La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 et BCRP/ABCG2. La surexpression des ces transporteurs peut également être le "talon d'Achille" des cellules cancéreuses résistantes en les sensibilisant à certains composés. Ce phénomène, appelé sensibilité collatérale, pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique conter les les cancers intrinséquement ou rendus résistants en éliminant sélectivement les cellules cancéreuse résistances. Ainsi, le S-vérapamil provoque la mort sélective par apoptose des cellules surexprimant suite à l'extrusion rapide et massive du glutathion 5GSH) intracellulaire par MRP1. Nous avons démontré que le vérapamil est capable de dépléter s"lectivement de leur contenu en GSH les tumeurs de cancer du poumon H69AR, MRP1 positives et résistantes, dès 3 heures d'exposition aiguë. Le vérapamil étant fortemnt carditoxique, nous avons développé de nouveaux agents de sensibilité collatérale, plus sélectif que le vérapamil, comme le xanthone 9, le flavonoïde 36 et le dimère de flavonoïde 4e. Enfin, grâce à l'étude de chimères MRP1/MRP2, nous avons démontré que la région comprenant les boucles L0 et L1-TM12 pourrait constituter les sites modualteurs et substrat du GSH sur MRP1. / Resistance to chemotherapy is partly due to efflux pumps expressed in the plasma membrane, which prevent the accumulation of anticancer drugs in tumor cells. Three human ABC transporters are particulary involved in this chemoresistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 and BCRP/ABCG2. The overexpression of these trnasporters can also be an "Achille heel" for resistant cancer cells by sensitizing them to various drugs. This phenomenom, called collateral sensitivity, could constitute a new chemotherapy to eradicate cancers becoming resistant or cancer which ara resistant prioir to any treatment. Thus, S-verapamil triggers selective apoptosis of MRP1 overexpressing correlated to the massive and rapide extrusion of cellular glutathione by MRP1. We showed that verapamil is able to selectivity deprive H69AR MRP1 positive and resistant lung tumors, as soon as 3 hours of acute exposure. Verapamil being highly cardiotoxic, we have developed new collateral sensitivity drugs, more selective than verapamil, such as xanthone 9, flavonoïdd 36 and flavonoïd dimer 4e. Finally, thanks to the characterization of MRP1/MRP2 chimera, we showed that the MRP1 region including the intracellular loop L0 L1-TM12 might constitute the substrate and the modulator binding sites for GSH.

Le transporteur de drogues membranaire MRP1 participe à la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie lorsqu’il est surexprimé. Cette surexpression peut être exploitée afin de provoquer l’apoptose sélective de ces cellules, MRP1 devenant leur talon d’Achille : c’est l’effet de sensibilité collatérale (SC). Ainsi, le vérapamil stimule l’efflux médié par MRP1 d’un tripeptide antioxydant indispensable aux cellules, le GSH ou glutathion réduit, et provoque la mort sélective des cellules surexprimant ce transporteur. La recherche d’autres agents de SC comme le vérapamil nous a menés à l’étude de composés flavonoïdiques pouvant induire un efflux rapide et massif de GSH. Parmi ces composés, nous avons identifié un puissant agent de SC des cellules résistantes surexprimant MRP1, le dimère de flavonoïde 4e, candidat très prometteur pour de futures études in vivo. Nous avons déterminé que la surexpression de MRP1 est effectivement responsable de la SC dans les cellules cancéreuses résistantes H69AR, et que l’efflux de GSH se doit d’être massif et prolongé pour induire l’apoptose des cellules. Nous avons montré que cet efflux perturbe l’homéostasie du glutathion et l’état redox des cellules, entraînant un stress oxydatif qui participe au déclenchement de la mort cellulaire. Enfin, nous nous sommes attachés à identifier d’éventuelles cibles secondaires des agents de SC dans les cellules surexprimant MRP1, via l’initiation de l’étude de leur transcriptome et métabolome. La compréhension du mécanisme d’action de ces agents de sensibilité collatérale vise, à terme, à l’éradication des cancers résistants surexprimant MRP1 / The membrane drug transporter MRP1 is involved in the resistance of cancer cells to chemotherapy, when overexpressed. This overexpression can be exploited in order to induce the selective apoptosis of these cells, so that MRP1 becomes their Achilles’ heel: this is called Collateral Sensitivity (CS). Thus verapamil stimulates the MRP1-mediated efflux of GSH (reduced form of glutathione) that is an antioxidant tripeptide essential for cells, and induces the selective death of MRP1- overexpressing cells. Seeking for other CS agents than verapamil led to the study of flavonoid compounds able to induce a massive and rapid efflux of GSH and to the identification of a powerful CS agent of resistant cells overexpressing MRP1, i.e. flavonoid dimer 4e, which is a very promising candidate for in vivo studies. We determined that overexpression of MRP1 is indeed responsible for CS in H69AR resistant cancer cells, and that GSH efflux must be massive and protracted in order to induce cell apoptosis. We showed that this efflux disturbs glutathione homeostasis and cell redox state, which leads to an oxidative stress that is involved in triggering cell death. At last, we sought to identify possible secondary targets of CS agents in MRP1-overexpressing cells, via the initiation of transcriptomic and metabolomic studies. Understanding the mechanism of action of these Collateral Sensitivity agents aims to the eradication of resistant cancers that overexpress MRP1

La coopération fonctionnelle entre le cytochrome P450 3A (CYP3A) et la P-glycoprotéine (P-gp) décrite dans la littérature est un facteur déterminant contribuant à la variabilité de la biodisponibilité de la plupart des médicaments administrés per os. Le CYP3A et la P-gp sont des protéines membranaires dont les localisations respectives communément attribuées sont la membrane du réticulum endoplasmique pour le CYP3A et la membrane plasmique pour la P-gp. Le but de notre étude était une description intégrée au niveau cellulaire du fonctionnement de ces protéines membranaires de détoxication des médicaments et de leurs métabolites, grâce à la détermination de la localisation cellulaire de ces protéines par immunomarquage et par suivi fonctionnel de composés fluorescents, à l'aide de techniques de microscopie à épifluorescence. Le matériel utilisé comprenait des coupes de foie de rat et humain, des hépatocytes en culture primaire ou des lignées cellulaires de fibroblastes de Hamster chinois D/ADX surexprimant la P-gp. Nous avons ainsi démontré que le CYP3A se localise exclusivement au niveau du réticulum endoplasmique, alors que la P-gp est retrouvée au pôle apical des hépatocytes, au niveau des canalicules biliaires et sur la membrane plasmique des fibroblastes. Une colocalisation membranaire des composés et enzymes, synonyme d'une grande efficacité de détoxication, n'a pas été mise en évidence dans les hépatocytes, à cause de difficultés techniques et d'une trop faible fluorescence des substrats utilisés.

La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 et BCRP/ABCG2. La surexpression des ces transporteurs peut également être le "talon d'Achille" des cellules cancéreuses résistantes en les sensibilisant à certains composés. Ce phénomène, appelé sensibilité collatérale, pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique conter les les cancers intrinséquement ou rendus résistants en éliminant sélectivement les cellules cancéreuse résistances. Ainsi, le S-vérapamil provoque la mort sélective par apoptose des cellules surexprimant suite à l'extrusion rapide et massive du glutathion 5GSH) intracellulaire par MRP1. Nous avons démontré que le vérapamil est capable de dépléter s"lectivement de leur contenu en GSH les tumeurs de cancer du poumon H69AR, MRP1 positives et résistantes, dès 3 heures d'exposition aiguë. Le vérapamil étant fortemnt carditoxique, nous avons développé de nouveaux agents de sensibilité collatérale, plus sélectif que le vérapamil, comme le xanthone 9, le flavonoïde 36 et le dimère de flavonoïde 4e. Enfin, grâce à l'étude de chimères MRP1/MRP2, nous avons démontré que la région comprenant les boucles L0 et L1-TM12 pourrait constituter les sites modualteurs et substrat du GSH sur MRP1.

L'acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l'expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l'efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH.<br />Dans un premier temps, ce travail a porté sur l'étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L'étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats.<br />La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l'activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l'isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie.<br />Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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