Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-10-10T18:16:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 13406581 bytes, checksum: 15d4117957a92e914ab43a5c6615e1ba (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-10T18:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 13406581 bytes, checksum: 15d4117957a92e914ab43a5c6615e1ba (MD5) Previous issue date: 2000-03-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A mancha-angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola (Saco) Ferraris, é atualmente uma das principais doenças do feijoeiro no Brasil. O patógeno apresenta alta variabilidade, e o desenvolvimento de novas variedades depende da identificação de novas fontes de resistência. Trabalhos recentes têm demonstrado a alta diversidade genética desse patógeno e a sua co-evolução com os grupos Andino e Mesoamericano de feijoeiro. Trabalhos acerca da herança da resistência a P. griseola têm evidenciado uma herança monogênica dominante em alguns casos e recessiva em outros. Os objetivos dessa série de estudos foram investigar a diversidade genética de P. griseola, determinar a herança da resistência e identificar marcadores RAPD e SCAR ligados ao gene de resistência à mancha-angular no cruzamento entre Rudá e Cornell 49-242. Para avaliar a diversidade genética de isolados de P. griseola coletados no Estado de Minas Gerais e em diversos estados brasileiros. foi utilizada uma série diferenciadora composta de 12 variedades de feijão e marcadores RAPD. Os estudos acerca da diversidade genética confirmaram a 17 raças fisiológicas. O patótipo 63.31 foi a raça que agrupou o maior numero de isolados, estando distribuída em quatro das cinco regiões amostradas. Apenas um isolado apresentou reação de compatibilidade com todos os genótipos da série diferenciadora e foi classificado como do patótipo 63.63, o que indicou a necessidade de inclusão de novos genótipos na série diferenciadora. Por meio do uso do primer OPAA 11 e dos dados do fenótipo de virulência, determinou-se a presença do acervo Mesoamericano no Estado de Minas Gerais. Foram estudados 39 isolados provenientes de diversos estados brasileiros, tendo sido identificados 20 patótipos. Além da determinação da diversidade genética, foram testadas nove potenciais fontes de resistência. 0 cultivar México 54 evidenciou-se como o mais resistente, apresentando reação de incompatibilidade a 20 das 25 raças testadas. Os cultivares AND 277, MAR 2, Cornell 49-242, Bat 332 e G 5686 também se destacaram como boas fontes de resisténcia. O cultivar Rudá foi suscetível à maioria dos isolados testados. Os resultados do estudo de herança indicaram a presença de um gene dominante controlando a resistência à mancha-angular no cultivar Cornell 49-242. Foram mapeados dois marcadores RAPD (OPNOZ 890 e OPEO4 650) ligados em fase de acoplamento a 3,2 e 12,5 CM do gene de resistência. 0 fragmento NOOZ 890 foi transformado em um marcador do tipo SCAR. Foi proposta a designação Phg-2 para o gene de resistência presente no cultivar Cornell 49-242. As análises efetuadas na série diferenciadora indicaram que alguns genótipos não são bons diferenciadores da mancha-angular. Fatores experimentais podem estar contribuindo para uma classificação incorreta dos patótipos de P. griseola. / Angular leaf spot, caused by fungus Phaeoisariopsis griseola (Saco) Ferraris, is one of the most important bean disease in Brazil. The pathogen has demonstrated to be highly variable and breeding programs dependent on the identification of new resistance genes to develop resitant cultivars. Recent studies demonstrated a high genetic diversity of this pathogen and its co- evolution with the Andean and Mesoamerican common bean groups. Several works has demonstrated that resistance to this pathogen has been attributed to one gene, sometimes dominant or recessive. The objective of this study were to determinate the inheritance of the resistance and to identify RAPD and SCARs markers linked to angular leaf spot resistance gene in the cross between Cornell 49 -2424 and Ruda, and to assay the genetic diversity P. griseola isolates from the state of Minas Gerais and from others Brazilian states. A differential series composed of 12 bean varieties and RAPD markers were used. Out of 49 isolates tested in Minas Gerais state, 17 races were identified. Race 63.31 grouped the greatest number of isolates. being distributed in four of the five studied regions. The virulence phenotypes showed a high virulence of the isolates. One isolate presented a reaction of compatibility with all genotypes of the differential series and was classified as being from race 63.63, wich suggest the introduction of the new genotypes in the series. The use of OPAA 11 primer and differential series, suggest the group mesoamerican in Minas Gerais state presence. The genetic diversity of 39 P. griseo/a isolates from the seven brasilian states were studied. The results confirmed a variability of the pathogen in Brazil: in 30 isolates tested, 20 phisiological races were obtained. In this study, not only the determination of the races was carrie out, but also nine potential resistance sources were tested. The results confirmed a variability of the pathogen in Mlnas Gerais state and in Brazil. The Mexico 54 cultivar was the most resistant, pressenting incompatibility reaction to 20 of the 25 races tested. AND 277, MAR-2, Cornell 49-242, BAT 332 and (55686 cultivars were good resistance sources. The cultivar Rudá, type, was susceptible to most of the isolates. In the inheritance study, the results indicated that a single gene dominant controls resistance in Cornell 49-242. Two RAPD markers were mapped OPNo2 ago and OPEO4 650 in coupling phase at 3.2 and 12.5 CM from the resistance gene. The No02 890 fragment was transformed into a SCAR marker and we proposed the designation Phg-2 for the angular leaf spot resistance gene in cultivar Cornell 49-242. The use of RAPD markers and the characterization of the pathotypes of P. griseola indicate the necessity of the substitution of some genotypes and the standardization of the protocols and methodologies related to the characterization of the genetic variability of P. griseola.

Brachiaria é um gênero de forrageiras da família Poaceae que apresenta plantas que se reproduzem por via sexual e assexualmente por apomixia,reprodução por sementes. A apomixia desperta interesse biológico e biotecnológico, pela perspectiva de levar esta característica de clonagem de plantas via sementes, a outras espécies. As cultivares plantadas de B. brizantha cv. Marandu e B. decumbens cv. Basilisk são poliplóides e reproduzem-se por apomixia, enquanto as plantas sexuais são diplóides,o que inviabiliza os cruzamentos, dificultando sobremaneira o melhoramento. A transformação genética é uma estratégia que vem sendo incorporada ao melhoramento genético. A natureza apomítica destasplantas pode permitir a clonagem e estabilidade das plantas transgênicas. Para transformação genética é necessário o desenvolvimento de um método eficiente de regeneraçãoin vitro. B. brizantha é considerada recalcitrante a cultura de tecidos, e métodos eficientes associados com os sistemas de transformação genética ainda não foram descritos na literatura. O arroz (Oryza sativa) é uma Poaceae modelo para estudos de genética inversa, no entanto, cultivares tropicais do grupo japônica são recalcitrantes a transformação genética, como é o caso da cultivar Primavera. O método direto de transformação genética mais amplamente utilizado é a biobalística, e vem sendo aplicado em espécies de monocotiledôneas, uma vez que essas não são hospedeiros naturais de Agrobacterium tumefaciens. No entanto, vários fatores tem sido testados no sentido de favorecer a interação e transferência de genes durante a cocultura para obtenção de transgênicos em diversas espécies de monocotiledôneas. Os objetivos deste estudo foram obter sistemas de regeneração in vitro deB. Brizanthae de arroz cultivar Primavera para transformação genética destas espécies. Em B. brachiaria foram obtidos sistema de micropropagação, organogênese, calos embriogênicos, unidades embriogênicas e suspensões celulares, e para a cultivar Primavera de arroz foram obtidas unidades embriogênicas, que foram caracterizadas morfo-anatomicamente e quanto as condições de indução, multiplicação e regeneração in vitro. Métodos de expressão transiente e estável de genes marcadores foram estabelecidos para B brizantha via biobalística e Agrobacterium tumefaciens. A natureza da transgenia foi confirmada por métodos histoquímico e molecular como PCR e Southern blot. Os sistemas de regeneração e transformação obtidos mostraram-se eficientes e irão contribuir para os estudos da apomixia e introdução de genes de interesse em braquiária / Brachiaria is a genus of Poaceae family forage grass that reproduces by sexual and asexually by apomixis. Apomixis is of biological and biotechnological interest awakened by the prospect of bringing this feature of cloning plants through seed to other species. B. brizantha cv. Marandu and B. decumbens cv. Basilisk are polyploid and reproduce by apomixis, while the sexual plants are diploid, which makes the crosses, greatly hindering the improvement. Genetic transformation is a strategy that is being incorporated into breeding programs. The nature of these apomictic plants may allow the cloning and the stability of transgenic plants. For genetic transformation is necessary to develop an efficient method of in vitro regeneration. B. brizantha is considered recalcitrant to tissue culture, and efficient methods associated with the genetic transformation systems have not been described in the literature. Rice (Oryza sativa) is a Poaceae model for studies of reverse genetics; however, tropical cultivars from japonica group are recalcitrant to genetic transformation, such as Primavera cultivar. Biolistic is the genetic transformation direct method most widely used, and has been applied to species of monocots, since these are not natural hosts of Agrobacterium tumefaciens. However, several factors have been tested in order to promote interaction and gene transfer during coculture for obtaining transgenics in several monocots species. The objectives of this study were to obtain in vitro regeneration and genetic transformation systems for these species. In B. Brachiaria systemsfor micropropagation, organogenesis, embryogenic units and embryogenic cell suspensions were obtained, and forrice Primavera cultivar embryogenic units were obtained, which was morpho-anatomical characterized and in vitro induction, proliferation and regeneration conditions established. Methods for transient and stable gene expression have been acquired for B. brizanthavia biolistic and Agrobacterium tumefaciens. The nature of the embryogenic callus and transgenic plants was confirmed by histochemical and molecular methods such as PCR and Southern blot. The regeneration and transformation systems showed to be effective and will contribute to apomixis studies and introduction of genes of interest in B. brizantha

Brachiaria é um gênero de forrageiras da família Poaceae que apresenta plantas que se reproduzem por via sexual e assexualmente por apomixia,reprodução por sementes. A apomixia desperta interesse biológico e biotecnológico, pela perspectiva de levar esta característica de clonagem de plantas via sementes, a outras espécies. As cultivares plantadas de B. brizantha cv. Marandu e B. decumbens cv. Basilisk são poliplóides e reproduzem-se por apomixia, enquanto as plantas sexuais são diplóides,o que inviabiliza os cruzamentos, dificultando sobremaneira o melhoramento. A transformação genética é uma estratégia que vem sendo incorporada ao melhoramento genético. A natureza apomítica destasplantas pode permitir a clonagem e estabilidade das plantas transgênicas. Para transformação genética é necessário o desenvolvimento de um método eficiente de regeneraçãoin vitro. B. brizantha é considerada recalcitrante a cultura de tecidos, e métodos eficientes associados com os sistemas de transformação genética ainda não foram descritos na literatura. O arroz (Oryza sativa) é uma Poaceae modelo para estudos de genética inversa, no entanto, cultivares tropicais do grupo japônica são recalcitrantes a transformação genética, como é o caso da cultivar Primavera. O método direto de transformação genética mais amplamente utilizado é a biobalística, e vem sendo aplicado em espécies de monocotiledôneas, uma vez que essas não são hospedeiros naturais de Agrobacterium tumefaciens. No entanto, vários fatores tem sido testados no sentido de favorecer a interação e transferência de genes durante a cocultura para obtenção de transgênicos em diversas espécies de monocotiledôneas. Os objetivos deste estudo foram obter sistemas de regeneração in vitro deB. Brizanthae de arroz cultivar Primavera para transformação genética destas espécies. Em B. brachiaria foram obtidos sistema de micropropagação, organogênese, calos embriogênicos, unidades embriogênicas e suspensões celulares, e para a cultivar Primavera de arroz foram obtidas unidades embriogênicas, que foram caracterizadas morfo-anatomicamente e quanto as condições de indução, multiplicação e regeneração in vitro. Métodos de expressão transiente e estável de genes marcadores foram estabelecidos para B brizantha via biobalística e Agrobacterium tumefaciens. A natureza da transgenia foi confirmada por métodos histoquímico e molecular como PCR e Southern blot. Os sistemas de regeneração e transformação obtidos mostraram-se eficientes e irão contribuir para os estudos da apomixia e introdução de genes de interesse em braquiária / Brachiaria is a genus of Poaceae family forage grass that reproduces by sexual and asexually by apomixis. Apomixis is of biological and biotechnological interest awakened by the prospect of bringing this feature of cloning plants through seed to other species. B. brizantha cv. Marandu and B. decumbens cv. Basilisk are polyploid and reproduce by apomixis, while the sexual plants are diploid, which makes the crosses, greatly hindering the improvement. Genetic transformation is a strategy that is being incorporated into breeding programs. The nature of these apomictic plants may allow the cloning and the stability of transgenic plants. For genetic transformation is necessary to develop an efficient method of in vitro regeneration. B. brizantha is considered recalcitrant to tissue culture, and efficient methods associated with the genetic transformation systems have not been described in the literature. Rice (Oryza sativa) is a Poaceae model for studies of reverse genetics; however, tropical cultivars from japonica group are recalcitrant to genetic transformation, such as Primavera cultivar. Biolistic is the genetic transformation direct method most widely used, and has been applied to species of monocots, since these are not natural hosts of Agrobacterium tumefaciens. However, several factors have been tested in order to promote interaction and gene transfer during coculture for obtaining transgenics in several monocots species. The objectives of this study were to obtain in vitro regeneration and genetic transformation systems for these species. In B. Brachiaria systemsfor micropropagation, organogenesis, embryogenic units and embryogenic cell suspensions were obtained, and forrice Primavera cultivar embryogenic units were obtained, which was morpho-anatomical characterized and in vitro induction, proliferation and regeneration conditions established. Methods for transient and stable gene expression have been acquired for B. brizanthavia biolistic and Agrobacterium tumefaciens. The nature of the embryogenic callus and transgenic plants was confirmed by histochemical and molecular methods such as PCR and Southern blot. The regeneration and transformation systems showed to be effective and will contribute to apomixis studies and introduction of genes of interest in B. brizantha

ResumenEn esta tesis se ha optimizado un protocolo de regeneración a partir de material varietal de 'Helena' y 'Canino'. Mediante el estudio de los diversos factores que afectan la transformación de material adulto, se ha establecido por primera vez un protocolo eficiente de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de una variedad comercial de albaricoquero.El diseño de una estrategia de selección gradual con paromomicina ha permitido la regeneración de plántulas transformadas con los genes marcadores nptII y sgfp o gus, con las eficiencias más elevadas que se han publicado hasta el momento para transformar material varietal en especies del género Prunus, aunque la baja viabilidad de las yemas transformadas redujo el número final de plantas obtenidas.El protocolo establecido en esta tesis sienta las bases que permitirán la introducción de genes de interés agronómico y comercial, modificando de manera discreta variedades élite aceptadas y establecidas en el mercado. / In this thesis a protocol of regeneration has been optimized from leaf explants of the cultivars 'Helena' and 'Canino'. By means of the study of the diverse factors that affect the transformation of adult material, an efficient protocol of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation has been established for the first time for a commercial cultivar of apricot.The design of a gradual selection strategy with paromomycin has permitted the regeneration of transformed shoots with the marker genes nptII and sgfp or gus, with the highest efficiencies that have been published up to now from adult material in Prunus, although the low viability of the transformed buds reduced the final number of plants obtained. This protocol establishes the bases that will permit the introduction of agronomic and commercial interesting genes, modifying discreetly commercial cultivars accepted and established in the market.