Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Berlin.

Techn. Hochsch., Diss., 2003--Aachen.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Michèl Oude Ophuis. Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Sulfur deficiency stress induces a number of adaptive responses which must be coordinated. Phytohormone cytokinin has been previously shown to regulate sulfur aquisition and utilizati-on, however, the cytokinin-regulation of sulfur nutrition remains elusive. In this diploma the-sis, it was reported that cytokinin induces a sulfur-deficiency-like gene expression which is accompanied by a decrease in pool of the key sulfur-containing compound glutathione. Further, it was found that the sulfur deficiency responses involve altered cytokinin status to coordinate developmental and/or metabolic adaptations. Arabidopsis plants deficient in cytokinin signaling showed disrupted root elongation in response to sulfur starvation and, unexpectedly, the root elongation in response to sulfur starvation was further stimulated by a low cytokinin concentration. Further, the role of cytokinin in sulfur nutrition was indicated in cytokinin signaling-deficient plants which accumulated more glutathione under normal nu-tritive conditions in comparison to wild-type, and vice versa, the decrease of glutathione pool was exaggerated during sulfur starvation. Altogether, results of this diploma thesis suggest that cytokinins participate in nutritional sulfur homeostasis control.

La prééclampsie est une pathologie de la deuxième moitié de la grossesse d'étiologie encore méconnue et ne possédant aucun traitement efficace, mis à part l'accouchement provoqué. Il est reconnu que la cause première de cette pathologie provient du placenta, celui-ci relâchant des facteurs qui amènent une dysfonction des cellules endothéliales entraînant un stress oxydatif. Nous croyons que les glutathion peroxydases (GPx), qui sont une classe majeure d'enzymes antioxydantes contrôlant la peroxydation lipidique pourraient être impliquées dans le développement et le maintien de cette maladie. Dans cette étude, nous avons analysé l'expression des GPx dans les placentas de femmes normotendues et prééclamptiques. Nous avons découvert quatre formes de GPx dans le placenta humain et avons démontré que leurs expressions (ARNm) spatiales et tissulaires diffèrent. Nous avons aussi montré la localisation cellulaire de la protéine GPx-4 au niveau placentaire. Nous avons donc trouvé que les GPx sont différentiellement régulées dans le placenta suggérant un rôle complexe de celles-ci dans le contrôle de l'homéostasie placentaire.

La prééclampsie est une pathologie obstétricale complexe caractérisée par de l'hypertension et de la protéinurie. Un facteur de risque majeur serait une placentation inadéquate. Plusieurs évidences lient la progression et le maintien de cette maladie à un déséquilibre entre les agents prooxydants et antioxydants. Les enzymes antioxydantes, les glutathion peroxydases (GPx), pourraient jouer un rôle crucial dans cette pathologie. Cinq formes de GPx sont connues, mais aucune n'a été étudiée spécifiquement dans la circulation sanguine des femmes prééclamptiques. Dans cette étude, l'analyse de l'expression des GPx-l et -4 a été faite dans le sang des femmes prééclamptiques et de leur foetus en comparaison avec un groupe contrôle de grossesses. Les niveaux d'ARNm et de protéines des GPx-l et -4 sont plus élevés en prééclampsie et cela, spécifiquement dans les lymphocytes/monocytes sanguins maternels. Ce travail suggère que le groupe atteint de prééclampsie a des défenses antioxydantes accrues dans le but, probablement, de contrer le stress oxydatif caractérisant cette pathologie.

Les peroxyrédoxines (Prx) sont des peroxydases à thiol, ubiquitaires, qui jouent un rôle central dans la physiologie du peroxyde d’hydrogène. Une famille de Prx dite "2-Cys-Prx typique" possède une propriété unique de suroxydation de la Cys catalytique sous forme acide sulfinique, qui constitue un mécanisme de régulation des fonctions des 2-Cys-Prx typiques en tant que peroxydase, capteur de peroxyde ou protéine chaperon. La réduction des 2-Cys-Prx typiques suroxydées est catalysée par la Sulfirédoxine (Srx), une sulfinyl réductase ATP-dépendante dont la constante catalytique est de l’ordre de 1-2 min-1, une valeur faible qui doit être corrélée au rôle de Srx dans la régulation redox. L’objectif de ce travail était d’analyser l’enzymologie de la régulation du système Prx/Srx au niveau, du processus de suroxydation des 2-Cys-Prx typiques, de l’étape limitante de la Srx, et de son recyclage par les systèmes redox cellulaires. Dans un premier temps, nous avons caractérisé les deux étapes du cycle catalytique de la 2-Cys-Prx typique majeure de S. cerevisiae Tsa1, dont la compétition contrôle la sensibilité à la suroxydation, par une stratégie combinant cinétiques rapides, système enzymatique couplé et modélisation cinétique. Ces travaux suggèrent que cette compétition est contrôlée par une réorganisation conformationnelle au cours du cycle catalytique de la Tsa1. Dans un second temps, l’étude de la première étape du mécanisme catalytique de Srx, qui consiste en l’activation ATP-dépendante du groupement acide sulfinique de la 2 Cys-Prx a permis, i) de montrer que l’étape limitante de la réaction catalysée par Srx était associée au processus chimique de transfert de phosphate, et ii) de proposer un modèle d’assemblage du complexe Michaelien Prx/Srx/ATP formé lors de ce processus. Enfin, par une approche combinant cinétiques enzymatiques in vitro et génétique de la levure in vivo, nous avons établi que le mécanisme de recyclage des Srx à 1 Cys existant chez les plantes ou les mammifères implique le rôle du glutathion comme réducteur cellulaire, contrairement à la Srx de S. cerevisiae qui est recyclée par le système thiorédoxine. De façon inattendue, la spécificité du glutathion dans ce mécanisme est assurée par un événement de reconnaissance au sein du complexe Prx/Srx / The peroxiredoxins (Prx) are ubiquitous thiol peroxidases, which play a central role in the physiology of hydrogen peroxide. A subclass of Prx called "typical 2-Cys-Prx" has a unique property to hyperoxidize the catalytic Cys into the sulfinic acid form, which acts as a regulation mechanism of their functions, as peroxidase, peroxide sensor or protein chaperone. The reduction of the overoxidized form is catalyzed by sulfiredoxin (Srx), an ATP-dependent sulfinyl reductase whose catalytic constant is about 1-2 min-1, a low value that must be correlated to the role of Srx in redox regulation. The aim of this study was to analyze the enzymology of the regulation of the Prx/Srx system at three diffrents points of control: the hyper-oxidation process of typical 2-Cys-Prx, the rate-limiting step of the Srx mechanism and the recycling step of Srx by the cellular thiol redox systems. We have first characterized the competition mechanism between the two steps of the catalytic mechanism of the major typical 2-Cys-Prx of S. cerevisiae, Tsa1, through a strategy combining rapid kinetics, coupled enzyme system and kinetic modelling analysis. This work suggests that the sensitivity to hyper-oxidation is controlled by a conformational reorganization during the catalytic cycle of Tsa1. Next, the study of the first step of Srx catalytic mechanism, which involves the ATP-dependent activation of the sulfinic acid form of typical 2-Cys Prx i) has shown that the rate-limiting step is associated with the chemical phosphate transfer process, and ii) provided an assembly model of the Michaelien complex Prx/Srx/ATP, formed during this process. Finally, through the combination of in vitro enzyme kinetics and in vivo yeast genetic tools, we established that the recycling mechanism of one Cys Srx, existing in plants or mammals, involves the glutathione (GSH) as reducer in cells, contrary to the Srx from S. cerevisiae, which is recycled by the Thioredoxin system. Unexpectedly, our study suggests that GSH binds the thiolsulfinate complex, confirming the role of GSH as the primary reducing system of 1-Cys-Srx

Die Glutathionverhältnisse und -verschiebungen zwischen Gliazellen und Ganglienzellen vor und nach oxidativem Stress wurden erstmals im lebenden Zellverband, ex vivo, untersucht. Die Untersuchungen erfolgten an akut isoliertem Retinagewebe vom Meerschweinchen, von welchem Bilder am Laser scanning microscope (LSM) erstellt wurden. Über die Anwendung des in vivo-Fluoreszenzfarbstoffes CellTracker Green wurde dabei dessen Spezifität für Glutathion überprüft und bestätigt.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.