Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

In dieser Arbeit wird eine neue Methode der Vitalitätsbestimmung von Cryptosporidium parvum-Oozysten beschrieben. Die gereinigten Oozysten wurden in einer HCT-8-zelllinie kultiviert und mittels IFAT ausgewertet. Um eine genaue Quantifizierung der fluoreszierenden Flächen vornehmen zu können, wurden die Bilder einer Bildanalysesoftware zugeführt und analysiert. Die Menge eingesäter Oozysten korrelierte signifikant mit den gemessenen Flächen intrazellulärer Entwicklungsstadien. In diesem System wurden verschiedene Feldisolate vergleichend getestet sowie die Vitalität thermisch inaktivierter Oozysten bestimmt.

Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

Das Ziel der Arbeit war, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Parasiten C. parvum zu etablieren, um eine Aussage über die Infektiosität der Oozysten treffen zu können. Es wurde ein robustes Zellkultursystem zur In-vitro-Kultivierung dieses Einzellers erarbeitet. Die Oozysten von C. parvum wurden im neonatalen Kälbern passagiert und aus dem Kot isoliert und aufgereinigt, so dass ein direkt in die Zellkultur einsetzbares Inokulum gewonnen werden konnte. Als Zelllinie wurden adhärent wachsende HCT-8-Zellen verwendet. Die konfluenten Zellmonolayer wurden in Mikrotiterplatten direkt mit der Oozystensuspension inokuliert. Dabei wurde dem Medium zur Erleichterung der Exzystierung der Sporozoiten 0,4 % Natriumtaurocholat beigemischt, ohne dass dabei ein zytotoxischer Effekt festzustellen war. Die erfolgreiche Exzystierung und Invasion der Zellen durch die Parasiten mit anschließender Vermehrung konnte bei hohen Anzahlen inokulierter Oozysten mit einer geeigneten Kontrasttechnik mikroskopisch beobachtet werden. Zum sicheren semiquantitativen Nachweis der Infektion wurde ein PCR-basierter Assay verwendet. Die Robustheit und Sensitivität des Zellkultur-PCR-Systems wurde mit vitalen Oozysten getestet und anschließend auf die Testung des Einflusses einer physikalischen (hohe Temperatur) und chemischen (Neopredisan®) Inaktivierungsmethode auf die Vitalität der Oozysten angewandt. Es wurden insgesamt 271 Zellkulturen mit unterschiedlichen Mengen vitaler Oozysten inokuliert. Mindestens 1000 Oozysten waren notwendig, um eine sicher nachweisbare Infektion zu erzeugen. Bei Einsatz von 100 Oozysten konnten etwa drei von vier Kulturen als infiziert diagnostiziert werden, bei Verwendung von 10 Oozysten betrug dieser Anteil etwas unter einem Drittel. Bei der thermischen Inaktivierung wurden zwei Temperaturen benutzt: 38 °C und 55 °C, die für unterschiedlich lange Zeitspannen (zwischen 1 und 24 h) auf die Oozysten eingewirkt hatten. In den 68 so untersuchten Kulturen zeigte sich, dass 55 °C unabhängig von der Einwirkdauer ausreichend waren, um die Oozysten soweit zu inaktivieren, dass kein PCR-Nachweis in der Kultur mehr möglich war. Eine Erwärmung auf lediglich 38 °C hatte dagegen keinen nennenswerten Einfluss auf die Infektiosität der Oozysten in der Zellkultur. Diese Oozysten verhielten sich ähnlich wie die unbehandelten Chargen. Es wurde ferner der Einfluss einer einstündigen Exposition mit Neopredisan® in den Konzentrationen von 0,25, 1 und 4 % auf die Infektiosität getestet (80 untersuchte Kulturen), sowie einer zweistündigen Inkubation mit 4 % (60 PCR-Ansätze). Die beiden niedrigen Konzentrationen übten keinen hemmenden Effekt auf die Vermehrungspotenz der so behandelten Oozysten aus, teilweise wurde hier sogar eine erhöhte Nachweisbarkeit vor allem in den niedrigen Inokula festgestellt. Dagegen konnte die höchste Konzentration die Oozysten in ihrer Vermehrung signifikant hemmen. Die längere Desinfektion erwies sich hierbei als wirksamer. Dieser Effekt war jedoch deutlich geringer als der einer Erwärmung auf 55 °C, und es konnten nicht alle Oozysten inaktiviert werden. Die Genotypisierung (Sequenzierung von zwei Genloci) der verwendeten Isolate ergab, dass es sich bei den verwendeten Parasiten um den bovinen Genotyp von C. parvum handelte und dass durch die verwendete PCR der richtige DNA-Abschnitt amplifiziert wurde. Insgesamt gesehen ist die Methode geeignet, reproduzierbare intrazelluläre Infektionen einer permanenten Zelllinie in vitro zu erzeugen, die sich auch gut mit der vorgestellten PCR nachweisen lassen. Allerdings ist auf diese Weise nur eine semiquantitative Abschätzung der Intensität der Entwicklung (über eine Titrationsreihe) möglich. Es wäre anstrebenswert, hier eine quantitative Methode (z.B. quantitative PCR) einsetzen zu können.

In dieser Arbeit wird eine neue Methode der Vitalitätsbestimmung von Cryptosporidium parvum-Oozysten beschrieben. Die gereinigten Oozysten wurden in einer HCT-8-zelllinie kultiviert und mittels IFAT ausgewertet. Um eine genaue Quantifizierung der fluoreszierenden Flächen vornehmen zu können, wurden die Bilder einer Bildanalysesoftware zugeführt und analysiert. Die Menge eingesäter Oozysten korrelierte signifikant mit den gemessenen Flächen intrazellulärer Entwicklungsstadien. In diesem System wurden verschiedene Feldisolate vergleichend getestet sowie die Vitalität thermisch inaktivierter Oozysten bestimmt.

Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

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