IntroducciónLas b(l 3)(l 4) glucanasas son enzimas de gran interés biotecnólogico tanto en la industria cervezera como en la de fabricación de piensos. Los objetivos de esta tesis han sido: rediseñar la glucanasa de bacillus licheniformis con objeto de tratar de mejorar la actividad enzimática y determinar la función del lazo mayor del centro activo en dicho proceso, así como analizar y rediseñar la estabilidad térmica del enzima, en particular determinar la influencia del lazo mayor en la desnaturalización térmica, relacionándolo con el proceso y tipo de plegamiento.Análisis de los mutantes de saturación en la posición 58 de glucanasas1. La reducción de volumen de la cadena lateral aumenta la actividad, aumentado la constante catalítica kcat, si bien disminuye la Km. El mutante M58G presenta la actividad más alta, hasta 6 veces más que el silvestre, y el mutante M58A presenta más de 4 veces la actividad del silvestre, ambos, en términos de kcat/Km. 2. Los residuos hidrófilos disminuyen la actividad. 3. Unicamente en mutantes aromáticos como M58F y M58W, se aprecia una disminución de valores de Km, respecto al enzima silvestre. El análisis de la termorresistencia1. Con respecto al medio, serían claves el pH (por pérdida de interacciones pH dependientes), el tampón (por su posible papel quelante),y la presencia de sustrato (porque estabilizaría).2. Con respecto a la estructura serían claves los aminoácidos del lazo y la coordinación del Ca++. La coordinación del Ca++ puede ser mejorada introduciendo una nueva interacción entre el catión y la beta 15, como en el caso del mutante N236D. 3. Finalmente, la termoinactivación de la glucanasa de Bacillus licheniformis, en todos los mutantes estudiados, siguen un patrón bifásico. Su análisis cinético permite justificar el efecto de diversos mutantes y el comportamiento del enzima frente a la temperatura. / IntroductionThe (l-3)(l-4) glucanases are enzymes of great biotechnologyc interest in the brewery industry and in the manufacture of fodder. One objective of this thesis is to redesign the glucanase of bacillus licheniformis trying to improve its enzymatic activity to determine the function that the big loop, situated in the active centre, in this process. Another objective is to analyse and redesign the thermal stability of the enzyme, determining, in particular, the influence of the big loop in the thermal denaturation, and the relation with the process and type of folding.Analysis of the saturation at position 58 of glucanase 1. The reduction of volume of the lateral chain increases the activity, increasing the catalytic constant kcat, although the Km diminishes. Mutant M58G shows the highest activity, up to 6 times more than the wild type, and mutant M58A shows more than 4 times the activity of the wild type, both, in terms of kcat/Km. 2. Hydrophilic residues diminish the activity. 3. Only in the aromatic mutants, like M58F and M58W, we can observe that the Km values diminish, with respect to the wild enzyme. The analysis of the thermoresistance 1. Some factors of the buffer are essential: pH (by loss of pH dependent interactions ), the buffer composition (by its possible chelant action) and the substrate presence (it would stabilize the enzyme).2. Regarding to structure, the amino acids of the loop and the coordination of the Ca++ would be key elements. The coordination of the Ca++ can be improved introducing a new interaction between the cation and beta 15, as in the case of mutant N236D. 3. Finally the thermoinactivation, of the glucanase of Bacillus licheniformis, in all of the mutants studied, follows a two-phases pattern. The kinetic analysis justifies the effect of several mutants and the behaviour of the enzyme versus the temperature.

Les glicosidases que hidrolitzen els substrats amb retenció de configuració segueixen un mecanisme general en què després d'una primera etapa d'associació enzim-lligand s'encadenen dues etapes catalítiques que porten a la hidròlisi del substrat conservant la configuració del carboni anomèric en el nou extrem generat. En el present treball es comprova a través d'estudis mecanístics, principalment estudis en estat preestacionari i anàlisis de Hammett, que amb aquest mecanisme tan senzill no es pot descriure correctament l'activitat catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, i es proposa el mecanisme que es mostra a continuació: on els complexos enzim-substrat adopten dues conformacions productives (SES* i SES**) i on el balanç entre aquestes dues conformacions en funció del substrat explica els diferents comportaments cinètics en estat estacionari i preestacionari.Un estudi en profunditat sobre la importància que exerceix la interacció entre l'enzim i l'hidroxil a C2 de la unitat de glucopiranosa que ocupa el subseti -1 demostra que en el cas de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis aquesta interacció no juga el paper rellevant que s'ha observat en altres β-glicosidases que actuen amb retenció de configuració.L'estudi de la reacció d'hidratació del glical G4G3G' catalitzada per la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permet proposar que hi ha un canvi en el residu que fa el paper d'àcid general. De manera que es proposa que l'Asp136 que en la reacció d'hidròlisi de substrats ajuda al posicionament dels residus catalítics i juga un paper en la regulació dels seus pKa, és el residu que fa d'àcid general en la reacció d'hidratació de glicals. / Las glicosidasas que hidrolizan substratos con retención de configuración siguen un mecanismo general en que después de una primera etapa de asociación enzima-ligando se encadenan dos etapas catalíticas que llevan a la hidrólisis del substrato conservando la configuración del carbono anomérico en el nuevo extremo generado. En el presente trabajo se comprueba a través de estudios mecanísticos, principalmente estudios en estado pre-estacionario y análisis de Hammett, que con este mecanismo tan sencillo no se puede describir correctamente la actividad catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, y se propone el mecanismo que se muestra a continuación: donde los complejos enzima-substrato adoptan dos conformaciones productivas (SES* y SES**) y donde el balance entre estas dos conformaciones en función del substrato explica los diferentes comportamientos cinéticos en estado estacionario y pre-estacionario.Un estudio en profundidad sobre la importancia que ejerce la interacción entre el enzima y el hidroxilo en C2 de la unidad de glucopiranosa que ocupa el subsitio -1 demuestra que en el caso de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis esta interacción no juega el papel relevante que se ha observado en otras β-glicosidasas que actuan con retención de configuración.El estudio de la reacción de hidratación del glical G4G3G' catalizada por la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permite proponer que hay un cambio en el residu que ejerce el papel de ácido general. De manera que se propone que el Asp136 que en la reacción de hidrólisis de substratos ayuda en el posicionamiento de los resíduos catalíticos y juega un papel en la regulación de sus pKa, es el resíduo que actúa de ácido general en la reacción de hidratación de glicales. / Retaining glycosidases follow a general mechanism in which the first enzime-ligand association is followed by two catalytic steps that render the product of hydrolysis with the same anomeric configuration as the starting material. In the present work we demonstrate using mechanistic studies, basically pre-steady state kinetics and Hammett analysis, that this mechanism is too simple to properly describe the catalytic activity of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, and the following mechanism is proposed: In this mechanism, the enzim-substrate complexes adopt two productive conformations (SES* and SES**) and the balance between these two conformations depending on the nature of the substrate explains the diferent behaviours observed in pre-steady and steady state kinetics.A deep study on the importance of the interaction between the enzyme and the hydroxyl group at C2 of the glucopyranose residue that occupies the -1 subsite demonstrates that in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase this interaction is not the key interaction observed in other retaining β-glycosidases.The study of the G4G3G' glical hydration catalysed by the Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase let us propose that there is a change in the residue that acts as a general acid. We propose that Asp136, that plays a role positioning the catalytic residues and modulating their pKa in the hydrolysis reaction, acts as the general acid in the hydration of glycals.