu d'implantation. Ce guidage passe par la liaison de la chimiokine à son récepteur, ce qui conduit à l'activation de différentes cascades signalétiques intracellulaires qui aboutiront in fine à la migration et le guidage des cellules le long du gradient de chimiokine, et ce jusqu'au lieu d'implantation où une tumeur secondaire pourra alors se former.C'est la compréhension du rôle des chimiokines dans la migration des métastases qui a conduit à l'étude de l'expression de leurs récepteurs dans le cancer. Après avoir étudié dans un premier temps les outils nécessaires à l'obtention de résultats fiables notamment en PCR quantitative, le profil d'expression de différents récepteurs aux chimiokines a été analysé chez des patients atteints d'un cancer colorectal. Les résultats montrent que seules les expressions des récepteurs CCR10 et CXCR4 diminuent chez les patients ayant développé des métastases. De plus cette baisse est corrélée à un mauvais pronostique. Cependant, des études in vitro démontrent que les lignées coliques métastatiques surexpriment ces récepteurs, et que la migration de celles-ci est sensible à un gradient de CCL27, le ligand du récepteur CCR10.Ces résultats a priori paradoxaux prennent tout leur sens lorsqu'on rapproche le concept métastatique du concept de cellule souche. Dans les deux cas, ces types cellulaires aux capacités phénotypiques communes (migration, survie, prolifération) peuvent donner une population cellulaire hétérogène. La mise au point d'une méthode permettant de faire passer les cellules tumorales (prolifératives) en cellules métastatiques (migratoires) et vice versa nous a conduit à un concept syncrétique dans lequel les notions de cellules tumorales, de métastases et de cellules souches se confondent. Dans celui-ci, les cellules tumorales, qu'elles soient ou non issues de cellules souches saines, sont capables de changer réversiblement de phénotype pour former des métastases (équivalent de la transition épithélio-mésenchymateuse). La notion de réversibilité est ici essentielle car elle permet d'expliquer comment une cellule métastatique, une fois implantée, peut s'activer et redonner une population cellulaire tumorale proliférative. Cela implique aussi que les métastases, capables de rester plusieurs mois en dormance, partagent les mêmes mécanismes que les cellules souches.Enfin, l'étude en parallèle de nouvelles voies de régulation de l'angiogénèse - qui fournit aux métastases le moyen de quitter la tumeur primaire - faisant intervenir le récepteur à la thrombine PAR1 d'une part et la chimiokine CXCL4, plus communément appelée PF4 d'autre part, pourrait aboutir à l'élaboration de nouvelles molécules à visée thérapeutique. / Chimiokines are proteins belonging to the cytokines' family. In the beginning, chemokines were studied for their implication in the leucocytic trafic regulation. Since ten years, many studies however show that chemokines are also implied in all of carcinogenesis steps: antitumor immunity inhibition, role of growth factor of tumoral cells, angiogenesis regulation and especially metastases migration induction. Indeed, chemokines are able to guide metastatic cells from the primary tumour towards their secondary site thanks to chemokine / chemokine receptors interactions which lead to metastases migration along a chemokine gradient until their secondary site. Then, metastases activation will lead to the development of a secondary tumour.It is the understanding of chemokines' role in metastases migration that led to the study of their receptors expression in cancer. After having initially studied the tools that were necessary to obtain reliable results in particular in quantitative PCR, expression profile of several chemokine receptors was established on patients developing a colorectal cancer. Results show that only CCR10 and CXCR4 expressions significantly decrease in patients who develop metastases. Moreover this decrease is correlated with poor prognostic. However, in vitro studies show that metastatic colon cell lines overexpress the both receptors, and that migration of those cells is sensitive to a CCL27 gradient, the CCR10 ligand.These paradoxical results may however be easily explained if the metastatic concept is compared to the stem cell one. In both cases, these cellular types share phenotypical properties (migration, survival, proliferation) and are able to give a heterogeneous cellular population. The development of a protocol that turns proliferative tumoral cells into migratory metastatic ones (and vice versa) led us to a syncretic concept in which tumoral cells, metastases and stem cells notions are merging. In this concept, tumoral cells (which result or not from healthy stem cells), are able to reversibly change their phenotype to form metastases (‘epithelial-mesenchymal transition' equivalent). Reversibility is actually an essential concept because it may explain how a metastatic cell, once established, can be activated again and become a proliferative tumoral cell. That also implies that metastases, able to remain several months in dormancy, share the same mechanisms as stem cells ones.Lastly, the study of new angiogenesis regulation pathways - which provides to metastases the means of leaving the primary tumour - involving on the one hand PAR1 thrombin receptor, and on the other hand chemokine CXCL4 (also called PF4), may lead to the development of new therapeutic molecules.

O gênero Lactobacillus é o principal grupo de bactérias contaminantes em dornas de fermentação para produção de etanol em larga escala. A alta proliferação destes microrganismos prejudica a viabilidade de cepas de Saccharomyces cerevisiae selecionadas, podendo diminuir a produção de etanol nas dornas de fermentação. Os métodos mais utilizados para identificação destes microrganismos são bioquímicos e moleculares baseados na sequência do DNA, que são muito demorados, onerosos e muitas vezes remetem a resultados ambíguos. MALDI-TOF MS é uma poderosa ferramenta de identificação microbiana e foi testada neste trabalho para identificação de diferentes isolados de Lactobacillus e S. cerevisiae presentes no processo de produção de etanol. Os métodos de preparo e aplicação da amostra para aquisição espectral foram estabelecidos, tanto para bactérias quanto para leveduras. Vinte e sete isolados de Lactobacillus foram identificados pela região 16S rDNA e dois genes housekeeping, pheS e groEL e, três cepas de leveduras selecionadas do processo foram identificadas pela região ITS e 28S nr-LSU. As identificações genômicas foram contrastadas com as identificações obtidas com o perfil proteico por MALDI-TOF MS e 97% dos Lactobacillus tiveram a mesma classificação molecular que o gene pheS, eleito como o mais discriminatório, e 100% das cepas de leveduras foram classificadas como S. cerevisiae por ambas as técnicas. A técnica MALDI- TOF MS se mostrou altamente eficiente para discriminação intraespecífica de leveduras e interespecífica de Lactobacillus, não havendo apenas discriminação para isolados classificados como L. casei pelos genes housekeeping. Além disso, quando comparado o poder discriminatório da técnica MALDI-TOF MS em relação ao banco de dados espectral disponível no Biotyper e, posteriormente, ao banco de dados complementar criado neste trabalho com os microrganismos próprios do processo de produção de etanol, houve um aumento de 57 a 100% das repetições que foram identificadas ao nível de espécie com alta confiabilidade. Desta forma, os resultados deste estudo mostraram que a técnica MALDI-TOF MS pode ser utilizada como uma alternativa rápida e eficaz para identificação de Lactobacillus e Saccharomyces do processo etanólico. / The genus Lactobacillus is the main group of contaminating bacteria in fermentation tanks for large-scale ethanol production. The high proliferation of these organisms affect the viability of selected strains of Saccharomyces cerevisiae, which can reduce the production of ethanol in fermentation tanks. The most used methods for identifying these microorganisms are biochemical and molecular based on DNA sequence, which are very time-consuming, costly and often revert to ambiguous results. MALDI-TOF MS is a powerful microbial identification tool and it was tested in this work to identify different isolates of Lactobacillus and S. cerevisiae present in the ethanol production process. The sample preparation and application in the MALDI plate for spectral acquisition were established for both bacteria and yeasts. Twenty-seven isolates of Lactobacillus were identified by the 16S rDNA region and two housekeeping genes (pheS and groEL genes) and three yeast strains selected from the process were identified by the ITS and 28S nr-LSU regions. The genomic identifications were compared with the MALDI-TOF MS protein profiles and 97% of the Lactobacillus had the same molecular classification as the pheS gene, which was chosen as the most discriminatory gene, and 100% of the yeast strains were classified as S. cerevisiae by both techniques. The MALDI-TOF MS technique proved highly efficient for intraspecific yeast and interspecific discrimination of Lactobacillus, and there was no discrimination for isolates classified as L. casei by housekeeping genes. Furthermore, when compared to the discriminatory power of MALDI-TOF MS technique in relation to spectral database available on Biotyper and subsequently, the complementary database created in this work with the microorganisms themselves in the ethanol production process, there was an increase from 57 to 100% of the repetitions that were identified at the species level with high reliability. Thus, the results of this study showed that the MALDI-TOF MS technique can be used as a fast and efficient alternative for the identification of Lactobacillus and Saccharomyces of the ethanolic process.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo das proteÃnas morfogenÃticas Ãsseas (BMP-2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e seus mensageiros intracelulares (SMADs-1, 5 e 8) em folÃculos caprinos antes e apÃs cultivo por 18 dias. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia e o nÃvel de expressÃo das BMPs, receptores e SMADs, folÃculos com aproximadamente 0,2, 0,5 e 1 mm foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. AlÃm disso, folÃculos com aproximadamente 0,2 mm foram isolados e cultivados por 18 dias em meio de cultura suplementado com FSH. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de cDNA, foi realizada a quantificaÃÃo do RNAm, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (β-actina, PGK, GAPDH, β-tubulina, UBQ, RPL-19, rRNA18S), e para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15) receptores de BMPs (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8). Os resultados mostraram que β-tubulina e PGK sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos frescos prÃ-antrais e antrais caprinos. Os RNAs mensageiros para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8) sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos, sendo que a expressÃo do RNAm para BMP-4, BMP-6 e BMP-7 em folÃculos de 1 mm sÃo significativamente maiores do que em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Entretanto, os nÃveis de RNAm para BMP-2 foi reduzido em folÃculos de 1 mm, jà os nÃveis de BMP-15 nÃo diferiram entre as categorias foliculares analisadas. Os nÃveis de RNAm para BMPR-IB foram maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm, enquanto que o RNAm para BMPR-II foi significativamente maior em folÃculos de 0,5 mm do que em folÃculos de 0,2 e 1 mm. Por outro lado, nÃveis de RNAm para BMPR-1A nÃo diferiram entre folÃculos analisados. Os nÃveis de RNAm para SMAD-5 foram significativamente maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm. Contudo, folÃculos de 0,5 mm mostraram nÃveis maiores de RNAm para SMAD-8 do que folÃculos de 0,2 e 1 mm. Os nÃveis de RNAm para SMAD-1 nÃo diferiram entre os folÃculos. ApÃs as comparaÃÃes dentro de cada categoria folÃcular, BMP-15 foi mais expressa do que BMP-7 em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Em folÃculos de 0,5 mm a expressÃo do BMPR-IB foi maior do que BMPR-II. Em todas as trÃs categorias foliculares estudadas, a expressÃo da SMAD-5 foi superior a SMAD-8. ApÃs o cultivo, os folÃculos apresentaram reduÃÃo dos nÃveis de RNAm para BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA e SMAD-5. Em conclusÃo, β-tubulina e PGK sÃo os dois genes housekeeping mais estÃveis para folÃculos frescos caprinos com 0,2, 0,5 e 1 mm de diÃmetro. BMPs, seus receptores e SMADs apresentam padrÃes de expressÃo especÃficos em cada categoria folicular estudada. No entanto, em folÃculos cultivados hà uma variaÃÃo na expressÃo dos componentes do sistema BMP, diferindo da expressÃo in vivo de folÃculos com o mesmo tamanho. / The aims this study to evaluate the stability of reference genes and the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and intracellular messengers (SMADs- 1, 5 and 8) in goat follicles before and after culture for 18 days. To evaluate the stability of reference genes and the expression of BMPs, receptors and SMADs, follicles of approximately 0.2, 0.5 and 1 mm were mechanically isolated from goats ovaries. In addition, approximately 0.2 mm follicles were isolated and cultured for 18 days in culture medium supplemented with FSH. Both fresh and cultured follicles were subjected to total RNA extraction and synthesis of cDNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S) and BMPs (2, 4, 6, 7 and 15) receptors of BMPs (BMPR-IA, IB and II) and SMADs (1, 5 and 8). Results showed that β-tubulin and PGK are the most stable reference genes in goats preantral and antral follicles. The messengers RNA for BMP (2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and Smads (1, 5 and 8) are expressed at different levels in preantral and antral goats, and mRNA expression for BMP-4, BMP-6 and BMP-7 in 1-mm follicles are significantly higher than in follicles of 0.2 and 0.5 mm. However, the levels of mRNA for BMP-2 were reduced in follicles 1 mm, as BMP-15 did not differ between follicular categories. The levels of mRNA for BMPR-IB were higher in follicles of 0.2 mm than in follicles of 0.5 and 1 mm, whereas the mRNA for BMPR-II was significantly higher in follicles than 0.5 mm in follicles of 0.2 to 1 mm. Moreover, mRNA levels for BMPR-1A did not differ between follicles examined. The levels of mRNA for SMAD-5 were significantly higher in 0.2 mm follicles than in follicles of 0.5 and 1 mm. However, follicles of 0.5 mm showed higher levels of mRNA for SMAD-8 than follicles 0.2 and 1 mm. The levels of mRNA for SMAD-1 did not differ between follicles. After the comparisons within each category follicle, BMP-15 expression was higher than BMP-7 in follicles between 0.2 and 0.5 mm. Follicles 0.5 mm in the expression of BMPR-IB was greater than BMPR-II. In all three follicular categories studied, the expression of SMAD-5 was superior to SMAD-8. After culture, follicles showed reduced levels of mRNA for BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA and SMAD-5. In conclusion, β-tubulin and PGK genes are the two most stable housekeeping for fresh goat follicles 0.2, 0.5 to 1 mm in diameter. BMPs, their receptors and SMADs have specific expression patterns in each category follicular studied. However, in cultured follicles showed a variation in the variation in the expression of BMP system components, differing from in vivo expression of follicles with the same size.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2018-02-05T14:14:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ ROCHA, D. J. P. G..pdf: 4034030 bytes, checksum: 7085be9f2fda81bc8248196d4b4e6988 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T14:14:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ ROCHA, D. J. P. G..pdf: 4034030 bytes, checksum: 7085be9f2fda81bc8248196d4b4e6988 (MD5) / CNPQ / O método mais comum de normalização em ensaios de quantificação relativa da expressão gênica por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) faz uso de um gene de referência, que deve manter sua expressão estável sob diferentes condições experimentais. Em uma meta-análise da literatura e banco de dados de experimentos de análise de expressão gênica em bactérias, os genes gyrA (DNA gyrase subunidade A), gyrB (DNA gyrase subunidade B), dnaG (DNA primase), era (GTPase era) e secA (translocase proteica subunidade secA), figuram entre os mais estáveis em diversas condições experimentais. Neste cenário, este estudo se propõe a desenvolver e construir um conjunto de primers universais para esses genes de referência a partir de organismos modelo de grupos bacterianos de interesse clínico e biotecnológico. As ferramentas de alinhamento, ClustalOmega e PCR virtual, Primer-Blast foram utilizadas para encontrar regiões conservadas entre os genes candidatos em diferentes organismos bacterianos. Dentro do complexo Mycobacterium tuberculosis, todos os genes apresentaram homologia suficiente para o desenho de primers universais, enquanto que em outros grupos bacterianos a homologia de sequência foi restrita a algumas espécies. Potenciais primers universais foram desenhados para diferentes grupos bacterianos e os primers para a família Enterobacteriaceae foram validados por RT-qPCR em Escherichia coli; os resultados foram comparados contra o gene comumente usado, 16S rRNA. Os primers testados apresentaram eficiências de amplificação dentro dos limites esperados e as expressões dos genes de referência foram estáveis nas condições estudadas, tendo sido o gene dnaG o mais estável, de acordo com os softwares NormFinder e RefFinder. Conclui-se que é possível desenhar primers universais funcionais para normalização de RT-qPCR em grupos bacterianos específicos, contudo o baixo nível de conservação gênica de determinados genes pode limitar suas utilizações.

Yes / Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult stem cells with great potential in regenerative medicine. One method for stimulating proliferation and differentiation of MSCs is via electrical stimulation (ES). A valuable approach for evaluating the response of MSCs to ES is to assess changes in gene expression, relative to one or more reference genes. In a survey of 25 publications that used ES on cells, 70% selected GAPDH as the reference gene. We conducted a study to assess the suitability of six potential reference genes on an immortalized human MSC line following direct current ES at seeding densities of 5000 and 10,000 cells/cm2 . We employed three methods to validate the most stable reference genes from qRT-PCR data. Our findings show that GAPDH and ACTB exhibit reduced stability when seeded at 5000 cell/cm2 . In contrast, we found that the most stable genes across both plating densities and stimulation regimes were PPIA and YWHAZ. Thus, in ES gene expression studies in MSCs, we support the use of PPIA and YWHAZ as an optimal reference gene pair, and discourage the use of ACTB and GAPDH at lower seeding densities. However, it is strongly recommended that similar verification studies are carried out based on cell type and different ES conditions.