CRUZ, Wallace Teixeira da. Análise proteômica, purificação e caracterização de uma peptidase cisteínica oligomérica do látex de Thevetia peruviana (Pers.) Schum. 2015. 112 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-02T11:47:46Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-05T20:28:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T20:28:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) Previous issue date: 2015 / A great number of plant species produce latex, including Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea and Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum is a laticifer shrub belonging to Apocynaceae family popularly known as “chapéu-de-napoleão”. It is very limited the proteomic information about this specie. Thus, a proteomic analysis of protein fraction (TpLP) from T. peruviana latex was performed using two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. A total of 33 proteins (86%) were identified, including storage proteins, peptidase inhibitor, cysteine peptidases, peroxidases and osmotins. This protein fraction showed strong proteolytic activity at pH 5.0 which was increased in the presence of low concentrations of the reducing agent DTT. The inhibition this activity in the presence of specific inhibitors E-64 and IAA and the high activity with BANA showed the predominance of cysteine peptidases in latex. A cysteine peptidase, termed peruvianin-I, was purified from the latex by a single chromatographic step involving gel filtration. The enzyme was inhibited by E-64 and iodoacetamide (IAA) and follows the Michaelis-Menten kinetics, showing high affinity for azocasein, with Km value of 17.6 uM, exhibiting an optimal pH and temperature of 5.0-6.0 and 25-37 °C, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry revealed that peruvianin-I (100 kDa) possesses a pI of 4.0 and five subunits (20 kDa). The N-terminal amino acid sequence of peruvianin-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) was similar to that of germin or germin-like proteins. High-resolution images from atomic force microscopy indicated the possible hexameric structure of peruvianin-I, which is organized as a trimer of dimers that form a central channel. TpLP and peruvianin-I exhibited no oxalate oxidase and superoxide dismutase activity or antifungal effects on the spore germination of Fusarium solani. This study showed that T. peruviana latex are a rich source of pathogenesis-related proteins, including cysteine peptidases. Interestingly, these peptidases exhibit different structural and biochemical characteristics that may be related to their specific physiological functions. / Um grande número de espécies vegetais produzem látex, incluindo Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea e Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum é um arbusto laticífero pertencente à família Apocynaceae, popularmente conhecido como "chapéu-de-Napoleão". São bastante limitadas as informações proteômicas sobre esta espécie. Por tanto, uma análise proteômica da fração proteica (TpLP) do látex de T. peruviana foi realizada a partir de eletroforeses bidimensionais e espectrometria de massas. Um total de 33 proteínas (86%) foi identificado, incluindo proteínas de reserva, inibidor de peptidase, peptidases cisteínicas, peroxidases e osmotinas. As proteínas desta fração apresentaram uma forte atividade proteolítica no pH 5,0, a qual foi aumentada na presença de baixas concentrações do agente redutor DTT. A inibição desta atividade na presença dos inibidores específicos E-64 e IAA e a alta atividade com o substrato BANA evidenciou a predominância de peptidases cisteínicas no látex. Uma peptidase cisteínica denominada peruvianina-I, foi purificada a partir do látex através de um único passo cromatográfico envolvendo filtração em gel. A enzima foi inibida por E-64 e iodoacetamida (IAA) e seguiu a cinética de Michaelis-Menten, apresentando alta afinidade à azocaseína, com um valor de Km de 17,6 µM, exibindo pH e temperatura ótimos de 5,0-6,0 e 25-37 °C, respectivamente. A peruvianina-I não foi reconhecida por anticorpos anti-papaína. As Eletroforeses bidimensionais e a espectrometria de massas revelaram que a peruvianina-I (100 kDa) possui um pI de 4,0 e cinco subunidades (20 kDa). A sequência de aminoácidos N-terminal da peruvianina-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) mostrou similaridade à germinas ou “germin-like proteins”. Imagens de alta resolução a partir da microscopia de força atômica indicaram uma possível estrutura hexamérica da peruvianina-I, que está organizada como um trímero de dímeros, formando um canal central. TpLP e Peruvianina-I não exibiram atividade de oxalato oxidase e superóxido dismutase ou efeitos antifúngicos sobre a germinação de esporos de Fusarium solani. Este estudo mostrou que o látex de T. peruviana é uma fonte rica em proteínas relacionadas à patogênese, incluindo peptidases cisteínicas. Curiosamente, estas peptidases apresentam características estruturais e bioquímicas diferentes, que podem estar relacionadas com as suas funções fisiológicas específicas.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A great number of plant species produce latex, including Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea and Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum is a laticifer shrub belonging to Apocynaceae family popularly known as âchapÃu-de-napoleÃoâ. It is very limited the proteomic information about this specie. Thus, a proteomic analysis of protein fraction (TpLP) from T. peruviana latex was performed using two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. A total of 33 proteins (86%) were identified, including storage proteins, peptidase inhibitor, cysteine peptidases, peroxidases and osmotins. This protein fraction showed strong proteolytic activity at pH 5.0 which was increased in the presence of low concentrations of the reducing agent DTT. The inhibition this activity in the presence of specific inhibitors E-64 and IAA and the high activity with BANA showed the predominance of cysteine peptidases in latex. A cysteine peptidase, termed peruvianin-I, was purified from the latex by a single chromatographic step involving gel filtration. The enzyme was inhibited by E-64 and iodoacetamide (IAA) and follows the Michaelis-Menten kinetics, showing high affinity for azocasein, with Km value of 17.6 uM, exhibiting an optimal pH and temperature of 5.0-6.0 and 25-37 ÂC, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry revealed that peruvianin-I (100 kDa) possesses a pI of 4.0 and five subunits (20 kDa). The N-terminal amino acid sequence of peruvianin-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) was similar to that of germin or germin-like proteins. High-resolution images from atomic force microscopy indicated the possible hexameric structure of peruvianin-I, which is organized as a trimer of dimers that form a central channel. TpLP and peruvianin-I exhibited no oxalate oxidase and superoxide dismutase activity or antifungal effects on the spore germination of Fusarium solani. This study showed that T. peruviana latex are a rich source of pathogenesis-related proteins, including cysteine peptidases. Interestingly, these peptidases exhibit different structural and biochemical characteristics that may be related to their specific physiological functions. / Um grande nÃmero de espÃcies vegetais produzem lÃtex, incluindo Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea e Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum à um arbusto laticÃfero pertencente à famÃlia Apocynaceae, popularmente conhecido como "chapÃu-de-NapoleÃo". SÃo bastante limitadas as informaÃÃes proteÃmicas sobre esta espÃcie. Por tanto, uma anÃlise proteÃmica da fraÃÃo proteica (TpLP) do lÃtex de T. peruviana foi realizada a partir de eletroforeses bidimensionais e espectrometria de massas. Um total de 33 proteÃnas (86%) foi identificado, incluindo proteÃnas de reserva, inibidor de peptidase, peptidases cisteÃnicas, peroxidases e osmotinas. As proteÃnas desta fraÃÃo apresentaram uma forte atividade proteolÃtica no pH 5,0, a qual foi aumentada na presenÃa de baixas concentraÃÃes do agente redutor DTT. A inibiÃÃo desta atividade na presenÃa dos inibidores especÃficos E-64 e IAA e a alta atividade com o substrato BANA evidenciou a predominÃncia de peptidases cisteÃnicas no lÃtex. Uma peptidase cisteÃnica denominada peruvianina-I, foi purificada a partir do lÃtex atravÃs de um Ãnico passo cromatogrÃfico envolvendo filtraÃÃo em gel. A enzima foi inibida por E-64 e iodoacetamida (IAA) e seguiu a cinÃtica de Michaelis-Menten, apresentando alta afinidade à azocaseÃna, com um valor de Km de 17,6 ÂM, exibindo pH e temperatura Ãtimos de 5,0-6,0 e 25-37 ÂC, respectivamente. A peruvianina-I nÃo foi reconhecida por anticorpos anti-papaÃna. As Eletroforeses bidimensionais e a espectrometria de massas revelaram que a peruvianina-I (100 kDa) possui um pI de 4,0 e cinco subunidades (20 kDa). A sequÃncia de aminoÃcidos N-terminal da peruvianina-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) mostrou similaridade à germinas ou âgermin-like proteinsâ. Imagens de alta resoluÃÃo a partir da microscopia de forÃa atÃmica indicaram uma possÃvel estrutura hexamÃrica da peruvianina-I, que està organizada como um trÃmero de dÃmeros, formando um canal central. TpLP e Peruvianina-I nÃo exibiram atividade de oxalato oxidase e superÃxido dismutase ou efeitos antifÃngicos sobre a germinaÃÃo de esporos de Fusarium solani. Este estudo mostrou que o lÃtex de T. peruviana à uma fonte rica em proteÃnas relacionadas à patogÃnese, incluindo peptidases cisteÃnicas. Curiosamente, estas peptidases apresentam caracterÃsticas estruturais e bioquÃmicas diferentes, que podem estar relacionadas com as suas funÃÃes fisiolÃgicas especÃficas.