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Synthèse et études cinétiques de substrats analogues et d'inhibiteurs de l'étape d'acylation de la [gamma]-glutamyl transpeptidase

Lherbet, Christian January 2003 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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La nutrition parentérale modifie le statut et le potentiel redox du glutathion hépatique chez le modèle néonatal du cochon d'Inde

Gauthier, Cindy January 2004 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Caractérisation structurale et enzymatique, cibles potentielles et rôles physiologiques de glutathion transférases à cystéine catalytique de Phanerochaete chrysosporium / Structural and enzymatic characterization, physiological roles of Phanerochaete chrysosporium cysteine containing glutathione transferases

Meux, Edgar 07 December 2012 (has links)
Phanerochaete chrysosporium est un champignon modèle étudié en particulier pour ses capacités ligninolytiques et son aptitude à dégrader un grand nombre de polymères aromatiques toxiques dérivés notamment des hydrocarbures polycycliques. Durant ces processus de dégradation, une multitude de composés hautement réactifs et toxiques pour les cellules vont dans un premier temps être générés puis dégradés ou excrétés hors de la cellule. Le séquençage complet du génome de P. chrysosporium a permis d'identifier plusieurs superfamilles d'enzymes impliquées dans les mécanismes de tolérance à ces composés toxiques. Parmi elles, les glutathion transférases sont présentes au sein de tous les règnes du vivant et constituent une superfamille multigénique jouant un rôle dans la protection cellulaire, le métabolisme secondaire et la détoxication. Cependant, en dépit de nombreuses études réalisées en particulier chez les vertébrés, le rôle joué par ces enzymes dans la détoxication des dérivés aromatiques toxiques est encore inconnu chez les basidiomycètes. L'analyse comparative des séquences de GST présentes au sein des différents règnes du vivant révèle que les GST fongiques ont évolué différemment de leurs orthologues, notamment via l'extension de sous-classes très peu représentées chez les vertébrés. Parmi elles, les GST à cystéine catalytique représentent 30 % de cette superfamille d'enzymes chez P. chrysosporium. Trois isoformes fongiques ainsi qu'une protéine orthologue exprimée chez une bactérie lignivore ont été caractérisées in vitro tant au niveau biochimique que structural. Ces enzymes sont impliquées dans la déglutathionylation d'une grande variété de molécules électrophiles potentiellement toxiques et issues notamment de la dégradation de polymères aromatiques halogénés. La recherche de substrats a permis d'identifier plusieurs classes fonctionnelles, néanmoins l'activité des quatre isoformes s'effectue via l'attaque directe du conjugué glutathionylé par la cystéine catalytique, qui est dans un deuxième temps régénérée par un réducteur. L'analyse comparée prouve également l'existence d'une nouvelle classe structurale et fonctionnelle appelée glutathionyl hydroquinone réductase absente chez les vertébrés. Ces protéines présentent un mode de dimérisation original ainsi que la capacité tout à fait particulière de déglutathionyler les quinones. Ces résultats suggèrent que les champignons ont développé des mécanismes de résistance en réponse à des contraintes environnementales, notamment via l'évolution de familles multigéniques telles que les GST à cystéine catalytique qui sont impliquées dans le métabolisme et la tolérance vis-à-vis d'une grande variété de composés d'origine exogène ou endogène / Phanerochaete chrysosporium is a model fungus well studied for its lignolytic properties towards wood compounds and various toxic aromatic derivatives such as polycyclic aromatic hydrocarbons. These degradation processes lead first to the formation of highly reactive and toxic compounds, which are then catabolized or excreted outside the cell. Genomic data allowed the identification of genes coding for superfamilies of enzymes putatively involved in these tolerance mechanisms. Among them, glutathione transferases are present in all kingdoms and constitute a multigenic superfamily of enzymes involved in cell protection and detoxification. However, although numerous studies have been performed on vertebrate enzymes, the role of these enzymes in the detoxication of toxic aromatic compounds is still unknown in basidiomycetes. The comparative analysis of GST sequences from various kingdoms of life reveals that fungal GSTs have evolved differently from their orthologs, in particular through the expansion of sub-classes poorly represented in vertebrates. Among them, GSTs with a catalytic cysteine represent 30% of this superfamily of enzymes in P. chrysosporium. Three Cys containing fungal isoforms have been characterized at the biochemical and structural levels, including an orthologue from lignolytic bacteria. All these enzymes are involved in deglutathionylation processes using a wide range of aromatic halogenated electrophilic compounds, including potentially toxic derivatives arising from the degradation of halogenated aromatic polymers. This GSTs family can be organized in various functional groups based on their substrate specificities, but still the catalytic process remains the same with the direct attack of the glutathionylated compound by the catalytic cysteine which is then reduced and regenerated. The comparative analysis of three isoforms revealed a new structural and functional class called glutathionyl hydroquinone reductase absent in vertebrates. These proteins exhibit a new mode of dimerization as well as the ability to deglutathionylate quinones. These results suggest that fungi have developed resistance mechanisms in response to environmental stresses, notably through the evolution of multigenic families such as catalytic cysteine bearing GSTs which are likely involved in the metabolism and tolerance towards a wide range of exogenous or endogenous compounds
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Bioinformatische Identifikation von Domänenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria / Bioinformatic identification of domain differences in parasite and host using malaria as an example

Bertram, Helge January 2005 (has links) (PDF)
Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. / The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained.
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Analyse intégrative du rôle de l’excision de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs / Integrative analysis of the N-terminal methionine excision role in cytoplasm of higher eukaryotes

Frottin, Frédéric 29 April 2011 (has links)
Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME. / The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.
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Stratégie d'éradication de cellules cancéreuses chimiorésistantes surexprimant le transporteur de drogues MRP1 par des composés activateurs de son activité d’efflux de glutathion / Eradication of chemoresistant cancer cells overexpressing the drug transporter MRP1 using activators of GSH efflux through MRP1

Dury, Lauriane 05 November 2015 (has links)
Le transporteur de drogues membranaire MRP1 participe à la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie lorsqu’il est surexprimé. Cette surexpression peut être exploitée afin de provoquer l’apoptose sélective de ces cellules, MRP1 devenant leur talon d’Achille : c’est l’effet de sensibilité collatérale (SC). Ainsi, le vérapamil stimule l’efflux médié par MRP1 d’un tripeptide antioxydant indispensable aux cellules, le GSH ou glutathion réduit, et provoque la mort sélective des cellules surexprimant ce transporteur. La recherche d’autres agents de SC comme le vérapamil nous a menés à l’étude de composés flavonoïdiques pouvant induire un efflux rapide et massif de GSH. Parmi ces composés, nous avons identifié un puissant agent de SC des cellules résistantes surexprimant MRP1, le dimère de flavonoïde 4e, candidat très prometteur pour de futures études in vivo. Nous avons déterminé que la surexpression de MRP1 est effectivement responsable de la SC dans les cellules cancéreuses résistantes H69AR, et que l’efflux de GSH se doit d’être massif et prolongé pour induire l’apoptose des cellules. Nous avons montré que cet efflux perturbe l’homéostasie du glutathion et l’état redox des cellules, entraînant un stress oxydatif qui participe au déclenchement de la mort cellulaire. Enfin, nous nous sommes attachés à identifier d’éventuelles cibles secondaires des agents de SC dans les cellules surexprimant MRP1, via l’initiation de l’étude de leur transcriptome et métabolome. La compréhension du mécanisme d’action de ces agents de sensibilité collatérale vise, à terme, à l’éradication des cancers résistants surexprimant MRP1 / The membrane drug transporter MRP1 is involved in the resistance of cancer cells to chemotherapy, when overexpressed. This overexpression can be exploited in order to induce the selective apoptosis of these cells, so that MRP1 becomes their Achilles’ heel: this is called Collateral Sensitivity (CS). Thus verapamil stimulates the MRP1-mediated efflux of GSH (reduced form of glutathione) that is an antioxidant tripeptide essential for cells, and induces the selective death of MRP1- overexpressing cells. Seeking for other CS agents than verapamil led to the study of flavonoid compounds able to induce a massive and rapid efflux of GSH and to the identification of a powerful CS agent of resistant cells overexpressing MRP1, i.e. flavonoid dimer 4e, which is a very promising candidate for in vivo studies. We determined that overexpression of MRP1 is indeed responsible for CS in H69AR resistant cancer cells, and that GSH efflux must be massive and protracted in order to induce cell apoptosis. We showed that this efflux disturbs glutathione homeostasis and cell redox state, which leads to an oxidative stress that is involved in triggering cell death. At last, we sought to identify possible secondary targets of CS agents in MRP1-overexpressing cells, via the initiation of transcriptomic and metabolomic studies. Understanding the mechanism of action of these Collateral Sensitivity agents aims to the eradication of resistant cancers that overexpress MRP1
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Etude de l’anthocyanidine synthase de Vitis vinifera : substrats polyphénoliques et mécanismes réactionnels / Study of anthocyanidin synthase from Vitis vinifera : polyphenolic substrates and reactional mechanisms

Zhang, Jiarong 15 December 2017 (has links)
L’ANS recombinante de Vitis vinifera (VvANS) a été exprimée chez E. coli, et purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne Nickel. La production et purification de l'holoenzyme chargée en fer a été mise en point, afin d’éviter les réactions d'oxydation non-enzymatique incontrôlée en présence de sel de Fe(II). Un complexe VvANS-Fe(II) stable est formé en présence d'α- cétoglutarate et d'ascorbate, complexe qui est catalytiquement actif à PO2 ambiante en l'absence de sel de Fe(II). La transformation de la (+)-catéchine par VvANS a été étudiée avec ou sans ascorbate, en utilisant le complexe VvANSFe( II) ou l’holoenzyme co-incubée en présence de sulfate ferreux, afin d’étudier le rôle de l’ascorbate. Aucune activité enzymatique n’a été observée en l'absence d’ascorbate, ce qui indique qu'il s'agit d'un cofacteur indispensable de VvANS. Un adduit covalent ascorbate-cyanidine est produit in vitro, mais seulement en l'absence d'un autre réducteur nucléophile majeur, le glutathion GSH. Les deux stéréoisomères de la leucocyanidine (flavan-diols 3,4-cis et 3,4-trans), substrats potentiels de VvANS, mais non commerciaux, ont été synthétisés par réduction de la dihydroquercétine par NaBH4, puis identifiés par RMN du proton. L'analyse des deux stéréoisomères par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) montre que leurs voies de fragmentation MS/MS sont distinctes et peuvent être utilisées pour les distinguer lors de leur production. Les deux stéréoisomères sont stables en milieu aqueux congelé à -20°C. Douze flavonoïdes de quatre familles distinctes (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) ont été testés comme substrats potentiels. Tous les produits enzymatiques ont été purifiés par HPLC en phase inverse, puis identifiés par MS/MS, avec les résultats suivants: 1) Seuls les dihydroflavonols de configuration (2R,3R) sont acceptés comme substrats par VvANS dont l'activité diminue avec le nombre de groupements hydroxyles du cycle B. 2) Seuls les flavan-3-ols ou flavan-3,4-diols de configuration (2R,3S) ayant un catéchol ou trois OH phénoliques vicinaux sur le cycle B sont acceptés comme substrats. 3) La naringénine n'est pas substrat de VvANS, sans doute en raison de l'absence de groupement hydroxyle en C3. […] Le glutathion GSH est un puissant nucléophile, réducteur et piégeur de radicaux libres, qui est abondant dans la baie de raisin. Nous avons donc étudié son effet sur l'activité de VvANS avec tous les substrats identifiés. GSH n’a pas d'effet sur la transformation des dihydroflavonols et des flavan-3,4-diols, mais il modifie considérablement le mode de transformation de la (+)-catéchine et de la (+)-gallocatéchine. En présence de (+)-catéchine et de GSH, on observe deux produits majeurs, la cyanidine et un adduit thioéther cyanidine-glutathion, et le rendement de production est beaucoup plus élevé qu'en l'absence de GSH. De plus, l’adduit covalent ascorbate-cyanidine et le dimère issu de la (+)-catéchine obtenus lors de la réaction réalisée en l'absence de GSH ont disparu. Nos données suggèrent que l'adduit covalent cyanidine-glutathion est un thioéther en C4 qui fait l'objet d'un équilibre de tautomérisation céto-énolique en C3, et se décompose en cyanidine et GSH. En présence de (+)-gallocatéchine, un adduit thioéther similaire delphinidine-glutathion est aussi observé. Pour tester l'éventuelle spécificité de GSH, trois autres mercaptans (thiomalate, cystéine et cystéamine) ont été testés et aucun adduit similaire n’a été observé, ce qui suggère que GSH est un ligand spécifique, et pourrait être un coenzyme de VvANS. Nos résultats suggèrent que les anthocyanidines pourraient être produites in vivo à partir d'un substrat flavan-3-ol (catéchine ou gallocatéchine) via un intermédiaire thioéther de glutathion, alors que le stéréoisomère naturel (3,4-cis) de la leucocyanidine n'est pas transformé en cyanidine. / Recombinant anthocyanidin synthase from Vitis vinifera (VvANS) has been expressed in E. coli, and purified by nickel affinity chromatography. The production and purification of the iron-loaded enzyme has been developed in order to avoid uncontrolled nonenzymatic oxidation reactions in the presence of Fe(II) salt. A stable VvANS-Fe(II) complex is formed in the presence of 2-oxoglutarate and ascorbate, and this complex is catalytically active at ambient PO2 in the absence of Fe(II) salt. The transformation of (+)-catechin by VvANS has been studied with and without ascorbate, by using either the VvANSFe( II) complex or the holoenzyme co-incubated with ferrous sulfate, to investigate the role of ascorbate. No enzyme activity has been observed in the absence of ascorbate, which means that it is an essential enzyme cofactor. A covalent adduct ascorbate-cyanidin is produced in vitro, but only in the absence of glutathione (GSH), another major nucleophilic and reducing agent. The two stereoisomers of leucocyanidin (3,4-cis et 3,4-trans flavan-diols) which were expected to behave as substrates of VvANS, are not commercial and were synthesized by reduction of dihydroquercetin by NaBH4, and characterized by proton NMR. The analysis of the two stereoisomers by means of tandem mass spectrometry (MS/MS) shows that their fragmentation pathways are distinct and may be used to distinguish them during their production. The two stereoisomers are stable in frozen aqueous medium at -20°C. Twelve flavonoids of four distinct families (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) were tested as potential substrates of VvANS. All enzymatic products were purified by means of reverse-phase HPLC and characterized by MS/MS, with the following results: 1) Only dihydroflavonols of (2R,3R) configuration are accepted as substrates by VvANS, the activity decreasing with the number of hydroxyl groups of ring B. 2) Only flavan-3-ols or flavan-3,4-diols of (2R,3S) configuration having either a catechol or three vicinal phenolic OH on ring B are accepted as substrates. 3) Naringenin is not substrate of VvANS, most likely because a C3 hydroxyl group is missing. […] Glutathione GSH is a powerful nucleophilic and reducing agent as well as a free radical scavenger, which is abundant in grape berries. We therefore studied its effect on VvANS activity with all identified substrates. GSH has no effect on the transformation of dihydroflavonols and flavan-3,4-diols, but it considerably modifies the transformation pattern of (+)- catechin and (+)-gallocatechin. In the presence of (+)-catechin and GSH, we observe two major products, cyanidin and a cyanidin-glutathione thioether, with production yields which are much higher than in the absence of GSH. Moreover, the ascorbate-cyanidin covalent adduct and the (+)-catechin dimer that had been obtained in the absence of GSH have disappeared. Our data suggest that the cyanidin-glutathione adduct is a C4-thioether which is in equilibrium between the two keto-enolic tautomeric forms at C3, and decomposes into cyanidin and GSH. In the presence of (+)-gallocatechin, a similar delphinidin-glutathione thioether adduct is also observed. In order to test the possible specificity of GSH as a cofactor, three other mercaptans (thiomalate, cysteine and cysteamine) were tested, and no similar product was observed, which suggests that GSH is a specific ligand, and might be a coenzyme of VvANS. Our results suggest that anthocyanidins could be produced in vivo from a flavan-3-ol substrate (catechin or gallocatechin) via a glutathione thioether intermediate, whereas the natural 3,4-cis stereoisomer of leucocyanidin is not transformed into cyanidin by VvANS.
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Etude de suppresseurs de la glutarédoxine GRXS17 dans la croissance racinaire et la thermotolérance / Glutathione and glutaredoxins, major regulators of root system architecture

Trujillo Hernández, José Abraham 18 June 2019 (has links)
Les auxines sont des composants clés essentiels pour le contrôle du développement des racines et la réponse aux contraintes environnementales en raison de leur rôle central dans la division, l’élongation et la différenciation cellulaires. L’auxine endogène, acide indole-3-butyrique (IBA), bien que moins abondante et moins connue que l'acide indole-3-acétique (IAA), joue un rôle important dans le développement racinaire, en particulier lors de la formation des racines latérales et de l'élongation des poils absorbants. Il est généralement admis que les fonctions de l’IBA dépendent entièrement de la conversion peroxysomale de l’IBA en IAA. Bien que nos connaissances concernant les enzymes impliquées dans cette conversion soient très avancées, nous en savons peu sur les mode de régulation de ces fonctions. Au cours de ma thèse, j'ai démontré que les fonctions de l’IBA lors de l'induction des racines latérales et de l'élongation des poils absorbants dépendent du glutathion, un petit tripeptide rédox qui constitue l'une des molécules les plus importantes impliquées dans les réponses des plantes au stress oxydatif. De plus, j'ai démontré que le lien entre le glutathion et l'auxine IBA est essentiel pour les réponses à l’auxine dans la zone de transition de la racine primaire. Ce contrôle des fonctions de l’IBA par le glutathion pourrait être déterminant dans des conditions de stress abiotiques telles que la carence en phosphore.Une des fonctions du glutathion étant de réduire des réductases de fonctions thiols, les glutaredoxines (GRX), nous avons recherché si certaines GRX sont impliquées dans le développement racinaire. Nous avons constaté que ROXY19 et GRXS17 sont essentiels à la croissance des racines primaires et que ces deux GRX sont également impliqués, mais dans des rôles différents, lors du développement des racines latérales. Un crible suppresseur des phénotypes racinaires du mutant grxs17 avait été mis en place dans le laboratoire. J'ai utilisé des approches bio-informatiques pour isoler les mutations causales après reséquençage du génome de candidats capables de restaurer la croissance des racines primaires et / ou le développement normal des primordia des racines latérales. Malheureusement, cette approche ne nous a pas encore permis d’isoler de nouveaux acteurs. Cependant, elle jette les bases d’un futur grand progrès dans la compréhension de la manière dont GRXS17 contrôle le système racinaire.En conclusion, les résultats de ma thèse soulignent l’importance du glutathion et des glutarédoxines dans le contrôle de la plasticité du système racinaire et lors de conditions de stress abiotiques, notamment via la modulation de la voie auxinique IBA. / Auxins are critical key components for the control of root development and response to environmental constraints by its pivotal roles in cell division, elongation, and cell differentiation. The endogenous auxin Indole-3-butyric acid (IBA), although less abundant than the better-known Indole-3-Acetic Acid (IAA), plays important roles during root development especially during the formation of lateral roots and root hairs elongation. It is generally accepted that IBA functions are fully dependent on peroxisomal IBA-to-IAA conversion. While there is a great advance in our knowledge regarding the enzymes involved in the peroxisomal conversion of IBA-to-IAA, little is known about the mechanisms that modulate its functions. During my thesis, I demonstrated that the IBA functions during the induction of lateral roots and root hairs elongation are dependent on glutathione, which is a small redox tripeptide that constitutes one of the most important molecules involved in plant responses to oxidative stresses. Moreover, I demonstrated that the link between glutathione and the auxin IBA is critical for the auxin distribution that takes place in the transition zone of the primary root. The relevance of the control of IBA functions by glutathione might be determinant during abiotic stress conditions such as phosphorus deprivation.Since glutathione is a reducer of thiol reductases glutaredoxins (GRXs), we investigate if some GRXs are involved in root development. We found that ROXY19 and GRXS17 are critical for the primary root growth, and both GRX proteins play different roles during the formation of lateral roots. Based on this root phenotype, a suppressor screen in grxs17 background had been set up in the lab. I developed bioinformatic pipelines to isolate causal mutations from genome resequencing of candidates that are able to restore the primary root growth and/or the normal development of lateral roots primordia. Unfortunately, this approach did not yet allow us to isolate new actors, however it builds foundations for future big advance in understanding how glutaredoxins control the root system.In conclusion, the results showed in my Ph.D. thesis highlight the importance of glutathione and glutaredoxins in the control of the root system plasticity and during abiotic stress conditions, particularly via the modulation of the auxinic IBA pathway.
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Réponses du peuplier soumis à une combinaison de contraintes, ozone et sécheresse : dynamique de la conductance stomatique et des capacités antioxydantes foliaires / Responses of poplar submitted to combined stresses, ozone and drought : dynamics of stomatal conductance and foliar antioxidant capacities

Dusart, Nicolas 23 July 2019 (has links)
Les modèles climatiques indiquent qu’il est très probable que les végétaux soient de plus en plus exposés à deux facteurs de stress environnementaux : l’ozone troposphérique (O3) et le déficit hydrique du sol, tous deux pouvant provoquer un stress oxydant pour le végétal. Dans des conditions naturelles, ces deux facteurs peuvent être concomitants ou se succéder. L’impact de l’O3 et de la sécheresse nécessite donc une attention particulière. Afin de déterminer les réponses de défense mises en place par les arbres, deux génotypes de Populus nigra x deltoides (Carpaccio et Robusta) ont été exposés aux contraintes séparées ou à leur combinaison en conditions contrôlées dans des chambres de culture. Pour explorer les effets des stress et l’interaction entre les deux contraintes, nous avons ciblé les deux premiers niveaux de défense des plantes que sont le contrôle de l’ouverture/fermeture des stomates et les processus de détoxication cellulaire. Nos résultats montrent que Carpaccio et Robusta sont tous deux relativement tolérants à une sécheresse modérée grâce à un contrôle efficient des stomates. Face à l’O3, cependant, les deux génotypes adoptent des stratégies de réponse différentes : un évitement important pour Carpaccio et une maximisation de l’assimilation au détriment des feuilles pour Robusta. Cela se traduit par une différence de fermeture des stomates. Les deux génotypes ne font alors pas face au même flux d’O3 entrant dans les feuilles, ce qui impacte la détoxication cellulaire, dans laquelle le glutathion semble jouer un rôle majeur. En lien avec les modifications de capacité antioxydante, l’activité des enzymes du cycle ascorbate-glutathion (MDHAR, DHAR et GR) et/ou l’expression des gènes codant pour ces protéines sont modifiées. En combinaison de stress, le déficit hydrique protège le végétal du stress oxydant induit par l’O3 en amplifiant la fermeture des stomates. En revanche, la croissance de l’arbre est impactée par l’effet additif des deux contraintes. De plus, l’induction de voies de régulation hormonales différentes par les deux contraintes pourrait modifier le « cross-talk » complexe régulant la réponse au stress combiné. Enfin, dans le cas d’une succession de stress, l’exposition à l’O3 avant un épisode de sécheresse impacte faiblement la réponse de l’arbre. Cependant, un ralentissement de la fermeture des stomates induit par l’O3 est observé malgré l’arrêt de la fumigation. Il est donc nécessaire de prendre en compte le ralentissement et la fermeture des stomates induit par l’O3 et le déficit hydrique dans les modèles de conductance stomatique utilisés pour calculer l’indicateur du flux d’O3 entrant, le PODy (Phytotoxic Ozone Dose above a threshold of y nmol O3 m-2.s-1). / Climate models indicate that it is very likely that plants will be more and more exposed to two environmental stressors: ground-level ozone (O3) and soil water deficit, both causing oxidative stress to the plant. Under natural conditions, these two factors can be concomitant or successive. Therefore, the impact of O3 and drought requires special attention. In order to determine the defensive responses adopted by trees, two genotypes of Populus nigra x deltoides (Carpaccio and Robusta) were exposed to separate or combined stresses under controlled conditions in growing chambers. To explore the effects of stresses and their interaction, we targeted the plant’s first two levels of defence: i) the control of stomatal opening and closing, ii) the cellular detoxification processes. Our results show that both Carpaccio and Robusta are relatively tolerant to moderate drought thanks to an efficient stomatal control. However, different response strategies were adopted by the two genotypes to cope with O3. For Carpaccio, the strategy is avoidance, and for Robusta, the strategy is maximization of net CO2 assimilation at the expense of leaves. This results in a difference in the stomatal closure. The two genotypes do not face the same flow of O3 entering the leaves. This impacts cellular detoxification in which glutathione seems to play a major role. Also, the activity of ascorbate-glutathione cycle enzymes (MDHAR, DHAR and GR) and/or the expression of genes encoding these proteins are modified. Under combined stresses, the water deficit protects the plant from the O3-induced oxidative stress by amplifying the stomatal closure. Nevertheless, the tree growth is impacted by the additive effect of the two stresses. Furthermore, the induction of different hormonal regulatory pathways by the two stressors could modify the complex "cross-talk" regulating the response to combined stress. Finally, in the case of a succession of stresses, exposure to O3 prior to a drought episode has a weak impact on the tree's response. However, O3 induced a stomatal sluggishness in closure despite the cessation of fumigation. It is therefore necessary to take into account stomatal closure and sluggishness induced by O3 and water deficit in the stomatal conductance models used to calculate the indicator of O3 flux inside the leaves, PODy (Phytotoxic Ozone Dose above a threshold of y nmol O3 m-2.s-1).
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Approches globales de l'état redox du résidu cystéine

Le Moan, Natacha 26 September 2007 (has links) (PDF)
Le métabolisme de l'oxygène conduit à la formation d'espèces chimiques oxydantes, capables de provoquer l'oxydation de nombreux composants cellulaires, dont les résidus cystéines des protéines. L'oxydation du résidu cystéine est contrôlée par un système de réduction composé de deux branches distinctes, appelées la voie des thioredoxines et la voie du glutathion. Ces deux voies utilisent la chimie redox du soufre de la cystéine pour réduire les cystéines oxydées, avec des électrons fournis par le NADPH. Notre travail a consisté à étudier l'état d'oxydation des résidus cystéines de la cellule et la contribution respective des mécanismes opérant le contrôle de l'état redox des thiols. Pour cela, nous avons exploité les approches génétiques chez S.cerevisiae, et les avons couplés à une approche protéomique d'identification des thiols oxydés.<br />Ce travail nous a permis d'identifier de nombreuses protéines cytoplasmiques portant un ou plusieurs résidus cystéine oxydés et d'établir une différence frappante entre les voies des thioredoxines et du glutathion dans le contrôle de l'état redox des thiols intracellulaires. Au cours de notre travail, nous nous sommes également intéressés à la superoxyde dismutase, une protéine cytoplasmique, que nous avons identifié comme oxydée constitutivement. Nous avons étudié le mécanisme d'oxydation de Sod1, et avons observé que celui-ci semble se dérouler dans l'espace intermembranaire mitochondrial et fait intervenir une oxydase spécifique des thiols

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