Neste trabalho foi estudada a influência da forma de preparo do inóculo na morfologia do microrganismo e na produção de glicoamilase por Aspergillus awamori, em cultivo submerso. Foram realizados ensaios variando-se a concentração de esporos utilizada no preparo do inóculo para o fermentador (pré-cultivo de células em incubador rotativo a 200 rpm e 35 oC, por 24 horas) no intervalo entre 9,5 exp 03 e 1,8 exp 07 esporos/mL. Os inóculos preparados com concentração de esporos entre 9,5 exp 03 e 9,5 exp 05 esporos/mL apresentaram-se na forma de uma suspensão de “pellets" e conduziram a um crescimento na forma filamentosa, em fermentador. A produção de glicoamilase, nos ensaios com concentração inicial de substrato de 40 g/L, realizados em fermentador, não foi influenciada pela concentração de esporos nessa faixa, mantendo-se entre 2100 e 2200 U/L. O aumento da concentração de esporos utilizada no preparo do inóculo para 1,8 exp 07 esporos/mL conduziu à formação de um inóculo na forma filamentosa contendo muitos aglomerados de esporos não germinados, que levaram a um crescimento, em fermentador, na forma de “pellets", reduzindo a produção de glicoamilase para cerca de 1600 U/L e mostrando que o crescimento na forma de “pellets" não é indicado para a produção de glicoamilase. Foram estudadas, também, outras formas de preparo do inóculo, variando-se as condições de germinação dos esporos (pH e tempo de pré-cultivo do inóculo). A forma de preparo do inóculo que conduziu a uma maior produção de glicoamilase, em fermentador, foi o cultivo de esporos em incubador rotativo, a pH 2,5 durante 7 horas, o que evitou a aglomeração de esporos durante a etapa de germinação e a formação de “pellets" em fermentador, conduzindo a um crescimento na forma filamentosa e a uma alta produção de glicoamilase. / The influence of the inoculum preparation on Aspergillus awamori morphology and glucoamylase synthesis in submerged cultures has been investigated. A series of runs were performed, varying the spore concentration of the inoculum (inoculum size) in the range from 9.5 exp 03 to 1.8 exp 07 spores/mL. The inoculum was cultivated in shaker, at 35 oC and 200 rpm, for 24 hours. The inoculum prepared with a spore concentration in the range from 9.5 exp 03 to 9.5 exp 05 spores/mL was composed by a pellet suspension. This pellet suspension led to a filamentous growth in fermenter, but did not influence the glucoamylase production, which reached values from 2,100 to 2,200 U/L. The use of a higher spore concentration (1.8 exp 07 spores/mL) produced an inoculum composed by dispersed hyphae and many spores agglomerates, which led to pellet formation in the fermenter and reduced glucoamylase production to 1,600 U/L. Thus, pellet formation is not recommended in the process of glucoamylase synthesis. Some forms of inoculum preparation have been studied, varying spore germination conditions (pH and time of inoculum culture). The form of inoculum preparation that led to the highest glucoamylase activity in fermenter was the spore germination in shaker at pH 2.5 for 7 hours, which avoided pellet formation in the reactor and conducted to a high glucoamylase production.

Neste trabalho foi estudada a influência da forma de preparo do inóculo na morfologia do microrganismo e na produção de glicoamilase por Aspergillus awamori, em cultivo submerso. Foram realizados ensaios variando-se a concentração de esporos utilizada no preparo do inóculo para o fermentador (pré-cultivo de células em incubador rotativo a 200 rpm e 35 oC, por 24 horas) no intervalo entre 9,5 exp 03 e 1,8 exp 07 esporos/mL. Os inóculos preparados com concentração de esporos entre 9,5 exp 03 e 9,5 exp 05 esporos/mL apresentaram-se na forma de uma suspensão de “pellets” e conduziram a um crescimento na forma filamentosa, em fermentador. A produção de glicoamilase, nos ensaios com concentração inicial de substrato de 40 g/L, realizados em fermentador, não foi influenciada pela concentração de esporos nessa faixa, mantendo-se entre 2100 e 2200 U/L. O aumento da concentração de esporos utilizada no preparo do inóculo para 1,8 exp 07 esporos/mL conduziu à formação de um inóculo na forma filamentosa contendo muitos aglomerados de esporos não germinados, que levaram a um crescimento, em fermentador, na forma de “pellets”, reduzindo a produção de glicoamilase para cerca de 1600 U/L e mostrando que o crescimento na forma de “pellets” não é indicado para a produção de glicoamilase. Foram estudadas, também, outras formas de preparo do inóculo, variando-se as condições de germinação dos esporos (pH e tempo de pré-cultivo do inóculo). A forma de preparo do inóculo que conduziu a uma maior produção de glicoamilase, em fermentador, foi o cultivo de esporos em incubador rotativo, a pH 2,5 durante 7 horas, o que evitou a aglomeração de esporos durante a etapa de germinação e a formação de “pellets” em fermentador, conduzindo a um crescimento na forma filamentosa e a uma alta produção de glicoamilase. / The influence of the inoculum preparation on Aspergillus awamori morphology and glucoamylase synthesis in submerged cultures has been investigated. A series of runs were performed, varying the spore concentration of the inoculum (inoculum size) in the range from 9.5 exp 03 to 1.8 exp 07 spores/mL. The inoculum was cultivated in shaker, at 35 oC and 200 rpm, for 24 hours. The inoculum prepared with a spore concentration in the range from 9.5 exp 03 to 9.5 exp 05 spores/mL was composed by a pellet suspension. This pellet suspension led to a filamentous growth in fermenter, but did not influence the glucoamylase production, which reached values from 2,100 to 2,200 U/L. The use of a higher spore concentration (1.8 exp 07 spores/mL) produced an inoculum composed by dispersed hyphae and many spores agglomerates, which led to pellet formation in the fermenter and reduced glucoamylase production to 1,600 U/L. Thus, pellet formation is not recommended in the process of glucoamylase synthesis. Some forms of inoculum preparation have been studied, varying spore germination conditions (pH and time of inoculum culture). The form of inoculum preparation that led to the highest glucoamylase activity in fermenter was the spore germination in shaker at pH 2.5 for 7 hours, which avoided pellet formation in the reactor and conducted to a high glucoamylase production.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.