CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo das proteÃnas morfogenÃticas Ãsseas (BMP-2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e seus mensageiros intracelulares (SMADs-1, 5 e 8) em folÃculos caprinos antes e apÃs cultivo por 18 dias. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia e o nÃvel de expressÃo das BMPs, receptores e SMADs, folÃculos com aproximadamente 0,2, 0,5 e 1 mm foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. AlÃm disso, folÃculos com aproximadamente 0,2 mm foram isolados e cultivados por 18 dias em meio de cultura suplementado com FSH. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de cDNA, foi realizada a quantificaÃÃo do RNAm, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (β-actina, PGK, GAPDH, β-tubulina, UBQ, RPL-19, rRNA18S), e para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15) receptores de BMPs (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8). Os resultados mostraram que β-tubulina e PGK sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos frescos prÃ-antrais e antrais caprinos. Os RNAs mensageiros para as BMPs (2, 4, 6, 7 e 15), seus receptores (BMPR-IA, IB e II) e SMADs (1, 5 e 8) sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos, sendo que a expressÃo do RNAm para BMP-4, BMP-6 e BMP-7 em folÃculos de 1 mm sÃo significativamente maiores do que em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Entretanto, os nÃveis de RNAm para BMP-2 foi reduzido em folÃculos de 1 mm, jà os nÃveis de BMP-15 nÃo diferiram entre as categorias foliculares analisadas. Os nÃveis de RNAm para BMPR-IB foram maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm, enquanto que o RNAm para BMPR-II foi significativamente maior em folÃculos de 0,5 mm do que em folÃculos de 0,2 e 1 mm. Por outro lado, nÃveis de RNAm para BMPR-1A nÃo diferiram entre folÃculos analisados. Os nÃveis de RNAm para SMAD-5 foram significativamente maiores em folÃculos de 0,2 mm do que em folÃculos de 0,5 e 1 mm. Contudo, folÃculos de 0,5 mm mostraram nÃveis maiores de RNAm para SMAD-8 do que folÃculos de 0,2 e 1 mm. Os nÃveis de RNAm para SMAD-1 nÃo diferiram entre os folÃculos. ApÃs as comparaÃÃes dentro de cada categoria folÃcular, BMP-15 foi mais expressa do que BMP-7 em folÃculos de 0,2 e 0,5 mm. Em folÃculos de 0,5 mm a expressÃo do BMPR-IB foi maior do que BMPR-II. Em todas as trÃs categorias foliculares estudadas, a expressÃo da SMAD-5 foi superior a SMAD-8. ApÃs o cultivo, os folÃculos apresentaram reduÃÃo dos nÃveis de RNAm para BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA e SMAD-5. Em conclusÃo, β-tubulina e PGK sÃo os dois genes housekeeping mais estÃveis para folÃculos frescos caprinos com 0,2, 0,5 e 1 mm de diÃmetro. BMPs, seus receptores e SMADs apresentam padrÃes de expressÃo especÃficos em cada categoria folicular estudada. No entanto, em folÃculos cultivados hà uma variaÃÃo na expressÃo dos componentes do sistema BMP, diferindo da expressÃo in vivo de folÃculos com o mesmo tamanho. / The aims this study to evaluate the stability of reference genes and the expression of bone morphogenetic protein (BMP-2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and intracellular messengers (SMADs- 1, 5 and 8) in goat follicles before and after culture for 18 days. To evaluate the stability of reference genes and the expression of BMPs, receptors and SMADs, follicles of approximately 0.2, 0.5 and 1 mm were mechanically isolated from goats ovaries. In addition, approximately 0.2 mm follicles were isolated and cultured for 18 days in culture medium supplemented with FSH. Both fresh and cultured follicles were subjected to total RNA extraction and synthesis of cDNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S) and BMPs (2, 4, 6, 7 and 15) receptors of BMPs (BMPR-IA, IB and II) and SMADs (1, 5 and 8). Results showed that β-tubulin and PGK are the most stable reference genes in goats preantral and antral follicles. The messengers RNA for BMP (2, 4, 6, 7 and 15), their receptors (BMPR-IA, IB and II) and Smads (1, 5 and 8) are expressed at different levels in preantral and antral goats, and mRNA expression for BMP-4, BMP-6 and BMP-7 in 1-mm follicles are significantly higher than in follicles of 0.2 and 0.5 mm. However, the levels of mRNA for BMP-2 were reduced in follicles 1 mm, as BMP-15 did not differ between follicular categories. The levels of mRNA for BMPR-IB were higher in follicles of 0.2 mm than in follicles of 0.5 and 1 mm, whereas the mRNA for BMPR-II was significantly higher in follicles than 0.5 mm in follicles of 0.2 to 1 mm. Moreover, mRNA levels for BMPR-1A did not differ between follicles examined. The levels of mRNA for SMAD-5 were significantly higher in 0.2 mm follicles than in follicles of 0.5 and 1 mm. However, follicles of 0.5 mm showed higher levels of mRNA for SMAD-8 than follicles 0.2 and 1 mm. The levels of mRNA for SMAD-1 did not differ between follicles. After the comparisons within each category follicle, BMP-15 expression was higher than BMP-7 in follicles between 0.2 and 0.5 mm. Follicles 0.5 mm in the expression of BMPR-IB was greater than BMPR-II. In all three follicular categories studied, the expression of SMAD-5 was superior to SMAD-8. After culture, follicles showed reduced levels of mRNA for BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPR-IA and SMAD-5. In conclusion, β-tubulin and PGK genes are the two most stable housekeeping for fresh goat follicles 0.2, 0.5 to 1 mm in diameter. BMPs, their receptors and SMADs have specific expression patterns in each category follicular studied. However, in cultured follicles showed a variation in the variation in the expression of BMP system components, differing from in vivo expression of follicles with the same size.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi o de avaliar o efeito do FSH sozinho ou em combinaÃÃo com a ativina-A na sobrevivÃncia, crescimento e expressÃo de RNAm para ActR- IB, ActR-IIB, FSH-R, PCNA e HAS1/2/3 em folÃculos secundÃrios de bovinos cultivados in vitro por 18 dias. FolÃculos prÃ-antrais (~0,2mm) foram isolados do cÃrtex de ovÃrios bovinos e cultivados individualmente na ausÃncia- &#945;-MEM+ (grupo controle) ou na presenÃa de ativina-A sozinha na concentraÃÃo de (100ng/mL); FSH sozinho em concentraÃÃes seriadas - 50ng/mL (do dia 0 ao dia 6), 100 ng/mL (do dia 7 ao dia 12), e 200ng/mL (do dia 13 ao dia 18) ou em associaÃÃo com a ativina-A nas mesmas concentraÃÃes. ApÃs 18 dias de cultivo in vitro, folÃculos cultivados com FSH apresentaram aumento significativo no diÃmetro em comparaÃÃo aos demais tratamentos. Por outro lado, a ativina- A sozinha nÃo induz o crescimento folicular comparado ao grupo controle. AlÃm disso, quando combinada com FSH, a ativina-A inibiu o crescimento folicular promovido pelo FSH. Ao final de 18 dias de cultivo, todos os tratamentos apresentaram a formaÃÃo de antro embora sem diferenÃas significativas entre os tratamentos. A anÃlise ultra-estrutural confirmou a integridade dos folÃculos cultivados em FSH apÃs 18 dias de cultivo. FolÃculos cultivados na presenÃa de ativina-A associada ao FSH, reduziram significativamente (p <0,05) os nÃveis de RNAm para ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R e PCNA. AlÃm disso, em folÃculos cultivados com FSH sozinho, os nÃveis de RNAm para HAS1 e HAS 2 foram significativamente maiores (p<0,05) que em folÃculos cultivados com ativina-A em associaÃÃo ao FSH. Ademais, o nÃvel de expressÃo do RNAm para HAS-3 nÃo diferiu (p>0,05) entre os tratamentos. Em conclusÃo, a ativina-A à importante para o desenvolvimento folicular inicial (atà 6 dias), mas reduz o efeito estimulatÃrio do FSH em folÃculos prÃ-antrais bovinos apÃs 18 dias de cultivo in vitro. Nossos resultados apontam que o FSH à um fator chave para a sobrevivÃncia e crescimento de folÃculos prÃ-antrais cultivados in vitro por um longo perÃodo (18 dias). AlÃm disso, ativina-A em associaÃÃo ao FSH reduz os nÃveis de RNAm para o receptor de ativina do tipo IB (ActR-IB), tipo II-B (ActR-IIB), FSH-R e PCNA, apÃs 18 dias in vitro. Em adiÃÃo, folÃculos cultivados em meio suplementado com FSH sozinho, apresentaram nÃveis de expressÃo de RNAm para HAS-1 e HAS-2 maiores que em folÃculos cultivados em meio suplementado pela associaÃÃo de ativina-A e FSH. / The aim of this study was to evaluate the effect of FSH alone or in combination with activin-A on survival, growth and expression of mRNA for ActR- IB, ActR- IIB, FSH-R, PCNA, and HAS1/2/3 in bovine secondary follicles cultured in vitro for 18 days. Preantral follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of bovine ovaries and individually cultured in the absence (control medium) or presence of activin-A alone at concentrations of (100ng/mL); FSH alone in increased concentrations - 50ng/mL (from day 0 to day 6), 100ng/mL (from day 7 to day 12), and 200ng/mL (from day 13 to day 18) or in association with activin-A in the same concentrations. After 18 days in vitro, follicles cultured with FSH showed a significant increase in diameter compared to the other treatments. On the other hand, the activin-A alone did not increase follicular diameter compared to control medium. Moreover, when combined with FSH, activin-A inhibited the growth promoted by FSH. At the end of 18 days of culture, all treatments presented antrum formation but without difference between treatments. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of follicles cultured in FSH after 18 days. Follicles cultured in the presence of activin-A in association with FSH significantly reduced (P<0.05) levels of mRNA for ActR-IB, ActR-IIB, FSH-R and PCNA. Moreover, in follicles cultured with FSH alone, levels of mRNA for HAS 1 and HAS 2 were significantly higher (P<0.05) that in follicles cultured with activin-A in association with FSH. In addition, the level of mRNA expression for HAS-3 did not differ (P> 0.05) between treatments. In conclusion, activin-A is important for early follicular development (up to 6 days), but reduces the stimulatory effect of FSH on bovine preantral follicles after 18 days of culture in vitro. Our results also indicate that FSH is a key factor for survival and growth of bovine preantral follicles cultured in vitro for a long period (18 days). Moreover, activin-A in combination with FSH reduce the levels of mRNA for activin receptor type IB (ActR-IB), type II-B (ActR-IIB), FSH-R and PCNA after 18 days in vitro. In addition, follicles cultured in medium supplemented with FSH alone levels of mRNA for HAS-1 and HAS-2 were higher than in follicles cultured in medium supplemented by the association of activin-A and FSH.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / O boto cinza, Sotalia fluviatilis, à uma espÃcie de cetÃceo costeira ameaÃada pela pesca artesanal, sendo necessÃrio um estudo da biologia reprodutiva, para a administraÃÃo e conservaÃÃo das populaÃÃes que estÃo sujeitas à mortalidade por aÃÃo antrÃpica. O estudo de folÃculos prÃ-antrais in situ permite uma melhor compreensÃo da fase prÃ-antral da foliculogÃnese, pouco conhecida nos cetÃceos em geral, e totalmente desconhecida em S. fluviatilis. A anÃlise quantitativa de folÃculos prÃ-antrais foi realizada enm ovÃrios de S. fluviatilis recuperados na costa do Cearà entre 1997-1999. A idade dos exemplares em estudo variou de 0 a 23 anos, com idade de maturaÃÃo sexual acima de 6 anos. A populaÃÃo folicular prÃ-antral analisada, apresentou-se totalmente degenerada, possivelmente em decorrÃncia do tempo âpÃs-mortemâ. Ainda assim, foram observadas diferenÃas significativas entre os estÃgios de maturaÃÃo sexual, onde animais imaturos apresentaram uma mÃdia de 1.162.460 folÃculos, enquanto os exemplares maturos apresentaram em mÃdia 66.270 folÃculos. Em relaÃÃo a posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio foi observado que, em mÃdia, o ovÃrio esquerdo apresentou um nÃmero mais elevado de folÃculos quando comparado ao lado direito. Essa diferenÃa foi significativa somente para animais imaturos. NÃo houve uma diferenÃa significativa com relaÃÃo ao peso do ovÃrio direito e esquerdo dos exemplares imaturos e maturos. O nÃmero de folÃculos apresentou uma relaÃÃo uma relaÃÃo negativa com a idade e peso do ovÃrio, embora o peso tenha apresentado uma relaÃÃo positiva com a idade. Tais resultados mostraram que a populaÃÃo folicular de S. fluviatillis pode ser afetada por diversos fatores, entre eles estÃgio reprodutivo, idade, peso ovariano e posiÃÃo anatÃmica do ovÃrio. Os dados quantitativos da foliculogÃnese descrito neste trabalho poderÃo servir como parÃmetro para futuros estudos in vivo ou in vitro da foliculogÃnese em S. fluviatilis. Desta forma, novas informaÃÃes acerca dos folÃculos prÃ-antrais de S. fluviatilis poderÃo ser obtidos, gerando oportunidade para a realizaÃÃo de novas pesquisas, visando a elucidaÃÃo da foliculogÃnese da fase prÃ-antral na espÃcie, o que contribuirà no futuro para um melhor aproveitamento do seu potencial oocitÃrio. / Tucuxi, Sotalia fluviatilis, a coastal cetacean species threatened by artisanal fishing, needs a reproductive biology study in order to manage and preserve the populations subject to mortality for antropic action. A in situ of the preantral follicles allows a better understanding of the preantral phase of the folliculogenesis, little known in cetaceans and totally unknown in S. fluviatilis. Quantitative analysis of the preantral follicle was made in ovarian of S. fluviatilis recovered on the Ceara coast between 1997-1999. The age of the studied sample varied from 0 to 23 years, being sexual maturation above 6 years. The population preantral follicular analysed, was completely degenerate, possibly because of âpos-mortenâ time. Even so, significant difference were observed among sexual maturation stage, whwere immature animals showed na averege of 1.162.460 follicles, while in matures animals the averege was 66.270 follicles. Due to anatomic position of the ovarian, it was observed that the left ovarian had a higher number of follicles when compared to the right one. This difference was significant only for immature animals. There wasnât a significant difference related to weight of right and left ovarian of mature and imature sample. Number of follicles showed a negative relation with age and weight of the ovarian, although weight had a positive relation with age. These results indicate that the population follicular fo S. fluviatilis may be affected by many factors such as: reproductive stage, age, ovarian weight and anatomical position of the ovary. Quantitative data of the foliculogenisis described can be used as a parameter for future studies in vitro or in vivo of the folliculogenisis of S. fluviatilis. From this, new information about preantral follicles of S. fluviatilis can be acquired, leading to new reserch to explain the folliculogenese of preantral follicles phase of the species, contributing to a better utilization of oociterio potencial.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da artrite encefalite caprina (CAE) sobre a expressÃo de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos ovarianos, bem como os efeitos de fitohemaglutinina (PHA) e EGF na sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais, e na expressÃo de genes para o sistema de TNF-&#945; no tecido ovariano cultivado caprino. Os nÃveis de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios e secundÃrios, bem como em CCOs e parede folicular de folÃculos antrais foram avaliados por PCR em tempo real (experimento 1). Para os estudos in vitro, fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por seis dias em &#945;-MEM sozinho ou suplementado com EGF (100ug), PHA (10&#956;g/mL) ou ambos (experimento 2). Antes e depois do cultivo, o tecido ovariano foi processado para anÃlise morfolÃgica ou armazenado para avaliar a expressÃo de RNAm para TNF-&#945; e seus receptores. Os resultados mostraram que a expressÃo de BMP-15 e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios de cabras infectadas foram significativamente maiores do que em animais saudÃveis, mas a expressÃo de GDF-9 em folÃculos secundÃrios de cabras infectadas foi significativamente menor. AlÃm disso, a expressÃo de RNAm para BMP-15 na parede folicular de folÃculos antrais de cabras infectadas foi significativamente maior do que em cabras saudÃveis. ApÃs o cultivo dos fragmentos ovarianos em todos os meios testados, observou-se a reduÃÃo nos percentuais de folÃculos primordiais, e aumento de folÃculos em desenvolvimento quando comparado ao grupo controle nÃo cultivado. AlÃm disso, houve um aumento significativo no diÃmetro folicular apÃs cultivo em meio suplementado com EGF. ApÃs o cultivo de tecido ovariano de cabras infectadas em meio suplementado com PHA, os folÃculos primordiais apresentavam diÃmetros maiores do que os de animais saudÃveis. AlÃm disso, observou-se um aumento nos nÃveis de RNAm para TNF-&#945; apÃs cultivo de tecido ovariano na presenÃa de ambos EGF e PHA em animais saudÃveis, mas este mesmo tratamento proporcionou uma reduÃÃo de RNAm para TNF-&#945; e aumento dos transcritos de TNFR-II em animais infectados. Pode-se concluir que a CAE influencia a expressÃo de RNAm para BMP-15 e GDF-9 em folÃculos ovarianos caprinos e a PHA e o EGF diferencialmente regulam a expressÃo de TNF-&#945; e TNFR-II em tecidos ovarianos. / This study aims to investigate the effects of caprine arthritis encephalitis (CAE) on the expression of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in ovarian follicles, as well as the effects of phytohemagglutinin (PHA) and EGF on the survival and activation of primordial follicles, and on expression of mRNA for TNF-&#945; and its receptors in cultured goat ovarian tissue. The levels of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in primordial/primary and secondary follicles, as well as in COCs and follicular walls from antral follicles were evacuated by real-time PCR (experiment 1). Ovarian tissues were cultured for six days in &#945;-MEM+ alone or supplemented with EGF (100Âg/mL), PHA (10Âg/mL) or both (experiment 2). Before and after culture, ovarian fragments were processed for morphological analysis or stored to evaluate the expression of mRNA for TNF&#945; and its receptors. The results showed that the expression of BMP-15 and GDF-9 in primordial/primary follicles from infected goats was significantly higher than in health animals, but the expression of GDF-9 in secondary follicles from infected goats was significantly lower. Additionally, the expression of mRNA for BMP-15 in follicular wall of antral follicles from infected goats was significantly higher than in healthy goats. After culturing ovarian fragments in all tested media, reduced percentages of primordial follicles, and increased of developing follicles was observed when compared to uncultured control. Furthermore, there was a significant increase in follicular diameter after culture in medium supplemented with EGF. Ovarian tissue from infected goats cultured in medium supplemented with PHA had primordial follicles with higher diameters than those from healthy animals. An increase in the levels of mRNAs for TNF-&#945; was observed after culturing ovarian tissue in presence of both EGF and PHA in healthy animals, but this same treatment promoted a reduction of mRNAs for TNF-&#945; and and increase of TNFR-II transcripts in infected animals. In conclusion, CAE influences the expression of mRNA for BMP-15 and GDF-9 in goat ovarian follicles and PHA and EGF differentially regulate the expression of TNF&#945; and TNFR-II in cultured ovarian tissue.