Ο μυς weaver αποτελεί ένα γενετικό ζωϊκό μοντέλο της νόσου Parkinson που χαρακτηρίζεται από προοδευτική εκφύλιση των κυττάρων της μελαινοραβδωτής ντοπαμινεργικής οδού. Η μεταβολή της γλουταμινεργικής διαβίβασης στο κύκλωμα των βασικών γαγγλίων ως απόκριση στη ντοπαμινεργική εκφύλιση έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία της νόσου Parkinson. Οι ιδιότητες των υποδοχέων του γλουταμινικού εξαρτώνται από τη σύνθεση των υπομονάδων τους και τη φωσφορυλίωσή αυτών, καθώς και από τη σύνθεση του πρωτεϊνικού συμπλόκου που σχηματίζεται ενδοκυττάρια μετά την ενεργοποίηση των υποδοχέων, μέρος του οποίου είναι η ασβεστιοεξαρτώμενη κινάση της καλμοδουλίνης ΙΙ (CaMKII), ένα μόριο σημαντικό στη συναπτική πλαστικότητα. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε, με την μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης, σε ολικό ομογενοποίημα ραβδωτού μυών weaver και φυσιολογικών, τις αλλαγές που παρατηρούνται στην πρωτεϊνική έκφραση και φωσφορυλίωση των υπομονάδων των υποδοχέων του γλουταμινικού και της αCaMKII στις ηλικίες των 3 και 6 μηνών. Στην ηλικία των 3 μηνών αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στους μύες weaver σε σχέση με τους φυσιολογικούς των πρωτεϊνικών επιπέδων των υπομονάδων GluN2A και GluN2B του υποδοχέα NMDA κατά 74% και 92% και της υπομονάδας GluA1 του υποδοχέα AMPA κατά 108%. Στην ηλικία των 6 μηνών, δεν ανευρέθησαν αλλαγές στο ραβδωτό των μυών weaver στα επίπεδα έκφρασης των GluN2A και GluA1, ενώ παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της GluN2B κατά 21%. Επιπλέον, στην ηλικία των 3 μηνών αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης της GluN2B στη σερίνη 1303 κατά 40% και της GluA1 στις σερίνες 831 και 845 κατά 40% και 38%, αντίστοιχα, στους μύες weaver σε σχέση με τους φυσιολογικούς, ενώ στην ηλικία των 6 μηνών αύξηση της φωσφορυλιωμένης GluN2B κατά 22%. Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματά μας ανέδειξαν στο ραβδωτό των μυών weaver στατιστικά σημαντική αύξηση της φωσφoρυλίωσης της αCaMKII στη θρεονίνη 286 κατά 176%, ενώ τα επίπεδα της ολικής CaMKII δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά είτε στους 3 είτε στους 6 μήνες. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι διακριτοί βαθμοί εκφύλισης των ντοπαμινεργικών νευρώνων επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο την έκφραση και φωσφορυλίωση των υποδοχέων γλουταμινικού και της αCaMKII στο ραβδωτό. Τα ευρήματα σε αυτό το γενετικό παρκινσονικό μοντέλο προτείνουν ότι η γλουταμινεργική διαβίβαση στο ραβδωτό παίζει πιθανά σημαντικό ρόλο στη συναπτική πλαστικότητα και στην κινητική συμπεριφορά, που έπονται της σταδιακής και χρόνιας έλλειψης ντοπαμίνης στη νόσο Parkinson, με βιοχημικά επακόλουθα πέρα από αυτά που παρατηρούνται στα οξέα τοξικά μοντέλα. / Weaver mutant mouse is a valuable tool to further our understanding of Parkinson’s disease (PD) pathogenesis since dopaminergic neurons of the nigro-striatal pathway undergo spontaneous and progressive cell death. Abnormalities in striatal glutamate transmission as a response to dopaminergic degenaration have been associated with the pathophysiology of Parkinson disease. The physiological properties of glutamate receptors depend on their subunit composition and phosphorylation along with the composition of the protein complex formed downstream of receptor activation, where α-subunit of calcium–calmodulin-dependent protein kinase II (αCaMKII), a molecule important to synaptic plasticity, participates. In the present study, using immuoblotting in total striatal homogenate, we investigated the changes in protein expression and phosphorylation of glutamate receptor subunits and αCaMKII at the end of the third and sixth postnatal month. We found increased expression levels of GluN2A and GluN2B subunits of NMDA receptors and GluA1 subunit of AMPA receptors by 74%, 92% and 108% in the 3-month-old weaver striatum compared to control. In the 6-month-old weaver striatum, no changes were detected in GluN2A and GluA1 expression levels, whereas GluN2B showed a 21% statistically significant increase. Our results also indicated increased phosphorylations of GluN2B at serine 1303 by 40% and GluA1 at serines 831 and 845 by 40% and 38% in the 3-month-old and increased GluN2B phosphorylation by 22% in the 6-month-old weaver striatum compared to control. Furthermore, our results showed increased pCaMKIIThr286 phosphorylation by 176% in the 6 month-old weaver striatum, while total CaMKII protein levels were not altered at either 3- or 6-month-old weaver. Our results indicate that distinct degrees of DA neuron degeneration differentially affect expression and phosphorylation of striatal glutamate receptors and αCaMKII. Findings on this genetic parkinsonian model suggest that striatal glutamatergic signaling may play an important role in synaptic plasticity and motor behavior that follow progressive and chronic dopamine depletion in PD with biochemical consequences beyond those seen in acute toxic models.

A positive correlation exists between increasing age and the incidence of hippocampal-associated dysfunction and disease. Normal L-glutamate neurotransmission is absolutely critical for hippocampal function, while abnormal glutamate neurotransmission has been implicated in many neurodegenerative diseases. Previous studies, overwhelmingly utilizing ex vivo methods, have filled the literature with contradicting reports about hippocampal glutamate regulation during aging. For our studies, enzyme-based ceramic microelectrode arrays (MEA) were used for rapid (2 Hz) measurements of extracellular glutamate in the hippocampal trisynaptic pathway of young (3-6 months), late-middle aged (18 mo.) and aged (24 mo.) urethane-anesthetized Fischer 344 rats. Compared to young animals, glutamate terminals in cornu ammonis 3 (CA3) showed diminished potassium-evoked glutamate release in aged rats. In late-middle aged animals, terminals in the dentate gyrus (DG) showed increased evoked release compared to young rats. The aged DG demonstrated an increased glutamate clearance capacity, indicating a possible age-related compensation to deal with the increased glutamate release that occurred in late-middle age. To investigate the impact of changes in glutamate regulation on the expression of a disease process, we modified the MEA technology to allow recordings in unanesthetized rats. These studies permitted us to measure glutamate regulation in the hippocampal formation without anesthetic effects, which showed a significant increase in basal glutamatergic tone during aging. Status epilepticus was induced by local application of 4-aminopyridine. Realtime glutamate measurements allowed us to capture never-before-seen spontaneous and highly rhythmic glutamate release events during status epilepticus. A significant correlation between pre-status tonic glutamate and the quantity of status epilepticus-associated convulsions and glutamate release events was determined. Taken together, this body of work identifies the DG and CA3 as the loci of age-associated glutamate dysregulation in the hippocampus, and establishes elevated levels of glutamate as a key factor controlling severity of status epilepticus in aged animals. Based upon the potential ability to discriminate brain areas experiencing seizure (i.e. synchronized spontaneous glutamate release) from areas not, we have initiated the development of a MEA for human use during temporal lobe resection surgery. The final studies presented here document the development and testing of a human microelectrode array prototype in non-human primates.

An overarching goal of the Gerhardt laboratory is the development of an implantable neural device that allows for long-term glutamate recordings in the hippocampus. Proper L-glutamate regulation is essential for hippocampal function, while glutamate dysregulation is implicated in many neurodegenerative diseases. Direct evidence for subregional glutamate regulation is lacking in previous in vivo studies because of limitations in the spatio-temporal resolution of conventional experimental techniques. We used novel enzyme-coated microelectrode arrays (MEAs) for rapid measurements (2Hz) of extracellular glutamate in urethane-anesthetized rats. Potassium-evoked glutamate release was highest in the cornu ammonis 1 (CA1) subregion and lowest in the cornu ammonis 3 (CA3). In the dentate gyrus (DG), evoked-glutamate release was diminished at a higher potassium concentration but demonstrated faster release kinetics. These studies are the first to show subregion specific regulation of glutamate release in the hippocampus. To allow for in vivo glutamate measurements in awake rats, we have adapted our MEAs for chronic use. Resting glutamate measurements were obtained up to six days post-implantation but recordings were unreliable at later time points. To determine the cause(s) for recording failure, a detailed investigation of MEA surface characteristics was conducted. Scanning electron microscopy and atomic force microscopy showed that PT sites have unique surface chemistry, a microwell geometry and nanometer-sized features, all of which appear to be favorable for high sensitivity recordings. Accordingly, studies were initiated to improve enzyme coatings using a computer-controlled microprinting system (Microfab Technologies, Plano, TX). Preliminary testing showed that microprinting allowed greater control over the coating process and produced MEAs that met our performance criteria. Our final studies investigated the effects of chronic MEA implantation. Immunohistochemical analysis showed that the MEA produced minimal damage in the hippocampus at all time points from 1 day to 6 months. Additionally, tissue attachment to the MEA surface was minimal. Taken together with previous electrophysiology data supporting that MEAs are functional up to six months, these studies established that our chronic MEAs technology is capable of maintaining a brain-device interface that is both functional and biocompatible for extended periods of time.

Le glutamate de sodium (MSG) est un exhausteur de goût abondamment utilisé dans le monde entier pour son goût unique appelé " umami ". Au vu des données bibliographiques qui suggèrent que, le L-glutamate en tant qu'acide aminé libre peut représenter un signal dans plusieurs fonctions physiologiques de par la présence de récepteurs au glutamate au niveau périphérique ; nous avons étudié les effets d'une supplémentation en MSG sur la physiologie gastro-intestinale, les sécrétions pancréatiques et le métabolisme dans le modèle expérimental rat et chez des volontaires sains. Chez le rat, une supplémentation en MSG pendant 15 jours à hauteur de 2 g pour 100 g d'aliment provoquait une diminution de l'activité glutaminase intestinale et une augmentation de la concentration circulante de glutamine ainsi qu'une augmentation transitoire de l'insulinémie. Par contre, aucun effet sur la vidange gastrique et le transit gastro-intestinal n'a été observé malgré une accumulation de glutamate pendant 5 h dans l'estomac et pendant 1 h dans l'intestin grêle après le repas. <br />Chez le volontaire sain, une supplémentation en MSG à hauteur de 2 g par jour pendant 7 jours entraînait une augmentation de l'aire antrale de l'estomac pendant 2 h après le repas par rapport à une dose iso-sodée de NaCl. Cette phase précoce postprandiale était associée à une augmentation des concentrations circulantes d'acide glutamique, de leucine, d'isoleucine, de cystéine, de tyrosine, d'ornithine et de sérine. Cependant, l'augmentation de l'aire antrale de l'estomac n'était apparemment pas associée à un effet sur la vidange gastrique puisque le MSG était sans effet sur le devenir de l'azote alimentaire. La réponse hormonale (insuline, GLP-1 et ghréline) n'est pas non plus modifiée. Enfin, les sensations de faim et de satiété mesurées par échelles analogiques visuelles n'étaient pas non plus influencées par la consommation de MSG. L'effet du MSG sur les sécrétions gastriques en tant que déterminant de l'augmentation de la distension antrale sans modification de la vidange gastrique est discuté ainsi qu'un éventuel effet d'épargne du glutamate sur le catabolisme de certains acides aminés par l'intestin. <br />Ces résultats ont permis de mettre en évidence des effets d'une supplémentation en MSG sur des paramètres métaboliques et physiologiques sans effet délétère mesuré. D'autres études sont nécessaires afin de mieux comprendre les mécanismes d'action du MSG.

High salt intake contributes to the development of hypertension in salt-sensitive humans and animals and the mechanistic causes are poorly understood. In Dahl salt-sensitive (S) but not salt-resistant (R) rats, high salt diet increases cerebrospinal fluid (CSF) [Na+] and activates an aldosterone-mineralocorticoid receptor-epithelial sodium channel-endogenous ouabain (MR-ENaC-EO) neuromodulatory pathway in the brain that enhances the activity of sympatho-excitatory angiotensinergic and glutamatergic pathways, leading to an increase in sympathetic nerve activity (SNA) and blood pressure (BP). We hypothesize that high salt diet in Dahl S rats enhances Ang II release in the paraventricular nucleus (PVN), causing a decrease in local nitric oxide (NO) action and an increase in local glutamate release thereby elevating SNA, BP and heart rate (HR). The present study evaluated the effects of agonists or blockers of MR, ENaC, EO, nitric oxide synthase (NOS) or glutamate and AT1-receptors on the BP and HR responses to acute infusions of Na+ rich aCSF, intracerebroventricularly (icv), or in the PVN of Dahl S, R or Wistar rats or to high salt diet in Dahl S and R rats. In Wistar rats, aldosterone in the PVN enhanced the BP and HR responses to infusion of Na+ rich aCSF in the PVN, but not in the CSF, and only the enhancement was prevented by blockers of MR, ENaC and EO in the PVN. AT1-receptor blockers in the PVN fully blocked the enhancement by aldosterone and the responses to infusion of Na+ rich aCSF icv, or in the PVN. Na+ rich aCSF in the PVN caused larger increases in BP and HR in Dahl S vs. R rats and the responses to Na+ were fully blocked by an AT1-receptor blocker in the PVN. BP and HR responses to a NOS blocker in the PVN were the same, but L-NAME enhanced Na+ effects more in Dahl R than S rats. High salt diet attenuated increases in BP from L-NAME in the PVN of Dahl S but not R rats. AT1 and glutamate receptor blockers candesartan and kynurenate in the PVN decreased BP in Dahl S but not R rats on high salt diet. At the peak BP response to candesartan, kynurenate in the PVN further decreased BP whereas candesartan did not further decrease BP at the peak BP response to kynurenate. Our findings indicate that both an acute increase in CSF [Na+] and high salt intake in Dahl S rats increases AT1-receptor activation and decreases NO action in the PVN thereby contributing to the pressor responses to Na+ and presumably, to dietary salt-induced hypertension. The increased BP response to AT1-receptor activation in the PVN of Dahl S is mediated by enhanced local glutamate receptor activation. An MR-ENaC-EO pathway in the PVN can be functionally active and further studies need to assess its role in Dahl S rats on high salt intake.

Thesis questions: • Is the glutaminergic system altered in rotator cuff tendinopathy? • Is the glutaminergic system altered by common treatments? • Are glutaminergic changes related to pain symptoms? • What are the effects of glutamate and glutamate receptor modulation on tendon derived cells? Summary answers: • The glutaminergic system is altered in rotator cuff tendinopathy • Changes within this system are seen after common treatments • Specific glutaminergic changes are associated with the resolution of pain following shoulder surgery but do not predict the severity of pain symptoms • Glutamate has significant effects on tendon derived cells. What is known: It is known that extracellular glutamate concentrations are increased in both Achilles and patellar tendinopathy. It has also been previously shown that the glutamate receptors NMDAR1 and mGluR5 are upregulated in patellar tendinopathy. What this thesis adds: This thesis has shown for the first time that glutamate and NMDAR1 are increased in rotator cuff tendinopathy. Increases in cell proliferation, vascularity and HIF1α are seen after surgical rotator cuff repair and these features are not seen after glucocorticoid injection. There are significant differences between painful and pain-free rotator cuff tendons in terms of glutamate receptor expression (KA1, mGluR7 and mGluR2) and inflammatory cell numbers (CD45 and CD206). Exposure to 1.875mM glutamate for 72 hours results in reduced cell viability, decreased collagen (COL1A1 and COL3A1) and increased aggrecan gene expression; NMDAR antagonism with MK-801 attenuates the deleterious effect on cell viability but had no effect on the changes in matrix gene expression. Bias, confounding and other reasons for caution: The observational histological work was limited by the control tissue. Some control tissue was not age matched, while some of the pain-free control tendons were post-surgical intervention. Confounding factors include tendon structure, length of symptoms and previous treatments. Caution must be applied when discussing the in vivo implications of the in vitro work.

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De nombreuses études ont établi que la majorité des neurones libèrent plus qu’une substance chimique. Il est bien connu que les neurones peuvent co-exprimer et co-libérer des neuropeptides en plus de leur neurotransmetteur, mais des évidences de la co-libération de deux petits neurotransmetteurs à action rapide se sont accumulées récemment. Des enregistrements électrophysiologiques ont aussi montré que des neurones sérotoninergiques et dopaminergiques isolés peuvent libérer du glutamate quand ils sont placés en culture. De plus, la présence de glutamate et de glutaminase a été détectée dans des neurones sérotoninergiques, dopaminergiques et noradrénergiques par immunomarquage sur des tranches de cerveau. Malheureusement, en considérant le rôle métabolique du glutamate, sa détection immunologique n’est pas suffisante pour assurer le phénotype glutamatergique d’un neurone. Récemment, la découverte de trois transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUT1-3) a grandement facilité l’identification des neurones glutamatergiques. Ces transporteurs sont nécessaires pour la libération de glutamate et constituent les premiers marqueurs morphologiques du phénotype glutamatergique. Il a été démontré que des neurones noradrénergiques expriment VGLUT2 et que des neurones sérotoninergiques expriment VGLUT3. Mais aucune évidence d’expression d’un des sous-types de VGLUT n’a été reportée pour les neurones dopaminergiques. Le but de notre travail était d’identifier quel sous-type de VGLUT est exprimé par les neurones dopaminergiques mésencéphaliques, et de déterminer si le phénotype glutamatergique de ces neurones peut être modulé dans des conditions particulières. Premièrement, nous avons utilisé des microcultures pour isoler les neurones dopaminergiques et des doubles marquages immunocytochimiques pour observer l’expression de VGLUT dans les neurones positifs pour la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons montré que la majorité (80%) des neurones TH+ isolés exprime spécifiquement VGLUT2. Cette expression est précoce au cours du développement in vitro et limitée aux projections axonales des neurones dopaminergiques. Toutefois, cette forte expression in vitro contraste avec la non-détection de ce transporteur dans les rats adultes in vivo. Nous avons décidé ensuite de regarder si l’expression de VGLUT2 pouvait être régulée pendant le développement cérébral de jeunes rats et sous des conditions traumatiques, par double hybridation in situ. Entre 14 et 16 jours embryonnaires, les marquages de VGLUT2 et de TH montraient une superposition significative qui n’était pas retrouvée à des stades ultérieurs. Dans le mésencéphale de jeunes rats postnataux, nous avons détecté l’ARNm de VGLUT2 dans environs 1-2% des neurones exprimant l’ARNm de TH dans la substance noire et l’aire tegmentaire ventrale (ATV). Pour explorer la régulation de l’expression de VGLUT2 dans des conditions traumatiques, nous avons utilisé la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) pour léser les neurones dopaminergiques dans les jeunes rats. Dix jours après la chirurgie, nous avons trouvé que 27% des neurones dopaminergiques survivants dans l’ATV exprimaient l’ARNm de VGLUT2 dans les rats 6-OHDA. Finalement, nous avons observé la colocalisation de la protéine VGLUT2 dans les terminaisons TH positives par microscopie électronique. Dans les rats normaux, la protéine VGLUT2 est retrouvée dans 28% des terminaisons axonales TH dans le noyau accumbens. Dans les rats lésés à la 6-OHDA, nous avons observé une diminution considérable des terminaisons TH positives, et une augmentation dans la proportion (37%) des terminaisons dopaminergiques présentant du VGLUT2. Nos résultats suggèrent que le phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques est régulé au cours du développement, peut être réactivé dans des états pathologiques, et que ces neurones peuvent libérer du glutamate dans conditions spécifiques. / Numerous studies have established that the majority of neurons release more than one chemical substance. It is well known that neurons can co-express and co-release neuropeptides in addition to their neurotransmitter, but evidence of co-release of two small and fast-acting neurotransmitters has been accumulated recently. Electrophysiological recordings have also shown that isolated serotonine and dopamine neurons can release glutamate as a co-transmitter when they are placed in culture. Furthermore, the presence of glutamate and glutaminase has been detected in serotonine, dopamine and noradrenaline neurons by immunolabelling in brain slices. Unfortunately, considering the metabolic role of glutamate, its immunodetection is not sufficient to assert the glutamatergic phenotype of a neuron. Recently, the discovery of three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3) has greatly facilitated the identification of glutamate neurons. These transporters are necessary for the glutamate release by neurons and constitute the first molecular markers of a glutamatergic phenotype. Interestingly, it was demonstrated that some noradrenaline neurons express VGLUT2 and that some serotonin neurons express VGLUT3. But no evidence for expression of any VGLUT subtypes was initially reported for dopamine neurons. The goal of our work was to identify which VGLUT subtype is expressed by mesencephalic dopamine neurons, and to determine if the glutamatergic phenotype of these neurons can be modulated under specific conditions. First, we used microcultures to isolate dopamine neurons and double immunocytochemistry to visualize VGLUT expression in tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons. We showed that the majority (80%) of isolated TH+ neurons express specifically VGLUT2. This expression occurred early during in vitro development and was limited to axonal projections of dopamine neurons. However, this strong expression in vitro contrasted with the lack of detection of this transporter in adult rats in vivo. We next decided to investigate if VGLUT2 expression could be regulated during brain development of young rats and under traumatic conditions, using double in situ hybridization. At embryonic days 14 to 16, VGLUT2 and TH labelling displayed significant overlap which was no longer found at later stages. In postnatal mesencephalon of young rats, we detected VGLUT2 mRNA in approximately 1-2% of neurons expressing TH mRNA in the substantia nigra and in ventral tegmental area (VTA). To explore the regulation of VGLUT2 expression under traumatic condition, we used 6-hydroxydopamine (6-OHDA) to damage dopamine neurons in young rats. Ten days post-surgery, we found that 27% of surviving dopamine neurons in the VTA expressed VGLUT2 mRNA in 6-OHDA animals. Finally, we observed the colocalisation of VGLUT2 protein in TH positive terminals by electron microscopy. In normal rats, VGLUT2 protein was found in 28% of TH positive axon terminals in nucleus accumbens. In 6 OHDA-lesioned rats, we observed a considerable reduction of TH positive terminals, and an increase in the proportion (37%) of dopamine terminals displaying VGLUT2. Our results suggest that the glutamatergic phenotype of dopamine neurons is developmentally regulated, can be reactivated under pathological states, and that these neurons are able to release glutamate under specific conditions.

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat. / Knowing that a subset of rat and mouse mesencephalic dopamine (DA) neurons expresses the mRNA of the vesicular glutamate transporter type 2 (VGLUT2), we used electron microscopic immunocytochemistry, after single or double labeling of the biosynthetic enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and of VGLUT2, to determine the presence of one and/or both proteins in axon terminals (varicosities) of these neurons and characterize their ultrastructural morphology under various experimental conditions. At first, young (P15) or adult (P90) rats, subjected or not to cerebro-ventricular administration of the cytotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a few days after birth, were examined in order to investigate the role of VGLUT2 in DA neurons during normal and pathological development of these neurons. In the young rats, these studies revealed: i) the presence of VGLUT2 in a significant fraction of TH immunoreactive varicosities in the core of the nucleus accumbens and the neostriatum; ii) an increase in the proportion of dually labeled terminals in the nucleus accumbens following neonatal 6-OHDA lesion; iii) frequent double labeling of TH varicosities belonging to the aberrant DA innervation (neoinnervation) which develops in the substantia nigra following neonatal 6-OHDA lesion. Significant differences were also noted in the size of the axon terminals labeled for TH only, VGLUT2 only, or TH and VGLUT2. Finally, at this age (P15), all the dually labeled terminals appeared equipped with a synaptic membrane specialization, unlike the terminals labeled for TH or for VGLUT2 only. In a second step, we sought to determine the fate of the dual phenotype in adult rats (P90) subjected or not to the neonatal 6-OHDA lesion. In contrast with the observations made in young rats, we found: i) a complete absence of dually labeled terminals in the core of the nucleus accumbens and striatum of intact animals, as well as in the remains of the substantia nigra after neonatal 6-OHDA lesion; ii) a sharp decline of their number in the core of the nucleus accumbens of 6-OHDA-lesioned animals. These findings, suggesting a regression of the dual TH/VGLUT2 phenotype with age, reinforced the hypothesis of a specific role of the co-release of glutamate from midbrain DA neurons during development. Under these conditions, it was of considerable interest to examine the DA meso-striatal innervation in two strains of mice whose Vglut2 gene has been selectively invalidated in DA neurons, as well as in their control littermates and wild-type mice. This issue was particularly relevant with the increasing use of genetically modified mice in neurobiology; indeed, this DA innervation had never been systematically characterized by electron microscopy. Because of possible differences between the core and shell of the nucleus accumbens, the study included both parts of this nucleux as well as the striatum of young (P15) and adult (P70-90) mice of each strain, prepared for TH immunocytochemistry, and also for double labeling of TH and VGLUT2, according to the protocol previously used in rats. The results were surprising. At both ages, regardless of the genotype, the TH immunoreactive axon terminals of the three regions appeared comparable in size, vesicle content, percent with mitochondria, and exceeding low frequency of synaptic membrane specialization (5% of varicosities, on average). Thus, in mice, the regression of the dual phenotype might be even more precocious than in rats, unless the two proteins are segregated very early in different axon terminals of the same DA neurons. These data also strenghten the hypothesis of a diffuse (volume) transmission and of an ambient level of DA as determinant elements in the functioning of the meso-striatal DA system in mice as well as rats.