La drépanocytose est une maladie génétique touchant l'hémoglobine, de transmission autosomique récessive, caractérisée par trois grandes manifestations cliniques :anémie hémolytique chronique, phénomènes vaso-occlusifs et susceptibilité accrue aux infections. Dans diverses régions du monde et particulièrement en Afrique subsaharienne, cette maladie est très fréquente et constitue un problème crucial de santé publique. Sa physiopathologie complexe est basée sur la polymérisation de l’hémoglobine anormale (Hb S) qui provoque une falciformation et une déshydratation du globule rouge. Les hématies falciformées sont impliquées dans les phénomènes de vaso-occlusion. Le traitement et la prise en charge de la maladie reste toujours problématique. A l’heure actuelle, le seul traitement curatif est la transplantation de moelle osseuse mais les donneurs compatibles sont assez rares et les coûts élevés. Des traitements symptomatiques et préventifs (principalement la transfusion et l’hydroxyurée) existent toutefois.<p>Des études in vitro et in vivo ont démontré les possibilités thérapeutiques de certaines molécules dont les cibles sont les transports membranaires impliqués dans la déshydratation cellulaire.<p>Depuis les années 1990, le cromoglycate de sodium, un médicament anti-allergique et anti-asthmatique, a montré un intérêt potentiel dans le traitement de la drépanocytose. Néanmoins, son mode d’action n’est actuellement pas connu. Notre travail a pour but de contribuer à l’étude du mécanisme d’action anti-drépanocytaire de la molécule.<p>Dans un premier temps, des globules rouges drépanocytaires préincubés en absence ou présence de cromoglycate ont été désoxygénés par un flux d’azote. Ensuite, les concentrations intracellulaires en Na+ et en K+ ont été mesurées. Les résultats de ces investigations ont montré un effet inhibiteur du cromoglycate sur l’efflux de K+ et l’influx du Na+ provoqués par la désoxygénation.<p>Sur base de ces observations, des expériences testant l’action du cromoglycate sur le canal K+ dépendant du Ca2+ (canal de Gardos) ont été effectuées. Dans des globules rouges normaux et drépanocytaires, ce canal a été activé par augmentation de la concentration intra-cellulaire en Ca2+. L'effet du cromoglycate a été comparé à celui d'un inhibiteur connu, le clotrimazole. Les résultats ont montré que 1e cromoglycate n'exerce pas d'effet inhibiteur sur le canal de Gardos, au contraire du clotrimazole. Il est également sans effet significatif sur la Ca2+-ATPase.<p>Nous avons ensuite investigué l’implication du Ca2+ dans les perturbations du flux des ions K+ et Na+. Des globules rouges drépanocytaires ont été incubés en absence et présence d’EGTA 5 mmol/l ou de BAPTA 10 µmol/l, respectivement chélateurs du Ca2+ extra et intracellulaire. Après désoxygénation, les concentrations intracellulaires en Na+ et K+ ont été mesurées. Les résultats de ces expériences montrent que seul le chélateur du Ca2+ extracellulaire bloque les perturbations ioniques causées par la désoxygénation. Ces résultats viennent donc confirmer les observations d’autres auteurs quant à l’implication du Ca2+ extracellulaire dans la fuite de K+ des globules drépanocytaires soumis à la désoxygénation. <p>Enfin, l’effet du cromoglycate sur l’influx de Ca2+ extracellulaire et sur la falciformation induits par le métabisulfite a été mesuré et comparé à celui du clotrimazole. Des globules rouges drépanocytaires, prélablement chargés en Fura Red, un indicateur fluorescent du Ca2+, ont été exposés au métabisulfite, un puissant réducteur provoquant une falciformation rapide. L’influx de Ca2+ a été mesuré par la diminution de la fluorescence du Fura Red. Parallèlement, la falciformation a été suivie en mesurant la lumière diffractée à 90° par les cellules. Les résultats de ces investigations montrent que le cromoglycate (1 µmol/l) et le clotrimazole (10 µmol/l) ont des effets inhibiteurs comparables sur la falciformation mais que le cromoglycate freine significativement plus l'influx de Ca2+ au cours de ce processus.<p>En conclusion, sur base de ces différents tests in vitro, le cromoglycate inhibe la falciformation induite par la désoxygénation. Cette inhibition résulte du blocage des perturbations ioniques induites par la désoxygénation en empêchant l’influx du Ca2+ extracellulaire et secondairement la fuite du K+ intracellulaire, ce qui inhibe la déshydratation cellulaire.<p>La diminution des crises vaso-occlusives observée chez les patients drépanocytaires traités par le cromoglycate s’expliquerait donc par ces effets. En présence de cromoglycate, les globules rouges sont moins déshydratés et falciforment moins rapidement. Ils sont dès lors moins impliqués dans les phénomènes de vaso-occlusion, ce qui améliore l’état des patients.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Blood is a complex suspension of deformable particles, red blood cells, which exhibits a sophisticated dynamics when flowing in the microvasculature. Most of these complex phenomena, non-linear rheology, structuration of the suspension, heterogeneities of the hematocrit distribution, are directly connected to the rich microscopic dynamics of individual red blood cells, and their hydrodynamics interactions. We investigate a few aspects of the dynamics of red blood cells and giant vesicles - a simple model for RBCs. A study on the dynamics of very deflated vesicles, with shapes similar to those of red blood cells, shows that these objects which haven't received a lot of attention so far can exhibit richer than expected dynamics. We then mainly focus on the still unexplored problem of hydrodynamic interactions between vesicles or red blood cells and their consequences at the scale of the suspension. An experimental study of the interaction of two identical vesicles in shear flow shows that there is a net repulsion between the cells that leads to an increase of the distance between vesicles in a suspension. Scaling arguments are proposed for this interaction and a comparison with numerical results is performed and a quantitative estimation of a shear induced diffusion coefficient obtained by averaging the results for pair interactions is found. Finally, we investigate the diffusion of a cloud of red blood cells in Poiseuille flow in order to directly determine diffusion coefficients. The experiment shows that the cloud widens when traveling along the channel with a power law behaviour indicating sub-diffusion. This effect is confirmed by a theoretical analysis of a few limit cases.

The human &alpha;-lactalbumin (&alpha;-LA) molten globule formed at low pH is a model for the study of protein folding intermediates. The molten globule lacks native-like side-chain interactions, resulting in a fluctuating ensemble of tertiary structures, characterisation of which has been precluded by severe line-broadening in NMR spectra and a lack of long-range NOEs. Paramagnetic relaxation enhancements (PREs) have been measured in a variant of &alpha;-LA in which all native cysteines have been mutated to alanine (all-Ala &alpha;-LA). Cysteine residues have been mutated into regions of interest and spin labelled with MTSL. These measurements have confirmed that all-Ala &alpha;-LA forms a compact molten globule. Transient, long-range interactions that are stabilising the compact fold have also been identified using PREs measured in urea-denatured states. This has identified several interactions formed by hydrophobic residues from both the &alpha;- and &beta;-domain, which could be important for initiating and driving folding. The molten globule’s 3D topology has been probed by measuring long-range distances between MTSL pairs using Double Electron-Electron Resonance (DEER). Broad distance distributions have been identified between elements of secondary structure, indicative of a fluctuating but compact fold. By contrast, a narrower distance distribution has been measured within one of the major helices, indicative of native-like secondary structure. The surface accessibility of all-Ala &alpha;-LA and that of two other variants ([28-111] &alpha;-LA and 4SS &alpha;-LA) has been probed using solvent PREs obtained using TEMPOL, a paramagnetic co-solute. This has revealed differences in the solvent-exposure of hydrophobic residues due to the removal of disulphide bonds. This method has also identified buried hydrophobic residues that contribute to forming the molten globule’s stable, native-like core.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La modélisation et la simulation numérique des interfaces sont au coeur de nombreuses applications en mécanique des fluides et des solides, telles que la biologie cellulaire (déformation des globules rouges dans le sang), l'ingénierie pétrolière et la sismique (modélisation de réservoirs, présence de failles, propagation des ondes), l'aérospatiale (problème de rupture, de chocs) ou encore le génie civil. Cette thèse porte sur l'approximation des problèmes d'interface et d'interphase en mécanique des fluides par la méthode NXFEM, qui permet de prendre en compte de façon précise une discontinuité non alignée avec le maillage. Nous nous sommes d'abord intéressés au développement de la méthode NXFEM pour des éléments finis non-conformes pour prendre en compte une interface séparant deux milieux. Nous avons proposé deux approches pour les équations de Darcy et de Stokes. La première consiste à modifier les fonctions de base de Crouzeix-Raviart sur les cellules coupées et la deuxième consiste à rajouter des termes de stabilisation sur les arêtes coupées. Les résultats théoriques obtenus ont été ensuite validés numériquement. Par la suite, nous avons étudié la modélisation asymptotique et l'approximation numérique des problèmes d'interphase, faisant apparaître une couche mince. Nous avons considéré d'abord les équations de Darcy en présence d'une faille et, en passant à la limite dans la formulation faible, nous avons obtenu un modèle asymptotique où la faille est décrite par une interface, avec des conditions de transmission adéquates. Pour ce problème limite, nous avons développé une méthode numérique basée sur NXFEM avec éléments finis conformes, consistante et stable. Des tests numériques, incluant une comparaison avec la littérature, ont été réalisés. La modélisation asymptotique a été étendue aux équations de Stokes, pour lesquelles nous avons justifié le modèle limite obtenu. Enfin, nous nous sommes intéressés à la modélisation de la membrane d'un globule rouge par un fluide non-newtonien viscoélastique de Giesekus, afin d'appréhender la rhéologie du sang. Pour un problème d'interphase composé de deux fluides newtoniens (l'extérieur et l'intérieur du globule) et d'un liquide de Giesekus (la membrane du globule), nous avons dérivé formellement le problème limite, dans lequel les équations dans la membrane sont remplacées par des conditions de transmission sur une interface. / Numerical modelling and simulation of interfaces in fluid and solid mechanics are at the heart of many applications, such as cell biology (deformation of red blood cells), petroleum engineering and seismic (reservoir modelling, presence of faults, wave propagation), aerospace and civil engineering etc. This thesis focuses on the approximation of interface and interphase problems in fluid mechanics by means of the NXFEM method, which takes into account discontinuities on non-aligned meshes.We have first focused on the development of NXFEM for nonconforming finite elements in order to take into account the interface between two media. Two approaches have been proposed, for Darcy and Stokes equations. The first approach consists in modifying the basis functions of Crouzeix-Raviart on the cut cells and the second approach consists in adding some stabilization terms on each part of a cut edge. We have studied them from a theoretical and a numerical point of view. Then we have studied the asymptotic modelling and numerical approximation of interphase problems, involving a thin layer between two media. We have first considered the Darcy equations in the presence of a highly permeable fracture. By passing to the limit in the weak formulation, we have obtained an asymptotic model where the 2D fracture is described by an interface with adequate transmission conditions. A numerical method based on NXFEM with conforming finite elements has been developed for this limit problem, and its consistency and uniform stability have been proved. Numerical tests including a comparison with the literature have been presented. The asymptotic modelling has been finally extended to Stokes equations, for which we have justified the limit problem. Finally, we have considered the mechanical behaviour of red blood cells in order to better understand blood rheology. The last part of the thesis is devoted to the modelling of the membrane of a red blood cell by a non-Newtonian viscoelastic liquid, described by the Giesekus model. For an interphase problem composed of two Newtonian fluids (the exterior and the interior of the red blood cell) and a Giesekus liquid (the membrane), we formally derived the limit problem where the equations in the membrane are replaced by transmission conditions on an interface.

La acetilcolinesterasa (AChE) hidroliza el neurotransmisor acetilcolina. La enzima se presenta en distintas formas moleculares. Tetrámeros hidrofílicos de AChE de suero fetal bovino se purificaron, sometieron a un tratamiento químico desnaturalizante o reductor, y estudiaron mediante análisis de sedimentación, cromatografía, fluorescencia intrínseca y unión de sondas hidrofóbicas. La transformación de los tetrámeros hidrofílicos en dímeros y monómeros anfifílicos demostró la alta flexibilidad conformacional de las subunidades de AChE, lo que podría ser crucial en la síntesis del conjunto completo de sus formas moleculares, y aportó una explicación de cómo algunas de sus formas interaccionan con las membranas. Para entender la heterogeneidad molecular de la AChE, también se empleó el anticuerpo AE-1, que interaccionó de forma desigual con oligómeros y monómeros de AChE de distintas fuentes. Experimentos de Western blot demostraron que el epítopo de AE-1 es de naturaleza confor macional. Finalmente, los datos experimentales descartaron la fosforilación de la AChE con proteína quinasa A. / Acetylcholinesterase (AChE) hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine. The enzyme exists in several molecular forms. AChE hydrophilic tetramers from fetal bovine serum were purified, chemically denatured or reduced, and studied by sedimentation analysis, hydrophobic chromatography, intrinsic fluorescence spectra and binding of amphiphilic probes. Conversion of the hydrophilic tetramers into amphiphilic dimers and monomers showed that AChE subunits possess a flexible conformation, which may be important for generating a full set of molecular forms, and gave an explanation of the interaction of certain AChE forms with membranes. Another approach to determine the molecular basis for the structural heterogeneity of AChE was to use the antibody AE-1, which distinctly reacted with AChE oligomers and monomers from different sources. The results of Western blot revealed that the determinant for AE-1 consisted of a conformational domain, not a primary sequence region. Finally, the experimental data rejected the phosphorylation of AChE at non-consensus protein kinase A sites.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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