Ulm, Univ. Diss., 2005.

Tübingen, Univ., Diss., 2004.

Amadori-Produkte werden spontan während der ersten Phase der Maillard-Reaktion aus reduzierenden Zuckern und Aminen wie Lysin gebildet. Sie entstehen während der Erhitzung von Lebensmitteln und in vivo. Der enzymatische Abbau solcher spontan gebildeten Produkte ist Thema dieser Arbeit. Ein Teil untersuchte die Rolle von Oligosaccharid-Amadori-Produkten während der Verdauung von Kohlenhydraten im Dünndarm. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Glycosidase-Inhibitoren wurde eine hemmende Wirkung der Amadori-Produkte auf die Kohlenhydratverdauung vermutet. Der andere Teil beschäftigte sich mit Fructosamin-3-kinase (FN3K) und dessen verwandtem Enzym Fructosamin-3-kinase-related Protein (FN3K-RP) aus humanen Erythrocyten. Diese Ketosaminkinasen werden als Proteinreparaturenzyme betrachtet, sogar als enzymatische Verteidigung gegen Glykierung in vivo diskutiert. Durch ihre Reaktion entstehen jedoch auch hoch-reaktive 1,2-Dicarbonylverbindungen, die weitere Proteinschäden bewirken können. Noch ist nicht klar, ob die Ketosaminkinasen die pathophysiologischen Folgen der Glykierung verhindern oder fördern. In dieser Arbeit wurde die Substratspezifität von Ketosaminkinasen mit einer Reihe von Amadori-Produkten untersucht. Damit könnten Inhibitoren zur weiteren Enzymcharakterisierung oder sogar für pharmazeutische Anwendungen identifiziert werden. Außerdem wurde die Variabilität der Enzymaktivitäten von Mensch zu Mensch in einer Kohorte von 100 Probanden untersucht. Als Modell für die menschliche Kohlenhydratverdauung im Dünndarm wurden Caco-2-Zellen als Monolayer etabliert. Deren Sucrase-Isomaltase kann die alpha-glycosidische Bindung in Amadori-Produkten von Maltose und Maltotriose mit Lysin und auch in Maltulose hydrolysieren. Trotz der Aminogruppe hemmen diese Amadori-Produkte die Maltosehydrolyse nur schwach als konkurrierende Substrate. Lactulosyllysin konnte nicht durch die Lactase der Caco-2-Zellen hydrolysiert werden. Tagatosyllysin und die Heyns-Produkte Glucosyllysin und Mannosyllysin hemmten die Lactosehydrolyse schwach. Alle beobachteten Hemmeffekte sind wahrscheinlich zu schwach, um während der Verdauung in vivo bedeutsam zu sein. Für FN3K konnte Desoxypiperidinofructose als kompetitiver Inhibitor identifiziert werden (Kic 0,006 mM). FN3K zeigte nur geringe Selektivität gegenüber Amadori-Produkten verschiedener Amine, ausgenommen aromatischer Amine. FN3K-RP war in Erythrocyten wesentlich aktiver als FN3K, auch wenn die Aktivität nicht selektiv inhibiert werden konnte. Beide Enzymaktivitäten unterscheiden sich unter den 100 Probanden, mit einer Spannweite von 3 bis 12 mU/g Hämoglobin für FN3K und 60 bis 135 mU/g Hb für FN3K und FN3K-RP zusammen. Es scheint eine Verbindung zwischen der Ketosaminkinase-Aktivität in Erythrocyten und Nierenerkrankungen, familiär auftretendem Diabetes mellitus, sowie familiär aufgetretenen Herzinfarkten oder Schlaganfällen zu bestehen, wie orientierende Auswertungen zeigten. Deshalb ist eine genauere Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Ketosaminkinasen nötig. / Amadori products are formed spontaneously from reducing sugars and amines, e.g. lysine, during the first phase of the Maillard reaction. They occur in heated food and in vivo. The thesis focuses on the enzymatic degradation of such spontaneously formed compounds. One part of this work investigated the faith and impact of oligosaccharide derived Amadori products during small intestinal carbohydrate digestion. Due to their structural similarity with known glycosidase inhibitors, an inhibitory action of Amadori products towards carbohydrate digestions was assumed. The other part dealt with fructosamine-3-kinase (FN3K) and its related protein (FN3K-RP) from human erythrocytes. Such ketosamine kinases are regarded as protein repair enzymes, maybe even an enzymatic defence against glycation in vivo. While deglycating protein bound Amadori products, however, they produce highly reactive 1,2-dicarbonyl compounds, which can lead to further protein damage. It is unclear, whether the ketosamine kinase action prevents or supports the pathophysiological effects of glycation. This work studied the substrate specifity of ketosamine kinases with a variety of Amadori products, which could result in inhibitors for further enzyme characterisation or even pharmaceutical uses. Further, the variability of both enzyme activities in a cohort of 100 subjects was examined. As a model for human small intestinal carbohydrate digestion, a Caco-2 cell monolayer was employed. Their sucrase-isomaltase is able to hydrolyse the alpha-glucosidic linkage in Amadori products of maltose and maltotriose with lysine, as well as in maltulose. Despite their amino group, those amadori products inhibited maltose hydrolysis merely weakly as competing substrates. Lactulosyl lysine on the other hand could not be hydrolysed by Caco-2 lactase. Tagatosyl lysine and the Heyns products glucosyl lysine and mannosyl lysine showed weak inhibition of lactose hydrolysis. All observed inhibitory effects are probably too weak to be of importance during carbohydrate digestion in vivo. Deoxypiperidinofructose was identified as a competitive inhibitor of FN3K (Kic 0,006 mM). FN3K acted rather non-specific towards Amadori products of different amines, except aromatic amines. FN3K-RP showed much higher activity in erythrocytes than FN3K, although its activity could not be inhibited selectively. Both enzyme activities vary among 100 subjects, with a range of 3 to 12 mU/g hemoglobin for FN3K and 60 to 135 mU/g hb for FN3K and FN3K-RP together. Relations of ketosamine kinase activity in erythrocytes with renal diseases, familial diabetes mellitus and familial cardiovascular events seem to exist. Thus, investigating the physiological impact of ketosamine kinases is necessary.

Casein is the major protein fraction in milk, and its cross-linking has been a topic of scientific interest for many years. Enzymatic cross-linking has huge potential to modify relevant techno-functional properties of casein, whereas non-enzymatic cross-linking occurs naturally during the storage and processing of milk and dairy products. Two size separation techniques were applied for characterisation of these reactions: gel electrophoresis and size exclusion chromatography. This review summarises their separation principles and discusses the outcome of studies on cross-linked casein from the last ~20 years. Both methods, however, show limitations concerning separation range and are applied mainly under denaturing and reducing conditions. In contrast, field flow fractionation has a broad separation range and can be easily applied under native conditions. Although this method has become a powerful tool in polymer and nanoparticle analysis and was used in few studies on casein micelles, it has not yet been applied to investigate cross-linked casein. Finally, the principles and requirements for absolute molar mass determination are reviewed, which will be of increased interest in the future since suitable calibration substances for casein polymers are scarce.

Furosin entsteht bei der Salzsäurehydrolyse aus den Amadori-Produkten des Lysins und wird als Marker für den Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion, zur Beurteilung von lebensmitteltechnologischen Prozessen sowie zur Berechnung des verfügbaren und des nicht verfügbaren Lysins in Lebensmitteln verwendet. Für die Nutzung von Furosin als Qualitätsparameter ist die reproduzierbare und konstante Bildung während der Salzsäurehydrolyse entscheidend. Dies wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit galt es deshalb, die molaren Ausbeuten an Furosin und den weiteren Hydrolyseprodukten Lysin, Pyridosin und N[epsilon]-Carboxymethyl-lysin zu bestimmen und damit eine sichere Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Dazu wurden peptid-gebundene Amadori-Produkte des N[alpha]-Hippuryl-lysins in chromatographisch reiner Form dargestellt. Weiterhin wurden N[alpha]-Hippuryl-N[epsilon]-carboxymethyl-lysin und Pyridosin als Standard gewonnen. Bei den Hydrolyseexperimenten zeigten die Fructosyl-Amadori-Produkte ein ähnliches Verhalten. Nach Hydrolyse mit 6M Salzsäure wurden molare Ausbeuten an Furosin von 32% für Fructosyl-lysin und jeweils 34% für Lactulosyl- und Maltulosyl-lysin bestimmt. Signifikant höhere Ausbeuten an Furosin waren nach Hydrolyse mit 8M Salzsäure festzustellen, 46% für Fructosyl-lysin, 50% für Lactulosyl-lysin und 51% für Maltulosyl-lysin. Im Gegensatz zu den Fructosyl-Derivaten war die molare Ausbeute an Furosin bei Tagatosyl-lysin unabhängig von der verwendeten Salzsäurekonzentration (6 bis 8M) und wurde zu 42% bestimmt. Anhand der auf Basis der molaren Ausbeuten ermittelten Überführungsfaktoren kann nun erstmals die Lysin-Derivatisierung mittels der Analytik von Furosin sicher bestimmt werden. Das ermöglicht exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer Glykierungsreaktionen sowohl in Lebensmittel als auch in vivo. Aufgrund der Relevanz für biologische Systeme und für Lebensmittel wurden weiterhin Reaktionen von alpha-Dicarbonylverbindungen mit kurzkettigen Peptiden und dem Protein Insulin unter physiologischen Bedingungen (pH=7,4 und 37°C) untersucht. Bei der Reaktion von Glyoxal mit ausgewählten Tripeptiden wurde eine sehr schnelle Derivatisierung der Peptide und jeweils die gleichzeitige Bildung eines definierten Produktes festgestellt. Mittels nuklearmagnetischer Resonanzspektroskopie und massenspektroskopischer Analyse konnten die Produkte zweifelsfrei, jeweils als die am N-Terminus durch einen 2(1H)-Pyrazinon-Ring modifizierten Peptide, aufgeklärt werden. Das Hauptprodukt der Reaktion von Methylglyoxal mit dem Peptid Gly-Ala-Phe wurde ebenfalls als 2(1H)-Pyrazinon-Peptid aufgeklärt. Nach Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen in verdünnter Lösung konnte weiterhin gezeigt werden, dass die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung ebenfalls an einem Protein erfolgt. Die identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone weisen charakteristische UV-Absorptions- sowie Fluoreszenz-Spektren auf. Um die Reaktivität des N-Terminus und damit die Bedeutung der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beurteilen zu können, wurden vergleichende Studien mit dem als Hauptreaktionspartner für alpha-Dicarbonylverbindungen angesehenen Arginin durchgeführt. Bei diesen Experimenten zeigte der N-Terminus und peptidgebundenes Arginin eine nahezu identische Reaktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse ist fest davon auszugehen, dass es sich bei den identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen um eine neue Klasse von sogenannten Advanced Glycation Endproducts (AGEs) mit Bedeutung in physiologischen Systemen und in Lebensmitteln handelt.

Casein is the major protein fraction in milk, and its cross-linking has been a topic of scientific interest for many years. Enzymatic cross-linking has huge potential to modify relevant techno-functional properties of casein, whereas non-enzymatic cross-linking occurs naturally during the storage and processing of milk and dairy products. Two size separation techniques were applied for characterisation of these reactions: gel electrophoresis and size exclusion chromatography. This review summarises their separation principles and discusses the outcome of studies on cross-linked casein from the last ~20 years. Both methods, however, show limitations concerning separation range and are applied mainly under denaturing and reducing conditions. In contrast, field flow fractionation has a broad separation range and can be easily applied under native conditions. Although this method has become a powerful tool in polymer and nanoparticle analysis and was used in few studies on casein micelles, it has not yet been applied to investigate cross-linked casein. Finally, the principles and requirements for absolute molar mass determination are reviewed, which will be of increased interest in the future since suitable calibration substances for casein polymers are scarce.

Furosin entsteht bei der Salzsäurehydrolyse aus den Amadori-Produkten des Lysins und wird als Marker für den Fortschritt der frühen Maillard-Reaktion, zur Beurteilung von lebensmitteltechnologischen Prozessen sowie zur Berechnung des verfügbaren und des nicht verfügbaren Lysins in Lebensmitteln verwendet. Für die Nutzung von Furosin als Qualitätsparameter ist die reproduzierbare und konstante Bildung während der Salzsäurehydrolyse entscheidend. Dies wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit galt es deshalb, die molaren Ausbeuten an Furosin und den weiteren Hydrolyseprodukten Lysin, Pyridosin und N[epsilon]-Carboxymethyl-lysin zu bestimmen und damit eine sichere Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Dazu wurden peptid-gebundene Amadori-Produkte des N[alpha]-Hippuryl-lysins in chromatographisch reiner Form dargestellt. Weiterhin wurden N[alpha]-Hippuryl-N[epsilon]-carboxymethyl-lysin und Pyridosin als Standard gewonnen. Bei den Hydrolyseexperimenten zeigten die Fructosyl-Amadori-Produkte ein ähnliches Verhalten. Nach Hydrolyse mit 6M Salzsäure wurden molare Ausbeuten an Furosin von 32% für Fructosyl-lysin und jeweils 34% für Lactulosyl- und Maltulosyl-lysin bestimmt. Signifikant höhere Ausbeuten an Furosin waren nach Hydrolyse mit 8M Salzsäure festzustellen, 46% für Fructosyl-lysin, 50% für Lactulosyl-lysin und 51% für Maltulosyl-lysin. Im Gegensatz zu den Fructosyl-Derivaten war die molare Ausbeute an Furosin bei Tagatosyl-lysin unabhängig von der verwendeten Salzsäurekonzentration (6 bis 8M) und wurde zu 42% bestimmt. Anhand der auf Basis der molaren Ausbeuten ermittelten Überführungsfaktoren kann nun erstmals die Lysin-Derivatisierung mittels der Analytik von Furosin sicher bestimmt werden. Das ermöglicht exakte Aussagen zum Fortschritt nichtenzymatischer Glykierungsreaktionen sowohl in Lebensmittel als auch in vivo. Aufgrund der Relevanz für biologische Systeme und für Lebensmittel wurden weiterhin Reaktionen von alpha-Dicarbonylverbindungen mit kurzkettigen Peptiden und dem Protein Insulin unter physiologischen Bedingungen (pH=7,4 und 37°C) untersucht. Bei der Reaktion von Glyoxal mit ausgewählten Tripeptiden wurde eine sehr schnelle Derivatisierung der Peptide und jeweils die gleichzeitige Bildung eines definierten Produktes festgestellt. Mittels nuklearmagnetischer Resonanzspektroskopie und massenspektroskopischer Analyse konnten die Produkte zweifelsfrei, jeweils als die am N-Terminus durch einen 2(1H)-Pyrazinon-Ring modifizierten Peptide, aufgeklärt werden. Das Hauptprodukt der Reaktion von Methylglyoxal mit dem Peptid Gly-Ala-Phe wurde ebenfalls als 2(1H)-Pyrazinon-Peptid aufgeklärt. Nach Inkubation von Insulin mit Glyoxal unter physiologischen Bedingungen in verdünnter Lösung konnte weiterhin gezeigt werden, dass die 2(1H)-Pyrazinon-Bildung ebenfalls an einem Protein erfolgt. Die identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinone weisen charakteristische UV-Absorptions- sowie Fluoreszenz-Spektren auf. Um die Reaktivität des N-Terminus und damit die Bedeutung der 2(1H)-Pyrazinon-Bildung beurteilen zu können, wurden vergleichende Studien mit dem als Hauptreaktionspartner für alpha-Dicarbonylverbindungen angesehenen Arginin durchgeführt. Bei diesen Experimenten zeigte der N-Terminus und peptidgebundenes Arginin eine nahezu identische Reaktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse ist fest davon auszugehen, dass es sich bei den identifizierten N-terminalen 2(1H)-Pyrazinonen um eine neue Klasse von sogenannten Advanced Glycation Endproducts (AGEs) mit Bedeutung in physiologischen Systemen und in Lebensmitteln handelt.

Amadori-Produkte werden spontan während der ersten Phase der Maillard-Reaktion aus reduzierenden Zuckern und Aminen wie Lysin gebildet. Sie entstehen während der Erhitzung von Lebensmitteln und in vivo. Der enzymatische Abbau solcher spontan gebildeten Produkte ist Thema dieser Arbeit. Ein Teil untersuchte die Rolle von Oligosaccharid-Amadori-Produkten während der Verdauung von Kohlenhydraten im Dünndarm. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit bekannten Glycosidase-Inhibitoren wurde eine hemmende Wirkung der Amadori-Produkte auf die Kohlenhydratverdauung vermutet. Der andere Teil beschäftigte sich mit Fructosamin-3-kinase (FN3K) und dessen verwandtem Enzym Fructosamin-3-kinase-related Protein (FN3K-RP) aus humanen Erythrocyten. Diese Ketosaminkinasen werden als Proteinreparaturenzyme betrachtet, sogar als enzymatische Verteidigung gegen Glykierung in vivo diskutiert. Durch ihre Reaktion entstehen jedoch auch hoch-reaktive 1,2-Dicarbonylverbindungen, die weitere Proteinschäden bewirken können. Noch ist nicht klar, ob die Ketosaminkinasen die pathophysiologischen Folgen der Glykierung verhindern oder fördern. In dieser Arbeit wurde die Substratspezifität von Ketosaminkinasen mit einer Reihe von Amadori-Produkten untersucht. Damit könnten Inhibitoren zur weiteren Enzymcharakterisierung oder sogar für pharmazeutische Anwendungen identifiziert werden. Außerdem wurde die Variabilität der Enzymaktivitäten von Mensch zu Mensch in einer Kohorte von 100 Probanden untersucht. Als Modell für die menschliche Kohlenhydratverdauung im Dünndarm wurden Caco-2-Zellen als Monolayer etabliert. Deren Sucrase-Isomaltase kann die alpha-glycosidische Bindung in Amadori-Produkten von Maltose und Maltotriose mit Lysin und auch in Maltulose hydrolysieren. Trotz der Aminogruppe hemmen diese Amadori-Produkte die Maltosehydrolyse nur schwach als konkurrierende Substrate. Lactulosyllysin konnte nicht durch die Lactase der Caco-2-Zellen hydrolysiert werden. Tagatosyllysin und die Heyns-Produkte Glucosyllysin und Mannosyllysin hemmten die Lactosehydrolyse schwach. Alle beobachteten Hemmeffekte sind wahrscheinlich zu schwach, um während der Verdauung in vivo bedeutsam zu sein. Für FN3K konnte Desoxypiperidinofructose als kompetitiver Inhibitor identifiziert werden (Kic 0,006 mM). FN3K zeigte nur geringe Selektivität gegenüber Amadori-Produkten verschiedener Amine, ausgenommen aromatischer Amine. FN3K-RP war in Erythrocyten wesentlich aktiver als FN3K, auch wenn die Aktivität nicht selektiv inhibiert werden konnte. Beide Enzymaktivitäten unterscheiden sich unter den 100 Probanden, mit einer Spannweite von 3 bis 12 mU/g Hämoglobin für FN3K und 60 bis 135 mU/g Hb für FN3K und FN3K-RP zusammen. Es scheint eine Verbindung zwischen der Ketosaminkinase-Aktivität in Erythrocyten und Nierenerkrankungen, familiär auftretendem Diabetes mellitus, sowie familiär aufgetretenen Herzinfarkten oder Schlaganfällen zu bestehen, wie orientierende Auswertungen zeigten. Deshalb ist eine genauere Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Ketosaminkinasen nötig. / Amadori products are formed spontaneously from reducing sugars and amines, e.g. lysine, during the first phase of the Maillard reaction. They occur in heated food and in vivo. The thesis focuses on the enzymatic degradation of such spontaneously formed compounds. One part of this work investigated the faith and impact of oligosaccharide derived Amadori products during small intestinal carbohydrate digestion. Due to their structural similarity with known glycosidase inhibitors, an inhibitory action of Amadori products towards carbohydrate digestions was assumed. The other part dealt with fructosamine-3-kinase (FN3K) and its related protein (FN3K-RP) from human erythrocytes. Such ketosamine kinases are regarded as protein repair enzymes, maybe even an enzymatic defence against glycation in vivo. While deglycating protein bound Amadori products, however, they produce highly reactive 1,2-dicarbonyl compounds, which can lead to further protein damage. It is unclear, whether the ketosamine kinase action prevents or supports the pathophysiological effects of glycation. This work studied the substrate specifity of ketosamine kinases with a variety of Amadori products, which could result in inhibitors for further enzyme characterisation or even pharmaceutical uses. Further, the variability of both enzyme activities in a cohort of 100 subjects was examined. As a model for human small intestinal carbohydrate digestion, a Caco-2 cell monolayer was employed. Their sucrase-isomaltase is able to hydrolyse the alpha-glucosidic linkage in Amadori products of maltose and maltotriose with lysine, as well as in maltulose. Despite their amino group, those amadori products inhibited maltose hydrolysis merely weakly as competing substrates. Lactulosyl lysine on the other hand could not be hydrolysed by Caco-2 lactase. Tagatosyl lysine and the Heyns products glucosyl lysine and mannosyl lysine showed weak inhibition of lactose hydrolysis. All observed inhibitory effects are probably too weak to be of importance during carbohydrate digestion in vivo. Deoxypiperidinofructose was identified as a competitive inhibitor of FN3K (Kic 0,006 mM). FN3K acted rather non-specific towards Amadori products of different amines, except aromatic amines. FN3K-RP showed much higher activity in erythrocytes than FN3K, although its activity could not be inhibited selectively. Both enzyme activities vary among 100 subjects, with a range of 3 to 12 mU/g hemoglobin for FN3K and 60 to 135 mU/g hb for FN3K and FN3K-RP together. Relations of ketosamine kinase activity in erythrocytes with renal diseases, familial diabetes mellitus and familial cardiovascular events seem to exist. Thus, investigating the physiological impact of ketosamine kinases is necessary.