Orientador : Prof. Dr. Marcello Iacomini / Coorientadora : Profª. Drª. Fhernanda Ribeiro Smiderle / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 21/08/2017 / Inclui referências : f. 86-100 / Resumo: O cogumelo gigante Macrocybe titans assim como os demais basidiomicetos, desperta o interesse científico devido a sua possível bioatividade, em parte decorrente da presença de polissacarídeos com variadas características estruturais. Com base nisto, o presente trabalho teve por objetivo elucidar a estrutura química de alguns polissacarídeos presentes no basidioma de M. titans, bem como verificar seu efeito biológico frente a células de melanoma murino B16F10. Para isto, o corpo de frutificação do basidiomiceto seco, moído e deslipidificado foi submetido à processos sucessivos de extrações aquosas (a frio e a quente) e alcalina (NaOH 5%). Os extratos aquosos foram precipitados com etanol e dialisados contra água destilada, enquanto que o extrato alcalino foi neutralizado e dialisado contra água corrente. O extrato obtido a frio foi purificado por tratamento com ?-amilase, congelamento e degelo e diálise em membrana (1.000 kDa). O extrato a quente foi fracionado por congelamento e degelo, tratamento com ?-amilase e tratamento com Me2SO. O extrato alcalino, por sua vez, foi purificado por congelamento e degelo, tratamento com solução de Fehling ou NaOH 2% seguido de precipitação com ácido acético. A fração E1000, obtida do extrato a frio apresentou-se homogênea, sendo composta por galactose e fucose e contendo uma massa molar estimada em 14,2 x 103 g/mol. As análises de espectroscopia e metilação sugerem que esta molécula seja uma fucogalactana com uma cadeia principal composta por ?-D-Galp ligadas (1?6), substituída a cada 2 ou 3 unidades em O-2 por terminais não redutores de ?-L-Fucp. A atividade biológica desta molécula, bem como da fração bruta R6CW obtida do extrato a frio, foi avaliada em células de melanoma murino B16F10, sendo que a fração R6CW aumentou a capacidade endocítica do corante vermelho neutro pelas células em 48 h na concentrações de 10 e 50 ?g/mL, enquanto que a proliferação celular foi aumentada em todas as concentrações testadas em 48 h. A fucogalactana, por sua vez, não causou alteração na viabilidade celular e alterou a proliferação célular apenas na concentração de 50 ?g/mL em 72 h de tratamento. A fração SSD, obtida do extrato a quente, apresentou-se composta por mais de uma molécula, contendo principalmente glucose, galactose, manose e fucose. A análise espectroscópica indicou a presença de ?-D-Glcp, ?-D-Manp, ?-L-Fucp e ?-D-Galp nesta fração, que será submetida a outras etapas de fracionamento visando a purificação da mesma. As frações SFSEA e SSIEA, obtidas do extrato alcalino, apresentaram principalmente glucose em sua composição monossacarídica. Ambas as frações ao serem analisadas por espectroscopia, apresentaram sinais correspondentes à uma ?-D-Glucana contendo uma cadeia principal formada por unidades de ?-D-Glcp ligadas (1?3), ramificada em O-6 por ?-D-Glcp, o que foi confirmado pela degradação controlada de Smith, em que o material resistente à degradação apresentou sinais correspondentes à ?-D-Glcp ligada (1?3). A análise de metilação da fração SSIEA mostrou que a glucana presente nesta fração é substituída em O-6 na proporção de 1:1, podendo estas substituições serem tanto por unidades de ?-D-Glcp quanto por cadeias laterais de ?-D-Glcp ligadas (1?6). A fração SFSEA será submetida a análise de metilação visando a elucidação da sua estrutura química. Palavras-chaves: Macrocybe titans; Glucana; Fucogalactana; Atividade biológica. / Abstract: The giant mushroom Macrocybe titans, as well as the other basidiomycetes, arouse the scientific interest due to its possible bioactivity, in part due to the presence of polysaccharides with a varied chemical structures. Based on this, this work aimed to elucidate the chemical structure of some polysaccharides of M. titans fruiting bodies, as well as evaluate its biological activity on murine melanoma cells (B16F10). Therefore, the dried, powdered and defatted fruiting bodies were submitted to successive aqueous (cold and hot) and alkaline (NaOH 5%) extractions. The aqueous extracts were precipitated with ethanol and dialyzed against distilled water, while the alkaline extract was neutralized and dialyzed against tap water. The cold water extract was purified by ƒ¿-amylase treatment, freeze and thawing process and dialysis through membrane (1,000 kDa). The hot water extract was fractionated by freeze and thawing process, ƒ¿-amylase treatment and Me2SO treatment. The alkaline extract, on its turn, was purified by freeze and thawing, treatment with Fehling solution or with NaOH 2% followed by precipitation with acetic acid. The E1000 fraction, obtained from cold water extract, was pure and contained galactose and fucose, and an estimated molar mass of 14.2 x 103 g/mol. The spectroscopy and methylation analyses suggest that this molecule is a fucogalactan with a main chain composed of ƒ¿-D-Galp (1¨6) linked, branched at O-2 position by non reducing end units of ƒ¿-L-Fucp in the proportion of 2 to 3 units. The biological activity of this molecule, as well as the crude fraction R6CW obtained from the cold water extract, was evaluated in B16F10 cells. The R6CW fraction increased the cell endocytic capacity in 48 h at 10 and 50 ƒÊg/mL, while the cell proliferation was increased in 48 h at all concentrations tested. On the other hand, the fucogalactan did not cause changes in the cell viability, and altered the proliferation only at 50 ƒÊg/mL in 72 h of treatment. The SSD fraction, obtained of hot water extract was composed of more than one molecule and contained maily glucose, galactose, mannose, and fucose. The spectroscopic analyses indicated the presence of ƒÀ-D-Glcp, ƒ¿-D-Manp, ƒ¿-L-Fucp and ƒ¿-D-Galp in this fraction, that will be submitted to other purification steps aiming its purification. The fractions SFSEA and SSIEA, obtained from alkaline extract, presented mainly glucose as monosaccharides. Both fractions, when analyzed by spectroscopy showed signals corresponding to a ƒÀ-D-glucan containing a main chain composed of ƒÀ-D-Glcp (1¨3) linked, branched at O-6 position by ƒÀ-D-Glcp, which was confirmed after Smith degradation, which generated a resistant fraction with signals corresponding to the ƒÀ-D-Glcp (1¨3)-linked. The methylation analysis of SSIEA suggested that the ƒÀ-glucan present in this fraction is branched at a rate of 1:1, and the side chains can be composed by ƒÀ-D-Glcp units or ƒÀ-D-Glcp (1¨6)-linked chains. The SFSEA fraction will be subjected to methylation analysis to determine its chemical structure. Keywords: Macrocybe titans; Glucan; Fucogalactan; Biological activity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:49:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213754.pdf: 825313 bytes, checksum: 719b942f69b3204102ad0eb0af7086d7 (MD5) / Agaricus brasiliensis (=Agaricus blazei ss. Heinem.), popularmente conhecido no Brasil como Cogumelo Medicinal, Cogumelo do Solâ, é um fungo de cultivo expressivo no país devido às suas propriedades medicinais, evidenciadas em diversos trabalhos científicos, e vem ganhando importância em diversos países, principalmente para uso nutricêutico. Estes produtos são obtidos dos cogumelos, minimamente processados e encapsulados para serem consumidos como suplementos dietéticos. São utilizados principalmente devido ao potencial terapêutico como imunomodulatórios e anti-tumoral. As frutificações de A. brasiliensis são coletadas no Brasil principalmente no estágio imaturo, quando o píleo ainda está fechado, atendendo a padrões morfológicos pré-estabelecidos. No entanto, essas frutificações imaturas ainda não atingiram máxima eficiência da biomassa fúngica, mas é nesse estágio que se obtém maior valor comercial para exportação. As frutificações maduras são geralmente de menor valor comercial, sendo muitas vezes descartadas pelos produtores ou aproveitadas na produção de nutricêuticos. A qualidade desses nutricêuticos é dependente da composição química das frutificações, particularmente em relação ao conteúdo de b-D-glucanas que constituem a parede celular do fungo. No presente estudo, foram utilizadas frutificações de A. brasiliensis (estirpe UFSC 51), coletadas em diferentes estágios de maturação - imaturas SI (píleo fechado), maduras (píleo aberto) com esporos imaturos SII e maduras com esporos maduros SIII, para se avaliar o rendimento e as características estruturais dos polissacarídeos solúveis em água a 100oC antes e após a purificação das b-D-glucanas usando-se cromatografia líquida, identificação por espectrometria (FTIR e RMN de 13C e 1H), peso molecular e teor de proteínas. Identificou-se a presença de um polímero de peso molecular superior a 1.000.000 daltons, e estrutura (1®6)-(1®3)-b-D-glucanas, com baixo teor de proteínas (em média 0,61%), nos três estágios de maturação, porém com aumento do rendimento das b-D-glucanas no estágio SII e de (1®3)-b-D-glucanas nos estágios SII e SIII. Como conseqüência, frutificações maduras de A. brasiliensis que também contêm estas importantes b-D-glucanas devem ser utilizadas na elaboração de produtos nutricêuticos. As b-D-glucanas extraídas e purificadas destas frutificações nos diferentes estágios foram avaliadas quanto à bioatividade, qualitativa e quantitativamente, sobre o processo de vascularização inicial em embriões de galinha (Gallus domesticus). Foram constatados efeitos pró-vasculogênico, com conseqüente aumento do crescimento dos embriões para todos os estágios de maturação, inclusive nas diferentes concentrações testadas para os estágios SI e SII. Estes resultados sugerem que as b-D-glucanas, isoladas das frutificações nos diferentes estágios de maturação interferem positivamente na formação de vasos sanguíneos e que o efeito pode ser mediado pela atividade imunomoduladora. Em conclusão, as frutificações maduras, que também possuem atividade pró-vasculogênica, devem ser incluídas na produção de nutricêuticos propiciando a utilização otimizada da biomassa do cogumelo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-07Bitstream added on 2014-06-13T20:44:52Z : No. of bitstreams: 1 pinto_avfs_dr_botfm.pdf: 715603 bytes, checksum: 2845d758b9af30dde6146b9a2b2a40c7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ATF (fração ácido-tratada) é uma fração polissacarídica extraída do cogumelo Agaricus brasiliensis rica em (1→6)-β-D-glucana, à qual se atribui ação imunoestimulante. No presente trabalho, avaliamos o efeito da ATF sobre a produção de citocinas, a expressão de mRNA de fatores angiogênicos e a infiltração de leucócitos no microambiente do tumor de Ehrlich, subcutaneamente implantado em camundongos BALB/c. O tratamento consistiu de 3 aplicações de ATF (0,5 mg/0,1mL) no sítio de implantação tumoral, seguido de sacrifício dos animais aos 7 ou 14 dias após a implantação do tumor. A massa tumoral foi removida para a obtenção das células infiltradas no tumor de Ehrlich e para análise do número de células secretoras de citocinas (ELISPOT). Foi realizada a análise dos fatores pró-angiogênicos pela técnica de PCR em tempo real e a presença in situ de células imunocompetentes, foi analisada através de microscopia confocal. Aos 7 dias observou-se maior número de células secretoras de IL-4 e IFN-γ no grupo Ehr/ATF e aos 14 dias a capacidade de produção de IL-10 mostrou-se aumentada no grupo Ehr, fenômeno revertido pelo tratamento com a ATF, que induziu aumento no número de células produtoras de IFN- γ. Esses achados são compatíveis com a observação de que os animais tratados com a ATF apresentaram marcação mais intensa para as células CD8+ e Mac-3+. Em relação aos fatores angiogênicos, observamos que aos 7 dias, o tratamento inibiu a produção de FGF-2 no microambiente tumoral. Assim, concluímos que a ATF, através da indução da produção de IFN-γ, foi capaz de reverter parcialmente a produção de IL-10 induzida pelas células tumorais, estabelecendo um microambiente menos favorável ao desenvolvimento do tumor. / The acid treated fraction (ATF) is a polysaccharidic (1-6)-β-D-glucan-rich fraction obtained from A. brasiliensis, with putative immunostimulatory activity. The present study was undertaken to examine the effect of ATF on cytokine production and expression of mRNA of angiogenic factors in the microenvironment of subcutaneous Ehrlich tumor mass. BALB/c mice were subcutaneously inoculated with Ehrlich tumor cells (day zero), followed by in situ administration of sterile salt solution (group Ehr) or with 0,5 mg/0,1mL of ATF (group Ehr/ATF) on day 3, 4 and 5. These animals were sacrificed on the 7th or 14th day for evaluations. Tumor tissue was removed to obtain infiltrated cells and for analyze the number of cytokine producing cells (ELISPOT). The pro-angiogenic factor were analyzed by real time PCR and phenotype of infiltrated immunocompetent cells was analyzed by confocal microscopy. On the 7th day, increased number of IL-4 and IFN-γ- producing cells was observed in the Ehr/ATF group. On the 14th day Ehr group showed increased number of IL-10-producing cells, whereas this occurrence was avoided by treatment with ATF (Her/ATF). Treatment also increased the number of IFN-γ producing cells in that time. These data are in accordance with the stronger labeling of tumor tissue for CD8 and Mac-3. Concerning to angiogenic factor, on the 7th day, the treatment decreased the FGF-2 mRNA expression by tumor tissue. In summary, our data allow us to conclude that ATF was able to partially reverse the production of IL-10 induced by tumor cells, through the induction of higher levels of IFN-γ-producing cells, perhaps establishing a more efficient immunoresponsiveness against tumor.

Orientador: Ramon Kaneno / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Denise Fecchio / Banca: Giselle Zenker / Banca: Sandra Aparecida Cororato dos Santos / Resumo: A ATF (fração ácido-tratada) é uma fração polissacarídica extraída do cogumelo Agaricus brasiliensis rica em (1→6)-β-D-glucana, à qual se atribui ação imunoestimulante. No presente trabalho, avaliamos o efeito da ATF sobre a produção de citocinas, a expressão de mRNA de fatores angiogênicos e a infiltração de leucócitos no microambiente do tumor de Ehrlich, subcutaneamente implantado em camundongos BALB/c. O tratamento consistiu de 3 aplicações de ATF (0,5 mg/0,1mL) no sítio de implantação tumoral, seguido de sacrifício dos animais aos 7 ou 14 dias após a implantação do tumor. A massa tumoral foi removida para a obtenção das células infiltradas no tumor de Ehrlich e para análise do número de células secretoras de citocinas (ELISPOT). Foi realizada a análise dos fatores pró-angiogênicos pela técnica de PCR em tempo real e a presença in situ de células imunocompetentes, foi analisada através de microscopia confocal. Aos 7 dias observou-se maior número de células secretoras de IL-4 e IFN-γ no grupo Ehr/ATF e aos 14 dias a capacidade de produção de IL-10 mostrou-se aumentada no grupo Ehr, fenômeno revertido pelo tratamento com a ATF, que induziu aumento no número de células produtoras de IFN- γ. Esses achados são compatíveis com a observação de que os animais tratados com a ATF apresentaram marcação mais intensa para as células CD8+ e Mac-3+. Em relação aos fatores angiogênicos, observamos que aos 7 dias, o tratamento inibiu a produção de FGF-2 no microambiente tumoral. Assim, concluímos que a ATF, através da indução da produção de IFN-γ, foi capaz de reverter parcialmente a produção de IL-10 induzida pelas células tumorais, estabelecendo um microambiente menos favorável ao desenvolvimento do tumor. / Abstract: The acid treated fraction (ATF) is a polysaccharidic (1-6)-β-D-glucan-rich fraction obtained from A. brasiliensis, with putative immunostimulatory activity. The present study was undertaken to examine the effect of ATF on cytokine production and expression of mRNA of angiogenic factors in the microenvironment of subcutaneous Ehrlich tumor mass. BALB/c mice were subcutaneously inoculated with Ehrlich tumor cells (day zero), followed by in situ administration of sterile salt solution (group Ehr) or with 0,5 mg/0,1mL of ATF (group Ehr/ATF) on day 3, 4 and 5. These animals were sacrificed on the 7th or 14th day for evaluations. Tumor tissue was removed to obtain infiltrated cells and for analyze the number of cytokine producing cells (ELISPOT). The pro-angiogenic factor were analyzed by real time PCR and phenotype of infiltrated immunocompetent cells was analyzed by confocal microscopy. On the 7th day, increased number of IL-4 and IFN-γ- producing cells was observed in the Ehr/ATF group. On the 14th day Ehr group showed increased number of IL-10-producing cells, whereas this occurrence was avoided by treatment with ATF (Her/ATF). Treatment also increased the number of IFN-γ producing cells in that time. These data are in accordance with the stronger labeling of tumor tissue for CD8 and Mac-3. Concerning to angiogenic factor, on the 7th day, the treatment decreased the FGF-2 mRNA expression by tumor tissue. In summary, our data allow us to conclude that ATF was able to partially reverse the production of IL-10 induced by tumor cells, through the induction of higher levels of IFN-γ-producing cells, perhaps establishing a more efficient immunoresponsiveness against tumor. / Doutor

Orientador: Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:37:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_LucianaFerracinidos_D.pdf: 770618 bytes, checksum: dd35fe6e118453b7f39ad6ca86bf2519 (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_souza_ioc_mest_2014.pdf: 1831146 bytes, checksum: 04aa0a5bc9247dd22f10b502b36fa8d1 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / β - 1,3 - glucanases estão envolvidas na digestão de insetos que utilizam como fonte nutricional detritos ou plantas . Nesse trabalho, nós investigamos o papel dos genes da família 16 das glicosídeo hidrolases (GHF 16) em larvas de Ae. aegypti e sua possível participação na digestão de leveduras. O genoma de Ae. aegypti contém seis genes (Aae GH16. 1 – Aae GH16. 6) que codificam para proteínas da família GH16 , contendo de 2 a 6 éxons. Análises filogenéticas sugerem que em Nemá toceros ocorreram duplicações em alguns genes que contê m a região catalítica conservada nessa família de proteínas (Aae GH16. 1, 2, 3, 5, 6). Ess a s proteínas são similares a outras proteínas de insetos com atividades glucanásicas. A proteína Aae GH16. 4 parece estar relacionad a a proteínas ligantes de β - 1,3 - glucana, não possuindo os resíduos catalíticos conservad os e peptídeo sinal. β - , 1,3 - glucanases e proteínas ligantes de β - glucana são proteínas homológas e parecem ter sido originadas a partir do mesmo gene ancestral , antes da diversificação dos holometábolos. Larvas de Ae. aegypti possuem atividades de β - 1,3 glucanases na cabeça, tubo digestivo e resto do corpo. A s atividade s encontradas no tubo digestivo não foram atribuídas à dieta das larvas. Essas atividades possuem uma faixa de pH ótimo entre 5 - 9 e massas moleculares de 41 kDa a 150 kDa. Larvas de Ae. aegypti se desenvolvem a partir da eclosão dos ovos até a fase adulta em uma dieta exclusiva contendo leveduras Ustilago sp (vivas ou autoclavadas), porém esta condição não provocou uma indução das atividades de β - 1,3 - glucanases. O homogenato do tubo digestivo das larvas parece lisar a parede das leveduras após 4 h de incubação. Todos os genes da família GH16 foram expressos em todos os tecidos e apresentaram diferentes padrões de expressão. Larvas silenci adas para os genes AeGH 16. 5 da GHF 16 apresentaram fenótipos de curvas de sobrevivência e taxas de pupação inferiores aos controles. Sob condições de estresse, o fenótipo observado nas larvas se agrava consideravelmente, principalmente nos genes AeGH16.1 e AeGH16.6. Nos experimentos de ensaios enzimáticos d e β - 1,3 - glucanases, insetos silenciados para o gene AeGH16. 5 apresent aram uma atividade muito inferior comparado s aos silenciados para AeGH16.6 ou a os grupos controles (GFP e água) em amostras de tubo digestivo. Ensaios nesses grupos utilizando o resto d o corpo não sofreram alterações. O perfil cromatográfico do tubo digestivo também foi analisado, e novamente insetos silenciados para AeGH16. 5 apresent aram um pico de atividade menor que os demais , sugerindo que esse gene codifica a  - 1,3 - glucanase intestinal em larvas de Ae.aegypti / Insect β - 1 , 3 - glucanases are involved in digestion of detritus and plant hemicellulose. We investigated the role of GH16 genes in Ae.aegypti larvae , and its putative participation in digestion of fungi. The genome of Ae.aegypti contains six genes coding for GHF16 proteins (Aae GH16.1 – Aae GH16.6), containing 2 - 6 exons. Phylogenetic analysis suggest s that Aae GH16.1 , 2, 3, 5 and 6 , which contain the GHF16 conserved catalytic residues , are related to other insect glucanases . These genes apparently suffered duplications in the genomes of Nematocera. Aae GH16.4 is related to β - 1,3 - glucan binding proteins, which have no catalytic activity. β - 1,3 - glucanases and β - glucan binding proteins are homologous proteins, which originated by gene duplication prior to the origin of the Holometabola. Ae.aegypti larvae contain β - 1, 3 - glucanase activity in the head, gut and rest of body. Gut activity is not acquired from food. These activities have optimum pH about 5 - 6 and molecular masses between 41 and 150 kDa. Ae.aegypti develops well from egg to adults feeding on ly on live or autoclaved yeasts and activity of β - 1, 3 - glucanases is not induced by both diets. Larval gut homogenates lyse live Ustilago sp af ter 4 hours of incubation. All GH16 genes showed different levels of expression in the larval head, gut or rest of body. Larvae k nock - down of gene AeGH16. 5 of GHF 16 showed phenotype with survival curve and rate of pupation lower than control s (GFP and water) . However, under stress conditions severe mortalities are observed in AeGH16.1 and AeGH16.6 knocked - down larvae . Enzy matic assays of β - 1 , 3 - glucanase in AeGH16.5 silenced larvae exhibited lower activity in the gut and no change in the rest of body . Chromatographic activity profiles from gut samples after GH16.5 silencing showed lower activity, suggesting that this gene codes for the larval digestive  - 1 , 3 - glucanase

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T19:03:41Z : No. of bitstreams: 1 carneiro_aaj_dr_rcla_parcial.pdf: 344876 bytes, checksum: f4257e3a50f28d8e5fbbfc16ac265fb6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-04T11:39:25Z: carneiro_aaj_dr_rcla_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-04T11:40:11Z : No. of bitstreams: 1 000687526.pdf: 2190725 bytes, checksum: 76a291fbe3368473b4a2340b9a8996c5 (MD5) / As glucanas fúngicas têm sido muito estudadas por apresentarem respostas biológicas benéficas à saúde. O Agaricus blazei, conhecido popularmente como cogumelo do sol, é um basidiomiceto que apresenta propriedades funcionais devido às β-glucanas. Os fungos Trichoderma harzinaum e Trichoderma reesei foram capazes de se desenvolverem em Agaricus blazei em pó como única fonte de carbono produzindo β-1,3-glucanases, analisadas por superfície de resposta. As enzimas hidrolisaram β-glucanas de A. blazei e produziu glucose e diferentes glucooligossacarídeos. As enzimas brutas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram menos de 15 % de glucana e em torno de 40 % de laminarina (β-1,3 glucana comercial), após 60 minutos, respectivamente. Utilizando a β-1,3-glucanase bruta de T. harzianum foram detectados gentiobiose e laminaritriose nos hidrolisados enzimáticos de β- glucana e laminarina, enquanto a laminaritetraose, celotetraose e celotriose foram identifificados e quantificados apenas nos hidrolisados de β-glucana de A. blazei. A ação da β- 1,3-glucanase bruta de T. reesei sobre a laminarina e glucana de A. blazei resultou em glicose e gentiobiose. O que sugere uma possível diferença na ação catalítica das duas enzimas. As enzimas parcialmente purificadas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram 47 e 85 % de laminarina, respectivamente. A β-1,3-glucanase purificada de T. harzianum não degradou a glucana de A. blazei, e a enzima purificada de T. reesei degradou 2,6 % de glucana, após 60 minutos, no entanto, gentiobiose e laminaritriose foram detectados no hidrolisado de laminarina. Utilizando a enzima parcialmente purificada de T. reesei gentiobiose foi detectado no hidrolisado de glucana e de laminarina, e celotriose e laminaritriose foram detectados apenas no hidrolisado de laminarina. A fim de conhecer melhor... / Fungal glucans have been studied extensively because of their biological responses, which have been shown to possess health benefits. Agaricus blazei, commonly known as mushroom of the sun, is a basidiomycete that has functional properties because of its β-glucans. The fungi Trichoderma harzinaum and Trichoderma reesei were able to develop in a powdered form of A. blazei, which served as the only carbon source. The result was the production of β- 1,3-glucanases, which were analyzed using response surface methodology. The enzymes hydrolyzed the β-glucans of A. blazei, and produced glucose and different glucooligosaccharides. The crude enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed less than 15% of glucan and approximately 40% of laminarin after 60 minutes, respectively. Using crude β-1,3-glucanase from T. harzianum, gentiobiose and laminaritriose were detected in enzymatic hydrolysates of β-glucan and laminarin, while laminaritetraose, cellotriose and celotetraose were identified and quantified only in the hydrolysates of the β-glucan of A. blazei. The action of the crude β-1,3-glucanase of T. reesei on the laminarin and glucan of A. blazei resulted in glucose and gentiobiose. These results suggest a possible difference in the catalytic action of the two enzymes. The partially purified enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed 47% and 85% of laminarin, respectively. The purified β-1,3-glucanase from T. harzianum did not degrade the glucan of A. blazei, and the purified enzyme from T. reesei degraded 2.6% of the glucan after 60 minutes; however, gentiobiose and laminaritriose were detected in the hydrolyzates of laminarin. Using partially purified enzymes from T. reesei, gentiobiose was detected in the hydrolyzates of both glucan and laminarin, and laminaritriose and cellotriose and were detected... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Inês Conceição Roberto / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Eleni Gomes / Resumo: As glucanas fúngicas têm sido muito estudadas por apresentarem respostas biológicas benéficas à saúde. O Agaricus blazei, conhecido popularmente como cogumelo do sol, é um basidiomiceto que apresenta propriedades funcionais devido às β-glucanas. Os fungos Trichoderma harzinaum e Trichoderma reesei foram capazes de se desenvolverem em Agaricus blazei em pó como única fonte de carbono produzindo β-1,3-glucanases, analisadas por superfície de resposta. As enzimas hidrolisaram β-glucanas de A. blazei e produziu glucose e diferentes glucooligossacarídeos. As enzimas brutas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram menos de 15 % de glucana e em torno de 40 % de laminarina (β-1,3 glucana comercial), após 60 minutos, respectivamente. Utilizando a β-1,3-glucanase bruta de T. harzianum foram detectados gentiobiose e laminaritriose nos hidrolisados enzimáticos de β- glucana e laminarina, enquanto a laminaritetraose, celotetraose e celotriose foram identifificados e quantificados apenas nos hidrolisados de β-glucana de A. blazei. A ação da β- 1,3-glucanase bruta de T. reesei sobre a laminarina e glucana de A. blazei resultou em glicose e gentiobiose. O que sugere uma possível diferença na ação catalítica das duas enzimas. As enzimas parcialmente purificadas do T. harzianum e T. reesei hidrolisaram 47 e 85 % de laminarina, respectivamente. A β-1,3-glucanase purificada de T. harzianum não degradou a glucana de A. blazei, e a enzima purificada de T. reesei degradou 2,6 % de glucana, após 60 minutos, no entanto, gentiobiose e laminaritriose foram detectados no hidrolisado de laminarina. Utilizando a enzima parcialmente purificada de T. reesei gentiobiose foi detectado no hidrolisado de glucana e de laminarina, e celotriose e laminaritriose foram detectados apenas no hidrolisado de laminarina. A fim de conhecer melhor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fungal glucans have been studied extensively because of their biological responses, which have been shown to possess health benefits. Agaricus blazei, commonly known as "mushroom of the sun," is a basidiomycete that has functional properties because of its β-glucans. The fungi Trichoderma harzinaum and Trichoderma reesei were able to develop in a powdered form of A. blazei, which served as the only carbon source. The result was the production of β- 1,3-glucanases, which were analyzed using response surface methodology. The enzymes hydrolyzed the β-glucans of A. blazei, and produced glucose and different glucooligosaccharides. The crude enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed less than 15% of glucan and approximately 40% of laminarin after 60 minutes, respectively. Using crude β-1,3-glucanase from T. harzianum, gentiobiose and laminaritriose were detected in enzymatic hydrolysates of β-glucan and laminarin, while laminaritetraose, cellotriose and celotetraose were identified and quantified only in the hydrolysates of the β-glucan of A. blazei. The action of the crude β-1,3-glucanase of T. reesei on the laminarin and glucan of A. blazei resulted in glucose and gentiobiose. These results suggest a possible difference in the catalytic action of the two enzymes. The partially purified enzymes of T. harzianum and T. reesei hydrolyzed 47% and 85% of laminarin, respectively. The purified β-1,3-glucanase from T. harzianum did not degrade the glucan of A. blazei, and the purified enzyme from T. reesei degraded 2.6% of the glucan after 60 minutes; however, gentiobiose and laminaritriose were detected in the hydrolyzates of laminarin. Using partially purified enzymes from T. reesei, gentiobiose was detected in the hydrolyzates of both glucan and laminarin, and laminaritriose and cellotriose and were detected... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

CAPES / O mercado mundial de polissacarídeos tem atraído grandes companhias industriais interessadas em conquistar novos e rentáveis campos de atuação. Polissacarídeos com propriedades tecnológicas e biológicas podem ser obtidos a partir de plantas, algas e de microrganismos. Dentre os polissacarídeos com propriedades biológicas, as glucanas tem se destacado por apresentarem atividade imunoestimulante e potencialidades no tratamento de doenças como câncer, hipercolesterolemia, diabetes, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares. Recentes estudos demonstram a produção extracelular de β-glucanas por fungos filamentosos em cultivos submersos. A modificação na estrutura química das glucanas por carboximetilação é considerada uma importante rota para melhorar suas propriedades, podendo contribuir para o aumento da solubilidade da molécula, bem como atividades biológicas, especialmente aquelas associadas a mecanismos de ação antioxidante e antiproliferativa. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo a produção de β-1,6-D-glucana (lasiodiplodana) pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI em cultivo submerso, bem como a carboximetilação da molécula, caracterização e avaliação da citotoxicidade e atividade antioxidante. A carboximetilação da molécula foi confirmada através da verificação de sinais químicos específicos identificados por espectroscopia de FT-IR e RMN 13C e a molécula carboximetilada apresentou grau de substituição (DS) de 1,27. A análise térmica (TG/DTA) indicou que a amostra bruta e carboximetilada apresentaram quatro estágios de perda de massa. O primeiro estágio ocorreu em 125ºC (perda de água) e houve dois eventos consecutivos de perda de massa (200ºC-400ºC) atribuídos à degradação da molécula. O quarto estágio ocorreu entre 425ºC e 620ºC (decomposição final) com pico exotérmico em 510ºC. Análise por MEV indicou que a lasiodiplodana bruta apresenta estruturas granulares que se rompem após carboximetilação. Análise de DRX demonstrou que o polímero bruto e carboximetilado apresentam estrutura não cristalina. A carboximetilação contribuiu para melhorar a hidrossolubulidade da molécula (aumento de 60%) e para melhorar a atividade antioxidante avaliada pela capacidade de captura dos radicais ABTS, DPPH e poder redutor do íon férrico (FRAP). Não foi verificado efeito citotóxico da lasiodiplodana bruta e modificada sobre hemácias. Os resultados obtidos sugerem que a carboximetilação da lasiodiplodana pode contribuir para melhoria das propriedades biológicas e para o potencial de uso biotecnológico da molécula. / The world market of polysaccharides has attracted large industrial companies interested in gaining new and profitable fields. Polysaccharides with technological and biological properties can be obtained from plants, algae and microorganisms. Among the polysaccharides with biological properties, glucans have been highlighted by demonstrate immunostimulatory activity and potential for treating diseases such as cancer, hypercholesterolemia, diabetes, multiple sclerosis and cardiovascular diseases. Recent studies demonstrate the production of exocellular β-glucans by filamentous fungi in submerged cultivations. Modifications in the chemical structure of glucans by carboxymethylation is considered an important route to improve its properties, may contribute to the increased solubility of the molecule as well as biological activities, especially those associated with antioxidant and antiproliferative mechanisms of action. Therefore, the present work aimed the production of β-1,6-D glucan (lasiodiplodana) by the Lasiodiplodia theobromae MMPI fungus in submerged cultivation and carboxymethylation of the molecule, characterization and evaluation of cytotoxicity and antioxidant activity. The carboxymethylation of the molecule was confirmed by checking specific chemical signals identified by FT-IR and NMR and 13C spectroscopy. Carboxymethylated molecule presented degree of substitution (DS) of 1.27. Thermal analysis (TG / DTA) indicated that native and carboxymethylated samples had four stages of mass loss. The first stage was at 125 ºC (loss of water) and there were two consecutive events of weight loss (200 ºC - 400 ºC) attributed to the degradation of the molecule. The fourth stage occurred between 425 ºC and 620 ºC (final decomposition) with exothermic peak at 510 ºC. SEM analysis indicated that the raw lasiodiplodan presents granular structures which are broken after carboxymetylation. XRD analysis showed that native and carboxymethylated biopolymers have no crystalline structure. Carboxymethylation aided to improve water solubility the molecule (60% increase) and to improve antioxidant activity assessed by ability to capture the ABTS, DPPH radical scavenging and the ferric ion reducing power (FRAP). There was no cytotoxic effect of raw lasiodiplodana and modified on the erythrocytes. The results suggest that the carboxymethylation of lasiodiplodan can contribute to improved biological properties and the potential biotechnological use of the molecule.

CAPES / O mercado mundial de polissacarídeos tem atraído grandes companhias industriais interessadas em conquistar novos e rentáveis campos de atuação. Polissacarídeos com propriedades tecnológicas e biológicas podem ser obtidos a partir de plantas, algas e de microrganismos. Dentre os polissacarídeos com propriedades biológicas, as glucanas tem se destacado por apresentarem atividade imunoestimulante e potencialidades no tratamento de doenças como câncer, hipercolesterolemia, diabetes, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares. Recentes estudos demonstram a produção extracelular de β-glucanas por fungos filamentosos em cultivos submersos. A modificação na estrutura química das glucanas por carboximetilação é considerada uma importante rota para melhorar suas propriedades, podendo contribuir para o aumento da solubilidade da molécula, bem como atividades biológicas, especialmente aquelas associadas a mecanismos de ação antioxidante e antiproliferativa. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo a produção de β-1,6-D-glucana (lasiodiplodana) pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI em cultivo submerso, bem como a carboximetilação da molécula, caracterização e avaliação da citotoxicidade e atividade antioxidante. A carboximetilação da molécula foi confirmada através da verificação de sinais químicos específicos identificados por espectroscopia de FT-IR e RMN 13C e a molécula carboximetilada apresentou grau de substituição (DS) de 1,27. A análise térmica (TG/DTA) indicou que a amostra bruta e carboximetilada apresentaram quatro estágios de perda de massa. O primeiro estágio ocorreu em 125ºC (perda de água) e houve dois eventos consecutivos de perda de massa (200ºC-400ºC) atribuídos à degradação da molécula. O quarto estágio ocorreu entre 425ºC e 620ºC (decomposição final) com pico exotérmico em 510ºC. Análise por MEV indicou que a lasiodiplodana bruta apresenta estruturas granulares que se rompem após carboximetilação. Análise de DRX demonstrou que o polímero bruto e carboximetilado apresentam estrutura não cristalina. A carboximetilação contribuiu para melhorar a hidrossolubulidade da molécula (aumento de 60%) e para melhorar a atividade antioxidante avaliada pela capacidade de captura dos radicais ABTS, DPPH e poder redutor do íon férrico (FRAP). Não foi verificado efeito citotóxico da lasiodiplodana bruta e modificada sobre hemácias. Os resultados obtidos sugerem que a carboximetilação da lasiodiplodana pode contribuir para melhoria das propriedades biológicas e para o potencial de uso biotecnológico da molécula. / The world market of polysaccharides has attracted large industrial companies interested in gaining new and profitable fields. Polysaccharides with technological and biological properties can be obtained from plants, algae and microorganisms. Among the polysaccharides with biological properties, glucans have been highlighted by demonstrate immunostimulatory activity and potential for treating diseases such as cancer, hypercholesterolemia, diabetes, multiple sclerosis and cardiovascular diseases. Recent studies demonstrate the production of exocellular β-glucans by filamentous fungi in submerged cultivations. Modifications in the chemical structure of glucans by carboxymethylation is considered an important route to improve its properties, may contribute to the increased solubility of the molecule as well as biological activities, especially those associated with antioxidant and antiproliferative mechanisms of action. Therefore, the present work aimed the production of β-1,6-D glucan (lasiodiplodana) by the Lasiodiplodia theobromae MMPI fungus in submerged cultivation and carboxymethylation of the molecule, characterization and evaluation of cytotoxicity and antioxidant activity. The carboxymethylation of the molecule was confirmed by checking specific chemical signals identified by FT-IR and NMR and 13C spectroscopy. Carboxymethylated molecule presented degree of substitution (DS) of 1.27. Thermal analysis (TG / DTA) indicated that native and carboxymethylated samples had four stages of mass loss. The first stage was at 125 ºC (loss of water) and there were two consecutive events of weight loss (200 ºC - 400 ºC) attributed to the degradation of the molecule. The fourth stage occurred between 425 ºC and 620 ºC (final decomposition) with exothermic peak at 510 ºC. SEM analysis indicated that the raw lasiodiplodan presents granular structures which are broken after carboxymetylation. XRD analysis showed that native and carboxymethylated biopolymers have no crystalline structure. Carboxymethylation aided to improve water solubility the molecule (60% increase) and to improve antioxidant activity assessed by ability to capture the ABTS, DPPH radical scavenging and the ferric ion reducing power (FRAP). There was no cytotoxic effect of raw lasiodiplodana and modified on the erythrocytes. The results suggest that the carboxymethylation of lasiodiplodan can contribute to improved biological properties and the potential biotechnological use of the molecule.