Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Schweine im Bestand und auf dem Schlachthof, Schlachttierkörper und Lebern sowie Hackfleisch vom Schwein und Schweinefleisch aus dem Handel wurden auf das Vorkommen von thermophilen Campylobacter spp. untersucht. Zusätzlich wurden Putenkarkassen auf einem Putenschlachthof und Hähnchen- und Putenfleischerzeugnisse aus dem Handel mit in die Untersuchung einbezogen. Die in den Proben gefundenen Campylobacter-Isolate wurden zuerst phänotypisch charakterisiert, anschließend erfolgte eine genotypische Feindifferenzierung durch zwei molekularbiologische Fingerprintingmethoden (AFLP-Typisierung und FLA-Typing). Durch den Vergleich der Isolate untereinander und mit humanen Campylobacter-Isolaten sollten epidemiologische Zusammenhänge geklärt und die Bedeutung von Geflügel- und Schweinefleisch als Infektionsquelle für den Menschen aufgezeigt werden. / Faeces of pigs at the farm and the slaughterhouse, pig carcasses, livers, minced meat and porc from retail were investigated for the occurence of thermophilic Campylobacter spp. Turkey carcasses at a turkey slaughterhouse and chicken and turkey products from retail were also included in this investigation. First the Campylobacter isolates found in the samples were characterized phenotypically, afterwards they were typed with two molecularbiological fingerprinting methods (AFLP- and FLA-Typing). The comparison of the isolates with human isolates should give answers to epidemiological questions and the importance of poultry and porc as a source of infection for humans.

Plasma- und Serumproben waren in früheren epidemiologischen Studien häufig das einzige biologische Material, das gesammelt und untersucht wurde. Diese Studien besitzen gerade durch ihren sehr langen Untersuchungszeitraum einen riesigen Informationsgehalt und wären ein unbezahlbarer Schatz für genetische Analysen. Oft ist aufgrund damals mangelnder Akquirierung jedoch keine genomische DNA verfügbar. Um die in Plasmaproben in geringer Menge vorkommende DNA verwenden zu können, extrahierten wir die DNA mit Hilfe von magnetischen Partikeln und setzten sie in eine Whole Genome Amplification (WGA) mittels Φ29-DNA-Polymerase ein. Wir stellten 88 Probenpärchen, bestehend aus einer WGA-Plasma-DNA und der korrespondierenden Vollblut-DNA derselben Person, zusammen und genotypisierten bei diesen neun hochpolymorphe Short Tandem Repeats (STR) und 25 SNPs. Die durchschnittliche innerhalb der Probenpaare auftretende Diskordanzrate betrug 3,8% für SNPs sowie 15,9% für STRs. Basierend auf den Ergebnissen der Hälfte der Probenpaare entwickelten wir einen Ausschlussalgorithmus und validierten diesen in der anderen Hälfte der Probenpaare. Mit diesem ist es möglich, zum Einen diejenigen Proben mit einer guten DNA-Qualität herauszufiltern, um Genotypisierungsfehler zu vermeiden, und zum Anderen jene Proben mit insuffizienter DNA-Qualität auszuschließen. Nachdem Proben, die fünf oder mehr homozygote Loci in dem 9-STR-Markerset aufwiesen, ausgeschlossen wurden, resultierte dies in einer Ausschlussrate von 22,7% und senkte die durchschnittliche Diskordanzrate auf 3,92% für STRs bzw. 0,63% für SNPs. Bei SNPs entspricht dieser Wert ungefähr der Fehlerquote, wie er auch bei Genotypisierungen mit Vollblut-DNA in vielen Laboratorien auftritt. Unsere Methode und das Ausschlusskriterium bieten damit neue Möglichkeiten, um zuverlässige DNA aus archivierten Plasmaproben wiederzugewinnen. Dieser Algorithmus ist auch besser geeignet, als nur die eingesetzte DNA-Menge in die WGA-Reaktion als Kriterium zu benützen. / Plasma and serum samples were often the only biological material collected for earlier epidemiological studies. These studies have a huge informative content, especially due to their long follow-up and would be an invaluable treasure for genetic investigations. However, often no banked DNA is available. To use the small amounts of DNA present in plasma, in a first step, we applied magnetic bead technology to extract this DNA, followed by a whole-genome amplification (WGA) using phi29-polymerase. We assembled 88 sample pairs, each consisting of WGA plasma DNA and the corresponding whole-blood DNA. We genotyped nine highly polymorphic short tandem repeats (STRs) and 23 SNPs in both DNA sources. The average within-pair discordance was 3.8% for SNPs and 15.9% for STR genotypes, respectively. We developed an algorithm based on one-half of the sample pairs and validated on the other one-half to identify the samples with high WGA plasma DNA quality to assure low genotyping error and to exclude plasma DNA samples with insufficient quality: excluding samples showing homozygosity at five or more of the nine STR loci yielded exclusion of 22.7% of all samples and decreased average discordance for STR and SNP markers to 3.92% and 0.63%, respectively. For SNPs, this is very close to the error observed for genomic DNA in many laboratories. Our workflow and sample selection algorithm offers new opportunities to recover reliable DNA from stored plasma material. This algorithm is superior to testing the amount of input DNA.

In rheumatoid arthritis (RA), a key event is infiltration of inflammatory immune cells into the synovial lining, possibly aggravated by dysregulation of cellular adhesion molecules. Therefore, single nucleotide polymorphisms of 14 genes involved in cellular adhesion processes (CAST, ITGA4, ITGB1, ITGB2, PECAM1, PTEN, PTPN11, PTPRC, PXN, SELE, SELP, SRC, TYK2, and VCAM1) were analyzed for association with RA. Association analysis was performed consecutively in three European RA family sample groups (Nfamilies = 407). Additionally, we investigated differential allelic expression, a possible functional consequence of genetic variants. SELP (selectin P, CD62P) SNP-allele rs6136-T was associated with risk for RA in two RA family sample groups as well as in global analysis of all three groups (ptotal = 0.003). This allele was also expressed preferentially (p,1026) with a two- fold average increase in regulated samples. Differential expression is supported by data from Genevar MuTHER (p1 = 0.004; p2 = 0.0177). Evidence for influence of rs6136 on transcription factor binding was also found in silico and in public datasets reporting in vitro data. In summary, we found SELP rs6136-T to be associated with RA and with increased expression of SELP mRNA. SELP is located on the surface of endothelial cells and crucial for recruitment, adhesion, and migration of inflammatory cells into the joint. Genetically determined increased SELP expression levels might thus be a novel additional risk factor for RA.

Campylobacter (C.) spp. und Yersinia (Y.) enterocolitica sind in Deutschland nach den Salmonellen die häufigsten Erreger der Enteritis infectiosa. Das Schwein wird als Reservoirtier für C. coli und Y. enterocolitica Bioserovar 4/O:3 angesehen. Da diese Infektionen beim Schwein zumeist klinisch inapparent verlaufen, sind sie bei der Schlachttier- und Fleischuntersuchung nicht feststellbar. Die Erreger können somit unerkannt in die Lebensmittelkette gelangen. In dieser Arbeit sollte ein Beitrag zur Epidemiologie dieser Erreger geleistet werden. Dazu wurden Prävalenzdaten in Betrieben und zum Schlachtzeitpunkt erhoben, Eintragungsquellen gesucht und genotypische Vergleiche durchgeführt. Im Zeitraum von Mai 2002 bis März 2004 wurden in vier verschiedenen Betrieben Verlaufsuntersuchungen zum Vorkommen dieser beiden Erreger durchgeführt. Dafür wurden Schweine von ihrer Geburt bis zur ihrer Schlachtung verfolgt. In drei dieser vier Betriebe wurden die Schweine konventionell, in einem ökologisch gehalten. Für die Untersuchungen wurden jeweils 100 Ferkel drei Tage nach ihrer Geburt mit einer Ohrmarke gekennzeichnet. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte eine erste Kotprobenentnahme mittels eines sterilen Tupfers. Die Tiere mit den Marken 1-40 wurden auf Campylobacter spp. und Y. enterocolitica, die mit den Nummern 41-100 nur auf Y. enterocolitica untersucht. Eine zweite Untersuchung der Ferkel erfolgte kurz vor dem Absetzen. An diesen beiden Terminen wurden auch die Muttersauen beprobt. Nur in dem Ökobetrieb war eine Sauenuntersuchung aufgrund der Haltungsform nicht möglich. Weitere Untersuchungen wurden kurz vor dem Ausstallen aus dem Läuferstall, im Maststall und auf dem Schlachthof durchgeführt. Für den Nachweis von Y. enterocolitica wurden die Proben in ITC angereichert und auf CIN-Agar ausgestrichen. Bolton-Bouillon und mCCD-Agar wurden für die Anzucht der Campylobacter-Keime genutzt. Wie zu erwarten war, konnten hohe Prävalenzen (bis zu 100%) von C. coli nachgewiesen werden. Vor allem kurz vor dem Absetzen wurde der Erreger häufig isoliert. Aber es gab auch einen Betrieb, wo der Nachweis nur im Maststall und nur bei sehr wenigen Tieren gelang. Nicht nur in den Betrieben, sondern auch auf dem Schlachthof waren hohe Prävalenzen festzustellen. Vor allem aus dem Kot und aus den Tonsillen konnte der Erreger häufig isoliert werden. Auch die Schlachttierkörperoberfläche war häufig stark kontaminiert. Nach der Kühlung jedoch konnte der Erreger nur bei 3 von 443 (0,7%) untersuchten Tieren nachgewiesen werden. Zu bemerken ist, dass es sich hierbei nicht um C.coli, sondern um C. jejuni handelte. Auch aus einigen Umgebungsproben der Betriebe konnte C. coli isoliert werden. Die Genotypen dieser Isolate wurden mit den Genotypen zeitgleich isolierter Schweinestämme verglichen. Als Methode hierfür wurde die AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) genutzt. Dabei konnte eine enge Verwandtschaft von Schweine- und Umgebungsproben beobachtet werden. In zwei der vier Betriebe konnte Y. enterocolitica aus Kotproben isoliert werden. Der Nachweis gelang aber nur im Maststall. Hier konnten im Kot sehr hohe Prävalenzen (bis zu 65,4%) nachgewiesen werden. Sauen, Ferkel und Läufer wurden immer als negativ getestet. Zum Schlachtzeitpunkt gelang die Isolierung sehr häufig aus den Tonsillen, im Kot war der Erreger zu diesem Zeitpunkt kaum noch nachzuweisen. Alle Isolate gehörten dem humanpathogenen Bioserovar 4/O:3 an, nur eines wurde als 3/O:9 identifiziert. Aus den 458 untersuchten Umgebungsproben konnte Y. enterocolitica nicht isoliert werden. Des Weiteren wurde mittels einer PCR untersucht, ob die isolierten Yersinien ein Virulenzplasmid beherbergen. Dieses ist notwendig, um eine volle Pathogenität auszubilden. Von insgesamt 263 isolierten Stämmen konnten 236 Stämme (89,7%) als plasmidtragend identifiziert werden. Auffallend war hierbei, dass 110 von 111 Stämmen (99,1%), die im Maststall isoliert wurden, das Plasmid besaßen. Im Gegensatz dazu konnte bei den Schlachthofisolaten das Plasmid nur bei 126 von 152 Stämmen (82,9%) nachgewiesen werden. Einige Isolate eines Betriebes wurden mit Hilfe der PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) unter Nutzung des Restriktionsenzyms NotI genotypisiert. Wie in der Literatur beschrieben, war innerhalb eines Bestandes auch nur ein Genotyp zu finden. Auch die Isolate aus Kot und Tonsillen waren klonal. Ebenso waren plasmidtragende nicht von plasmidlosen Stämmen zu unterscheiden. Auch wenn fast alle Herden stark mit Campylobacter spp. belastet sind, scheint aus Sicht des Verbraucherschutzes eine Bekämpfung auf Bestandsebene nicht notwendig zu sein, da die Kühlung des Schlachtkörpers den sauerstoff- und austrocknungsempfindlichen Erreger offensichtlich sehr effektiv zurückdrängt. Anders verhält es sich bei den Yersinien. Obwohl im Schweinefleisch nur relativ selten der Erreger nachweisbar ist, so sind Schlachtnebenprodukte oft stark belastet. Vor allem durch Kreuzkontaminationen im Küchenbereich der privaten Haushalte geht vom Fleisch und von den Nebenprodukten eine nicht zu unterschätzende Gefahr aus. Da über die Epidemoiologie des Erregers auf Bestandsebene noch relativ wenig bekannt ist, kann er momentan nur auf Schlachthofebene durch Einhaltung einer strikten Hygiene in seiner Ausbreitung begrenzt werden. Auf Bestandsebene scheint die Einführung von Monitoringprogrammen sinnvoll, um stark belastete Herden zu erkennen, diese möglichst am Schluss zu schlachten und somit das Lebensmittel Schweinefleisch sicherer zu machen.

Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

Campylobacter (C.) spp. und Yersinia (Y.) enterocolitica sind in Deutschland nach den Salmonellen die häufigsten Erreger der Enteritis infectiosa. Das Schwein wird als Reservoirtier für C. coli und Y. enterocolitica Bioserovar 4/O:3 angesehen. Da diese Infektionen beim Schwein zumeist klinisch inapparent verlaufen, sind sie bei der Schlachttier- und Fleischuntersuchung nicht feststellbar. Die Erreger können somit unerkannt in die Lebensmittelkette gelangen. In dieser Arbeit sollte ein Beitrag zur Epidemiologie dieser Erreger geleistet werden. Dazu wurden Prävalenzdaten in Betrieben und zum Schlachtzeitpunkt erhoben, Eintragungsquellen gesucht und genotypische Vergleiche durchgeführt. Im Zeitraum von Mai 2002 bis März 2004 wurden in vier verschiedenen Betrieben Verlaufsuntersuchungen zum Vorkommen dieser beiden Erreger durchgeführt. Dafür wurden Schweine von ihrer Geburt bis zur ihrer Schlachtung verfolgt. In drei dieser vier Betriebe wurden die Schweine konventionell, in einem ökologisch gehalten. Für die Untersuchungen wurden jeweils 100 Ferkel drei Tage nach ihrer Geburt mit einer Ohrmarke gekennzeichnet. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte eine erste Kotprobenentnahme mittels eines sterilen Tupfers. Die Tiere mit den Marken 1-40 wurden auf Campylobacter spp. und Y. enterocolitica, die mit den Nummern 41-100 nur auf Y. enterocolitica untersucht. Eine zweite Untersuchung der Ferkel erfolgte kurz vor dem Absetzen. An diesen beiden Terminen wurden auch die Muttersauen beprobt. Nur in dem Ökobetrieb war eine Sauenuntersuchung aufgrund der Haltungsform nicht möglich. Weitere Untersuchungen wurden kurz vor dem Ausstallen aus dem Läuferstall, im Maststall und auf dem Schlachthof durchgeführt. Für den Nachweis von Y. enterocolitica wurden die Proben in ITC angereichert und auf CIN-Agar ausgestrichen. Bolton-Bouillon und mCCD-Agar wurden für die Anzucht der Campylobacter-Keime genutzt. Wie zu erwarten war, konnten hohe Prävalenzen (bis zu 100%) von C. coli nachgewiesen werden. Vor allem kurz vor dem Absetzen wurde der Erreger häufig isoliert. Aber es gab auch einen Betrieb, wo der Nachweis nur im Maststall und nur bei sehr wenigen Tieren gelang. Nicht nur in den Betrieben, sondern auch auf dem Schlachthof waren hohe Prävalenzen festzustellen. Vor allem aus dem Kot und aus den Tonsillen konnte der Erreger häufig isoliert werden. Auch die Schlachttierkörperoberfläche war häufig stark kontaminiert. Nach der Kühlung jedoch konnte der Erreger nur bei 3 von 443 (0,7%) untersuchten Tieren nachgewiesen werden. Zu bemerken ist, dass es sich hierbei nicht um C.coli, sondern um C. jejuni handelte. Auch aus einigen Umgebungsproben der Betriebe konnte C. coli isoliert werden. Die Genotypen dieser Isolate wurden mit den Genotypen zeitgleich isolierter Schweinestämme verglichen. Als Methode hierfür wurde die AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) genutzt. Dabei konnte eine enge Verwandtschaft von Schweine- und Umgebungsproben beobachtet werden. In zwei der vier Betriebe konnte Y. enterocolitica aus Kotproben isoliert werden. Der Nachweis gelang aber nur im Maststall. Hier konnten im Kot sehr hohe Prävalenzen (bis zu 65,4%) nachgewiesen werden. Sauen, Ferkel und Läufer wurden immer als negativ getestet. Zum Schlachtzeitpunkt gelang die Isolierung sehr häufig aus den Tonsillen, im Kot war der Erreger zu diesem Zeitpunkt kaum noch nachzuweisen. Alle Isolate gehörten dem humanpathogenen Bioserovar 4/O:3 an, nur eines wurde als 3/O:9 identifiziert. Aus den 458 untersuchten Umgebungsproben konnte Y. enterocolitica nicht isoliert werden. Des Weiteren wurde mittels einer PCR untersucht, ob die isolierten Yersinien ein Virulenzplasmid beherbergen. Dieses ist notwendig, um eine volle Pathogenität auszubilden. Von insgesamt 263 isolierten Stämmen konnten 236 Stämme (89,7%) als plasmidtragend identifiziert werden. Auffallend war hierbei, dass 110 von 111 Stämmen (99,1%), die im Maststall isoliert wurden, das Plasmid besaßen. Im Gegensatz dazu konnte bei den Schlachthofisolaten das Plasmid nur bei 126 von 152 Stämmen (82,9%) nachgewiesen werden. Einige Isolate eines Betriebes wurden mit Hilfe der PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) unter Nutzung des Restriktionsenzyms NotI genotypisiert. Wie in der Literatur beschrieben, war innerhalb eines Bestandes auch nur ein Genotyp zu finden. Auch die Isolate aus Kot und Tonsillen waren klonal. Ebenso waren plasmidtragende nicht von plasmidlosen Stämmen zu unterscheiden. Auch wenn fast alle Herden stark mit Campylobacter spp. belastet sind, scheint aus Sicht des Verbraucherschutzes eine Bekämpfung auf Bestandsebene nicht notwendig zu sein, da die Kühlung des Schlachtkörpers den sauerstoff- und austrocknungsempfindlichen Erreger offensichtlich sehr effektiv zurückdrängt. Anders verhält es sich bei den Yersinien. Obwohl im Schweinefleisch nur relativ selten der Erreger nachweisbar ist, so sind Schlachtnebenprodukte oft stark belastet. Vor allem durch Kreuzkontaminationen im Küchenbereich der privaten Haushalte geht vom Fleisch und von den Nebenprodukten eine nicht zu unterschätzende Gefahr aus. Da über die Epidemoiologie des Erregers auf Bestandsebene noch relativ wenig bekannt ist, kann er momentan nur auf Schlachthofebene durch Einhaltung einer strikten Hygiene in seiner Ausbreitung begrenzt werden. Auf Bestandsebene scheint die Einführung von Monitoringprogrammen sinnvoll, um stark belastete Herden zu erkennen, diese möglichst am Schluss zu schlachten und somit das Lebensmittel Schweinefleisch sicherer zu machen.

Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

Schweine im Bestand und auf dem Schlachthof, Schlachttierkörper und Lebern sowie Hackfleisch vom Schwein und Schweinefleisch aus dem Handel wurden auf das Vorkommen von thermophilen Campylobacter spp. untersucht. Zusätzlich wurden Putenkarkassen auf einem Putenschlachthof und Hähnchen- und Putenfleischerzeugnisse aus dem Handel mit in die Untersuchung einbezogen. Die in den Proben gefundenen Campylobacter-Isolate wurden zuerst phänotypisch charakterisiert, anschließend erfolgte eine genotypische Feindifferenzierung durch zwei molekularbiologische Fingerprintingmethoden (AFLP-Typisierung und FLA-Typing). Durch den Vergleich der Isolate untereinander und mit humanen Campylobacter-Isolaten sollten epidemiologische Zusammenhänge geklärt und die Bedeutung von Geflügel- und Schweinefleisch als Infektionsquelle für den Menschen aufgezeigt werden. / Faeces of pigs at the farm and the slaughterhouse, pig carcasses, livers, minced meat and porc from retail were investigated for the occurence of thermophilic Campylobacter spp. Turkey carcasses at a turkey slaughterhouse and chicken and turkey products from retail were also included in this investigation. First the Campylobacter isolates found in the samples were characterized phenotypically, afterwards they were typed with two molecularbiological fingerprinting methods (AFLP- and FLA-Typing). The comparison of the isolates with human isolates should give answers to epidemiological questions and the importance of poultry and porc as a source of infection for humans.