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L'objectif de cette thèse était de développer de nouveaux « donneurs de NO » stables en liant du S-nitrosoglutathion (GSNO) à une structure polymérique. Dans une première étape, les polymères ont été liés au glutathion (GSH) : le chitosan-GSH et l'alginate-GSH ont ainsi été préparés par la « méthode des carbodiimides » et dans une deuxième étape, les polymères finaux [SNOC (S-nitrosoglutathione-oligosaccharide-chitosan) et SNA (S-nitrosoglutathione-alginate)] ont été préparés par nitrosation des deux conjugués précédent. La quantité de NO fixée a été déterminée par les méthodes Griess et Saville. L’aptitude des polymères à libérer du NO et à passer la barrière intestinale [SNOC et SNA] a été évaluée dans une chambre d’Ussing. Nous avons obtenu des polymères avec des quantités variables de NO en fonction de la méthode utilisée (159 µmol de NO/g à 525 µmol de NO/g pour le SNOC ; 174 µmol de NO/g à 468 µmol de NO/g pour le SNA). Le SNOC était stable pendant au moins 6h et le SNA pendant au moins 10h. Enfin, nous avons essayé de mettre au point des microparticules de GSH et GSNO par spray drying avec de l’Eudragit ® FS 30D gastro-résistant. La caractérisation des microparticules a été réalisée par microscopie électronique à balayage (SEM), par diffraction X (PXRD) et par spectroscopie infrarouge (FTIR). Les essais de libération in vitro ont été réalisés dans un tampon (pH 1,2, 3, 6, 6,8 et 7,4). Les microparticules étaient chargées négativement avec une taille moyenne allant de 5 à 7 µm. La formulation était stable à pH acide mais a montré une libération rapide à pH basique ; elle pourrait donc servir de système de délivrance du NO au niveau intestinal. / The aim of the thesis was to develop novel and stable NO-donors by linking S-nitrosoglutathione (GSNO) to a polymer backbone. In the first step, chitosan-GSH and alginate-GSH conjugates were prepared by a carbodiimide reaction and in the second step SNOC (S-nitrosoglutathione-oligosaccharide-chitosan) and SNA (S-nitrosoglutathione-alginate) were prepared by the nitrosation of both conjugates respectively. The amount of NO was determined by Griess and Saville methods. Stability and ex vivo experiments of SNOC and SNA were performed in an Ussing chamber through rat intestine. We obtained polymers with different amount of NO (i.e. 159 µmol of NO/g to 525 µmol of NO/g for SNOC; 174 µmol of NO/g to 468 µmol of NO/g for SNA) depending upon the procedure of nitrosation. SNOC was stable for at least 6h and SNA for at least 10h. Also, we aimed to develop spray dried microparticles of GSH and GSNO based on Eudragit® FS 30D polymer. The microparticles were characterized by scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (PXRD), infrared spectroscopy (FTIR) and in vitro release studies were performed in different pH conditions (pH 1.2, 3, 6, 6.8 and 7.4). The microparticles were negatively charged with mean particle size ranging from 5 to 7 µm. The formulation was stable and was resistant to acidic pH but showed rapid release in basic pH; hence, they can be used as colon specific drug delivery systems for the treatment of Crohn’s disease. We think that these formulations could be used in animal models in the treatment of Crohn’s disease.

La biologie des réactions redox est particulièrement difficile à étudier de par la compartimentation spatiale mais aussi cinétique des différents systèmes redox cellulaires. Les biosenseurs codés génétiquement, incluant la «redox-sensitive Yellow Fluorescent Protein» (rxYFP) sont une manière de contourner les limitations des méthodes conventionnelles de mesure du couple glutathion/glutathion disulfure (GSH/GSSG). Cette étude présente l’utilisation des biosenseurs rxYFP pour analyser les états redox dans des différents compartiments cellulaires, et leur dynamique en réponse au stress dans les cellules humaines. La rxYFP exprimée soit dans le cytosol, le noyau ou la matrice mitochondriale de cellules HeLa s’est révélée sensible aux changements de l’état redox intracellulaire provoqué par des traitements aussi bien réducteurs qu’oxydants. La rxYFP est capable de détecter des différences de l’état redox, entre les compartiments, mais aussi entre différentes lignées cellulaires. Les senseurs exprimés dans des kératinocytes humain de l’épiderme HEK001 ont réagi au stress induit par les UVA, de façon dose-dépendante, mais pas au stress induit par les UVB. De plus, ces senseurs ont pu détecter les changements redox induits par des faibles doses (30 µM) ainsi que par des doses modérées (100 µM) de peroxyde d’hydrogène (H2O2), de façon dynamique et spécifique des compartiments cellulaires. La rxYFP exprimé dans la matrice mitochondriale a montré une vitesse d’oxydation plus élevée que les senseurs rxYFP exprimés dans le cytosol ou le noyau, ce qui est attribuable à un pH local plus basique. De plus, la déplétion en GSH provoquée par un traitement au buthionine sulphoximine (BSO) a affecté spécifiquement le potentiel redox mitochondrial mais pas cytosolique ni nucléaire. Ces observations soutiennent l’idée que l’état redox du GSH mitochondrial est maintenu et régulé de façon indépendante par rapport à celui du cytosol ou du noyau. Nous avons également montré que dans les cellules humaines, les sondes rxYFP réagissent de façon prédominante avec le GSH/GSSG, puisque la déplétion en GSH ralentit la vitesse d’oxydation de la rxYFP en réponse à un traitement par H2O2. De plus, grâce à l’utilisation des sondes rxYFP et à l’analyse de l’état redox des antioxydants cellulaires, nous démontrons que l’oxydation des thiols se produit après l’activation des caspases au cours de l’apoptose induite par TRAIL. L’ensemble de nos données montrent la robustesse des senseurs rxYFP pour la mesure des changements d’état redox dans les cellules humaines. En complément d’autres senseurs redox ainsi que des méthodes conventionnelles de mesure des états redox, les senseurs rxYFP ciblés aux différents compartiments cellulaires sont un nouvel outil pour étudier l’homéostasie redox dans les cellules de mammifères, et permettent l’étude de l’état redox du glutathion et de la dynamique des changements redox avec une grande précision. / The kinetic and spatial separation of redox systems renders redox biology studies a particularly challenging field. Genetically encoded biosensors including the glutathione-specific redox-sensitive yellow fluorescent protein (rxYFP) may provide an alternative way to overcome the limitations of conventional glutathione/glutathione disulfide (GSH/GSSG) redox measurements. This study describes the use of rxYFP sensors for investigating compartment-specific steady redox states and their dynamics in response to stress in human cells. RxYFP expressed either in the cytosol, nucleus or mitochondrial matrix of HeLa cells was responsive to the intracellular redox state changes induced by reducing as well as oxidizing agents. Compartment-targeted rxYFP sensors were able to detect different steady state redox conditions between the cytosol, nucleus and mitochondrial matrix as well as between the cell lines. These sensors expressed in human epidermal keratinocytes HEK001 responded to stress induced by UVA radiation in a dose-dependent manner but not to UVB radiation. Furthermore, rxYFP sensors were able to sense dynamic and compartment-specific redox changes caused by low dose (30 µM) and moderate dose (100 M) hydrogen peroxide (H2O2). Mitochondrial matrix-targeted rxYFP displayed a greater dynamics of oxidation in response to a H2O2 challenge than the cytosol- and nucleus-targeted sensors, largely due to a more alkaline local pH environment. Similarly, the depletion of glutathione induced by buthionine sulphoximine (BSO) affected selectively mitochondrial redox potential without inducing changes in cytosol and nucleus. Furthermore, using rxYFP probes and cellular antioxidants redox state analysis, we show that oxidation of thiols occurs after activation of caspases during TRAIL-induced apoptosis. These observations support the view that mitochondrial glutathione redox state is maintained and regulated independently from that of the cytosol and nucleus. We also showed that in human cells the rxYFP probes react predominantly with glutathione since the glutathione depletion slows down the dynamics of rxYFP oxidation in response to H2O2. Taken together, our data show the robustness of the rxYFP sensors to measure compartmental redox changes in human cells. Complementary to existing redox sensors and conventional redox measurements, compartment-targeted rxYFP sensors provide a novel tool for examining mammalian cell redox homeostasis, permitting high resolution readout of steady glutathione state and dynamics of redox changes.

Le climat alpin à plus de 2400 mètres d’altitude montre des fortes variations de température, des intensités lumineuses très élevées (3000 µmol photons m-2 s-1) qui sont connues pour générer un état de réduction importante de la chaine de transport des électrons photosynthétique. Le bon fonctionnement du processus photosynthétique est primordial pour les quelques espèces de plantes vasculaires qui sont présentes à l’étage alpin et qui doivent terminer leur cycle de vie lors d’une très courte période de végétation.Soldanella alpina et Ranunculus glacialis sont deux espèces inféodées aux étages alpin et nival. Dans leur site naturel de croissance nous avons mesuré des températures faibles (0.7°C) et fortes (37°C) sous des lumières supérieures à 2500 µmol photons m-2 s-1. Chez les espèces non-alpines ces conditions induisent la photoinhibition du PSII, ce qui est évité chez S. alpina et R. glacialis, par des mécanismes très différents. Les systèmes antioxydants et le quenching non photochimique sont particulièrement importants chez S. alpina. Chez Ranunculus glacialis, la photorespiration reste très importante et un contenu élevé en PTOX est décrit. Le rôle des antioxydants et de la PTOX dans la photoprotection des deux espèces ont été étudiés. Dans une partie de thèse, nous avons montré qu’une diminution de la capacité antioxydante par une diminution de la concentration en glutathion n’affecte pas la tolérance vis-à-vis de la photoinhibition à basse température. Dans une deuxième partie les résultats supposent qu’une surexpression de la PTOX chez le tabac augmente la photoinhibition à lumière forte par production des espèces réactives d’oxygène. En utilisant différentes conditions environnementales de croissance pour Ranunculus glacialis, nous avons pu montrer que l’expression de la PTOX est induite par des fortes lumières et non par des basses températures. Grâce à une approche associant mesures d’échanges gazeux et mesures de la fluorescence de la chlorophylle, nous avons montré qu’un flux d’électrons conséquent vers l’oxygène, indépendant de la photorespiration, corrélait avec la présence de la PTOX mais que l’activité de la PTOX sous des conditions qui permettent l’assimilation du CO2 et la photorespiration n’est pas maximale. Grâce à des mesures de fluorescence chlorophyllienne en présence de différents inhibiteurs photosynthétiques, nous avons pu montrer que l’importance de ce flux d’électrons vers l’oxygène corrèle avec la quantité de PTOX présente dans les feuilles, dans des conditions réductrices. Ces résultats nous ont amenés à conclure que chez Ranunculus glacialis, la PTOX peut prendre en charge un flux significatif d’électrons, éviter ainsi l’apparition d’un état réduit de la chaine de transfert photosynthétique, et protéger la plante vis-à-vis de la photoinhibition en agissant comme une valve de sécurité. Ces travaux permettent d’apporter des précisions sur un modèle original de photoprotection, qui a été l’objet de nombreuses controverses. / The alpine climate above 2400 meters altitude shows large variations in temperature and very important light intensity (3000 µmol photons m-2 s-1), which are known to generate a state of significant reduction in the photosynthetic electron transport chain. The proper functioning of the photosynthetic process is essential for vascular plants species that are present in this alpine environment and must complete their life cycle within a very short growing season.Soldanella alpina and Ranunculus glacialis are two species restricted to alpine and snow floors. In their natural growth environment we measured very low (0.7 ° C) and high temperature (37 ° C) under lights above 2500 µmol photons m-2 s-1. Among non-alpine species such conditions induce photoinhibition of PSII, which is avoided in S. alpina and R. glacialis, by very different mechanisms. Antioxidant systems and non-photochemical quenching are particularly important in S. alpina. In Ranunculus glacialis, photorespiration remains very important and a high content of PTOX is described. The roles of antioxidants and PTOX in photoprotection of both species were studied.In one part of the thesis, we showed that a decrease in antioxidant capacity by reducing the concentration of glutathione does not affect tolerance to low-temperature photoinhibition. In the second part the results imply that overexpression of PTOX in tobacco enhances photoinhibition by strong light to produce reactive oxygen species.Using different environmental conditions for Ranunculus glacialis growth, we showed that expression of the PTOX is induced by strong light, but not by low temperatures. With an approach combining gas exchange measurements and chlorophyll fluorescence measurements, we showed that an electron flow to oxygen, independent of photorespiration, correlated with the presence of PTOX. Through measures of chlorophyll fluorescence in the presence of various inhibitors photosynthetic, we could show that the importance of this electron flow to oxygen correlates with the amount of PTOX in the leaves, under reducing conditions. These results led us to conclude that in Ranunculus glacialis, the PTOX may support a significant flow of electrons, thus avoiding the appearance of a reduced state of the photosynthetic chain transfer, and protect the plant from photoinhibition, acting as a safety valve. These studies are discussed to help clarify a new pathway of photoprotection, which was the subject of much controversy.

Nous nous sommes intéressés à l'activité antipaludique du bleu de méthylène (BM), qui fut la première molécule de synthèse utilisée dans le traitement des accès palustres. Nous avons montré que le BM est actif sur des souches cultivées de Plasmodium falciparum d'origines géographiques et de chloroquino-sensibilités différentes (CI50<10nM). Il est aussi actif sur le cycle sanguin de Plasmodium murin (DE50<15mg/Kg), mais pas sur la phase hépatique. Les stades érythrocytaires les plus sensibles sont les stades jeunes. Les associations avec les traitements classiques sont de type : antagoniste avec amodiaquine ; antagonisme-additif avec atovaquone, doxycycline, pyrimethamine ; additive-pas d'interaction avec artemether, chloroquine, mefloquine, primaquine et synergique avec la quinine. Nous avons montré par spectrométrie UV, CCM et spectrométrie de masse, qu'il n'y a pas de liaison entre le BM et l'hème. Nous avons également mis au point une nouvelle technique pour mesurer la transformation de l'hème par le glutathion et mesurer ainsi l'activité des drogues sur cette transformation.

Die Induktion antioxidativer Enzyme gilt als eine Möglichkeit, die antioxidative Kapazität von Zellen zu steigern und dadurch mit oxidativem Stress assoziierten Erkrankungen (z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Neurodegeneration, Atherosklerose) vorzubeugen. Ausgehend davon wurde in der vorliegenden Arbeit der Dual-Luciferase-Reportergen-(DLR)-Assay zum Nachweis der Induktion der antioxidativen Enzyme Katalase (CAT), zytosolische Glutathion-Peroxidase (GPX1) und Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (SOD1) entwickelt. Im Zuge dessen wurden drei Säugetierzelllinien (CaCo2, IEC-18, V79) auf ihre Eignung zur Modellzelllinie untersucht. Aufgrund der Transfektionseffizienz wurde die Fibroblastenzelllinie V79 ausgewählt. Zur Gewährleistung eines hohen Substanzdurchsatzes des DLR-Assays wurden bei der Etablierung Parameter wie Kulturplattenformat, DNA-Menge, Luciferasen-Kinetik berücksichtigt. Nach erfolgreicher Etablierung des Versuchs im 96-Well-Format wurden L-Carnitin, Catechin, Epigallocatechingallat, Genistein, Wasserstoffperoxid (H2O2), Natrium-Ascorbat, Paraquat, Quercetin, 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) und Trolox in nicht-zytotoxischen Konzentrationen hinsichtlich der Aktivierung des Ratten-CAT-, des humanen GPX1- und des humanen SOD1-Promotors untersucht. Die Bestimmung der maximal tolerierbaren Behandlungskonzentration erfolgte im Vorfeld mittels Resazurintest. Von den zehn Verbindungen zeichneten sich drei Substanzen als potente Induktoren für die SOD1 und die GPX1 aus. Die 24-stündige Behandlung von mit Reportergenkonstrukten transient transfizierten V79-Zellen mit 100 µM Paraquat resultierte in einer Verdopplung der relativen SOD1-Promotor-Aktivität und einer Erhöhung der relativen GPX1-Promotor-Aktivität auf 1,6 bzw. 1,7. Die Stimulation mit 20 µM Genistein oder 10 µM Quercetin führte wiederum zu einer Verdopplung bis Verdreifachung der relativen SOD1- und GPX1-Promotor-Aktivität. Der Promotor der Rattenkatalase konnte demgegenüber nur durch 50 µM H2O2 aktiviert werden (1,5fach). Für diesen DLR-Assays bieten sich folglich Genistein, Quercetin wie auch H2O2 als Referenzsubstanzen an. Um aber eine qualitative Charakterisierung der einzelnen Verbindungen hinsichtlich ihres Induktionspotentials zu gewährleisten, sollten von allen getesteten Substanzen Dosis-Wirkungskurven aufgenommen werden. Zudem wird für den routinemäßigen Einsatz die Verwendung stabil transfizierter Zellen zur Vermeidung von mit der Transfektion verbundenen experimentellen Schwankungen empfohlen. / The induction of antioxidative enzymes might be an opportunity to elevate the cellular antioxidative capacity and, thus, to prevent oxidative stress associated diseases (e. g. cardio-vascular disease, neurodegenerative disease, atherosclerosis). Based on this idea the dual luciferase reporter gene (DLR) assay was developed to demonstrate the induction of three antioxidative enzymes: catalase (CAT), cytosolic glutathione peroxidase (GPX1), and copper-zinc superoxide dismutase (SOD1). In the course of the development three mammalian cell lines (CaCo2, IEC-18, V79) were tested for their ability to serve as a model cell line. The line V79 was chosen due to the transfection efficiency. To give consideration to a high-throughput several parameters were studied (e. g. format of the cultural plates, amount of DNA, kinetics of the luciferases) and the DLR assay was successfully established in 96 well plates. Subsequently, L-carnitine, catechin, epigallocatechin gallate, genistein, hydrogen peroxide (H2O2), sodium ascorbate, paraquat, quercetin, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) and trolox were tested in non-cytotoxic concentrations for the activation of the rat CAT, human GPX1 and human SOD1 promoter. The maximally tolerable concentrations were determined by resazurin test in advance. Three out of these ten compounds were identified as potent inducers of GPX1 and SOD1. Stimulation of reporter gene construct transient transfected V79 cells for 24 hours with 100 µM paraquat caused a duplication of the relative GPX1 promoter activity and a 1.6-/1.7-fold increase of the relative SOD1 promoter activity. The incubation with 20 µM gen-istein or 10 µM quercetin resulted in duplication to triplication of both, the relative GPX1 and SOD1 promoter activity. In contrast, the rat CAT promoter was activated by 50 µM H2O2 (1.5-fold). Consequently, genistein, quercetin, and H2O2 are considered to be suitable reference substances for this DLR assay. To further characterize the inducing potential of the tested compounds all of them should be tested in different concentrations. Furthermore, for the routinely performed DLR assay it is recommended to use stably transfected cells to eliminate transfection caused variations.

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Le climat alpin à plus de 2400 mètres d'altitude montre des fortes variations de température, des intensités lumineuses très élevées (3000 µmol photons m-2 s-1) qui sont connues pour générer un état de réduction importante de la chaine de transport des électrons photosynthétique. Le bon fonctionnement du processus photosynthétique est primordial pour les quelques espèces de plantes vasculaires qui sont présentes à l'étage alpin et qui doivent terminer leur cycle de vie lors d'une très courte période de végétation.Soldanella alpina et Ranunculus glacialis sont deux espèces inféodées aux étages alpin et nival. Dans leur site naturel de croissance nous avons mesuré des températures faibles (0.7°C) et fortes (37°C) sous des lumières supérieures à 2500 µmol photons m-2 s-1. Chez les espèces non-alpines ces conditions induisent la photoinhibition du PSII, ce qui est évité chez S. alpina et R. glacialis, par des mécanismes très différents. Les systèmes antioxydants et le quenching non photochimique sont particulièrement importants chez S. alpina. Chez Ranunculus glacialis, la photorespiration reste très importante et un contenu élevé en PTOX est décrit. Le rôle des antioxydants et de la PTOX dans la photoprotection des deux espèces ont été étudiés. Dans une partie de thèse, nous avons montré qu'une diminution de la capacité antioxydante par une diminution de la concentration en glutathion n'affecte pas la tolérance vis-à-vis de la photoinhibition à basse température. Dans une deuxième partie les résultats supposent qu'une surexpression de la PTOX chez le tabac augmente la photoinhibition à lumière forte par production des espèces réactives d'oxygène. En utilisant différentes conditions environnementales de croissance pour Ranunculus glacialis, nous avons pu montrer que l'expression de la PTOX est induite par des fortes lumières et non par des basses températures. Grâce à une approche associant mesures d'échanges gazeux et mesures de la fluorescence de la chlorophylle, nous avons montré qu'un flux d'électrons conséquent vers l'oxygène, indépendant de la photorespiration, corrélait avec la présence de la PTOX mais que l'activité de la PTOX sous des conditions qui permettent l'assimilation du CO2 et la photorespiration n'est pas maximale. Grâce à des mesures de fluorescence chlorophyllienne en présence de différents inhibiteurs photosynthétiques, nous avons pu montrer que l'importance de ce flux d'électrons vers l'oxygène corrèle avec la quantité de PTOX présente dans les feuilles, dans des conditions réductrices. Ces résultats nous ont amenés à conclure que chez Ranunculus glacialis, la PTOX peut prendre en charge un flux significatif d'électrons, éviter ainsi l'apparition d'un état réduit de la chaine de transfert photosynthétique, et protéger la plante vis-à-vis de la photoinhibition en agissant comme une valve de sécurité. Ces travaux permettent d'apporter des précisions sur un modèle original de photoprotection, qui a été l'objet de nombreuses controverses.

La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 et BCRP/ABCG2. La surexpression des ces transporteurs peut également être le "talon d'Achille" des cellules cancéreuses résistantes en les sensibilisant à certains composés. Ce phénomène, appelé sensibilité collatérale, pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique conter les les cancers intrinséquement ou rendus résistants en éliminant sélectivement les cellules cancéreuse résistances. Ainsi, le S-vérapamil provoque la mort sélective par apoptose des cellules surexprimant suite à l'extrusion rapide et massive du glutathion 5GSH) intracellulaire par MRP1. Nous avons démontré que le vérapamil est capable de dépléter s"lectivement de leur contenu en GSH les tumeurs de cancer du poumon H69AR, MRP1 positives et résistantes, dès 3 heures d'exposition aiguë. Le vérapamil étant fortemnt carditoxique, nous avons développé de nouveaux agents de sensibilité collatérale, plus sélectif que le vérapamil, comme le xanthone 9, le flavonoïde 36 et le dimère de flavonoïde 4e. Enfin, grâce à l'étude de chimères MRP1/MRP2, nous avons démontré que la région comprenant les boucles L0 et L1-TM12 pourrait constituter les sites modualteurs et substrat du GSH sur MRP1.

of study named: Effects of selected natural substances on the antioxidant system of an organism Developed: Mgr. Anna Hodková Department of Pharmacology and Toxikology, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University in Prague Pilsen 2016 The aim of this study was to compare the effects of selected natural substances on the antioxidant defense system under comparable conditions, focusing on influencing the activity of selenoenzymes thioredoxin reductase (TrxR-1) and glutathione peroxidase (GPx-1). Experiments were performed in rats (Wistar, male). Livers, and in some cases kidneys were collected in all experiments. Homogenates were created from the collected organs and subsequently the activity of TrxR-1 and GPx-1, glutathione reductase (GR), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD), and reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation (LP) levels were determined. We demonstrated significant effects of selected natural substances on the redox system, including influences of selenoenzymes thioredoxin reductase and glutathione peroxidase. The biggest influence on the activity of selenoenzymes thioredoxin reductase and glutathione peroxidase had hydroxytyrosol (HT) and oleuropein (OLEU). In rat liver tissue there was a significant decrease of the activity of both above mentioned enzymes after...