Le besoin clinique de greffes alternatives pour le remplacement des vaisseaux sanguins de petit diamètre a stimulé l'émergence du domaine de l'ingénierie tissulaire vasculaire. Des constructions tubulaires ont été développées au cours des dernières décennies en combinant des échafaudages (structures 3D composées de matrices décellularisées, polymères naturels ou synthétiques), des cellules (cellules adultes ou souches) et des signaux régulateurs (nutriments, facteurs de croissance et / ou stimuli mécaniques) visant à mimer les propriétés de la paroi vasculaire. Le gel de collagène constitue un échafaudage couramment utilisé dans le domaine puisqu'il s'agit de la principale protéine de la paroi vasculaire et qu'il contient donc des signaux structurels et biochimiques inhérents pour favoriser la formation des tissus in vitro. Le Laboratoire de biomatériaux et de bioingénierie de l'Université Laval possède une expertise sur l'extraction de la protéine, la production et la caractérisation de gels tubulaires cellulaires à base de collagène et le groupe rapporte des avancées significatives dans la fabrication d'un modèle tri-culture répliquant les trois couches de la paroi vasculaire. Un inconvénient récurrent de l'utilisation de polymères naturels pour la composition des échafaudages repose sur les faibles propriétés mécaniques résultant de leur processus d'extraction. De plus, la structure et la composition organisées des vaisseaux sanguins confèrent un comportement mécanique unique qui orchestre parfaitement la propagation du sang dans tous les tissus du corps. Cette structure et ce comportement complexes sont difficiles à reproduire dans des constructions d'ingénierie tissulaire et cela a fait l'objet d'intenses recherches au cours des cinquante dernières années. Dans cette optique, l'objectif de cette thèse de doctorat était de concevoir et développer différentes stratégies pour renforcer les gels tubulaires à base de collagène pour des applications vasculaires. Les stratégies étudiées dans cette thèse ont été conçues pour maintenir la similitude biologique du modèle avec le tissu natif et ainsi, aucun composant synthétique ou produit chimique n'a été introduit. Le renforcement des gels tubulaires à base de collagène a été exploré en modifiant différents composants impliqués dans leur préparation: suspension cellulaire, solution de collagène et maturation. Une densité d'ensemencement cellulaire supérieure à celle couramment trouvée dans la littérature, l'incorporation de recombinamers de type élastine (ELR) dans l'échafaudage et la stimulation mécanique dans un bioréacteur de perfusion ont amélioré les propriétés mécaniques des constructions et la raison commune en était l'augmentation de la production d'ECM. Une densité d'ensemencement cellulaire égale ou supérieure à 1.5 x 10⁶ cellules/mL, un échafaudage composé de 70 % de collagène et 30 % de ELR (w %) et la stimulation mécanique dans un bioréacteur de perfusion pendant la maturation sont les conditions suggérées dans chaque stratégie pour la fabrication de modèles de parois vasculaires. En outre, une plate-forme physiologiquement pertinente pour la fabrication et la maturation in situ d'un modèle de paroi vasculaire avancé a été développée, constituant une alternative précieuse pour le test de nouveaux médicaments, technologies et dispositifs endovasculaires et pour l'étude du processus patho/physiologique se produisant dans ce tissu. / The clinical need for alternative grafts for the replacement of small diameter blood vessels stimulated the emergence of the vascular tissue engineering field. Tubular constructs have been developed in the last decades by combining scaffolds (3D structures composed of decellularized matrices, natural or synthetic polymers), cells (adult or stem cells) and regulatory signals (nutrients, growth factors and/or mechanical stimulus) aiming to mimic the properties of the vascular wall. Collagen gel is one common scaffold used in the field since it is the main protein of the vascular wall and therefore it contains inherent structural and biochemical cues to promote tissue formation in vitro. The Laboratory for Biomaterials and Bioengineering of Laval University has an expertise on the extraction of the protein, production, and characterization of cellularized collagen-based tubular gels. Furthermore, the group has been reporting significant advancements in the fabrication of a tri-culture model replicating the three layers of the vascular wall. One recurrent drawback of using natural polymers for composing the scaffolds relies on the low mechanical properties resulted from their extraction process. In addition, the organized structure and composition of blood vessels imparts a unique mechanical behavior which perfectly orchestrate the blood propagation into all tissues of the body. This complex structure and behavior are challenging to reproduce in tissue engineered constructs and this has been a subject of intense research during the last fifty years. In this light, the objective of this doctoral thesis was to design and develop different strategies to reinforce collagen-based tubular gels for vascular applications. The strategies investigated in this thesis were designed to maintain the biological similarity of the model with the native tissue and so, no synthetic components or chemicals were introduced. The reinforcement of collagen-based tubular gels was explored by altering different components involved in their preparation: cell suspension, collagen solution and maturation. Cell seeding density higher than the commonly found in literature, the incorporation of elastin-like recombinamers (ELR) in the scaffold and the mechanical stimulation in a perfusion bioreactor improved the mechanical properties of the constructs and the common reason of that was the increase in the ECM production. Cell seeding density equal or higher than 1.5 x 10⁶ cells/mL, a scaffold composed of 70 % collagen and 30 % ELR (w %) and the mechanical stimulation in a perfusion bioreactor during maturation are the conditions suggested in each strategy for the fabrication of vascular wall models. Furthermore, a physiologically relevant platform for the in situ fabrication and maturation of an advanced vascular wall model was developed constituting a valuable alternative for the testing of new drugs, technologies and endovascular devices and for the investigation of patho/physiological process occurring in this tissue.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive causée par l'absence d'une protéine, la dystrophine. Notre laboratoire travaille sur un traitement potentiel qui consiste à remplacer la protéine manquante en transplantant des myoblastes normaux ou génétiquement modifiés dans le muscle du patient atteint. Par contre, cette technique comporte des limitations; la mort cellulaire précoce, la faible dispersion ainsi que le rejet immunitaire nuisent à son succès. Ce projet de maîtrise vise à améliorer la greffe de myoblastes grâce à l'utilisation de l'epigallocatechin-gallate (EGCG), une composante majeure du thé vert. Récemment, il a été rapporté que l'inhibition de RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mène à une augmentation de la prolifération et de la migration et à une diminution de la différenciation et de la mort par apoptose des myoblastes [3]. L'EGCG, reconnu pour ces propriétés anti-oxydantes, pourrait en plus d'aider à réduire le stress oxydatif et l'inflammation causés lors de la transplantation, permettre une amélioration de la survie des myoblastes transplantés puisqu'elle pourrait avoir un effet sur l'expression du récepteur RAGE [4]. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet de l'EGCG sur RAGE dans le contexte de la greffe de myoblastes. Notre hypothèse est donc que l'EGCG pourrait inhiber transitoirement l'expression de RAGE et augmenter la prolifération et la migration et diminuer la fusion et la mort par apoptose des myoblastes transplantés pour ainsi améliorer le succès de greffe. Nous avons confirmé que l'EGCG pouvait diminuer le niveau d'expression de RAGE dans les myoblastes et dans les muscles de souris. Nous avons obtenu une augmentation de la survie des myoblastes lorsque confrontés à un stress tel que la glucose oxydase. Nous avons aussi remarqué une diminution de la fusion des myoblastes in vitro mais malheureusement, nous ne pouvons confirmer l'augmentation du succès de greffe. Un test de migration pourrait être effectué pour vérifier l'effet de l'EGCG sur la migration des myoblastes ainsi qu'une autre expérience pour confirmer le succès de greffe.

Lung transplantation is the only therapeutic approach for patients presenting end-stage pulmonary failure. Despite progress made in organ preservation and immunosuppression, primary graft dysfunction and obliterative bronchiolitis still hamper short-term and long-term outcomes, respectively. Interleukin-17 recently emerged as a major actor in several immuno-inflammatory disorders. Clinical and experimental evidence also suggest the implication of interleukin-17 or type 17 CD4+ T cells in lung rejection. We therefore investigated the contribution of this cytokine to graft pathology in a murine model of tracheal transplantation that recapitulates pathological features of lung rejection including the development of obliterative airway disease.<p>We first demonstrated that interleukin-17 contributes to inflammatory lesions in the early phase post-transplantation. Interleukin-17 was found to be produced by &61543;&61540;+ T cells and CD4+ T cells infiltrating the graft and interleukin-17 neutralization significantly reduced the development of epithelial lesions together with inhibition of interleukin-6 and heat-shock-protein 70 gene transcription.<p>We then investigated the contribution of interleukin-17 to obliterative airway disease. Although interleukin-17 did not play a dominant role in absence of immunosuppression, it was found to contribute to airway pathology in animals receiving cyclosporin A. Under this treatment, we first observed dramatic changes in the composition of the lymphocyte populations infiltrating the graft: the numbers of CD8+ T cells producing interferon-&61543; and type 1 CD4+ T cells were dramatically decreased while the numbers of type 17, and also type 2 CD4+ T cells were unaffected. The pathological relevance of these findings was first demonstrated by the prolongation of graft survival afforded by the depletion of CD4+ T cells in cyclosporin A-treated animals. Furthermore, graft rejection was also delayed in mice genetically deficient in either interleukin-17 or interleukin-4, providing evidence that type 17 and type 2 CD4+ T cells actively contribute to graft rejection in cyclosporin A-treated recipients. On the other hand, parallel experiments in interferon-&61543;-deficient mice revealed that interferon-& / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cardiac transplantation is governed by complex immunological mechanisms contributing to different types of allograft rejection. Early non-specific graft failure and chronic rejection (cardiac allograft vasculopathy) represent the main limitations for the recipients’ short- and long-term survival respectively. To date, the pathogenesis of both rejection types remains ill-defined. However, it is believed that they are related to an immunologically mediated potent inflammatory process, occurring whether early after transplantation (acute), or lasting for the lifetime of the graft (chronic).<p> <p>The initiating mechanisms of chronic rejection in solid organ transplantation remain ill-defined. Emerging evidence sustains that graft vasculopathy is primarily driven by alloreactive CD4+ T lymphocytes sensitized by the indirect pathway of allorecognition. To date, whereas the nature of APCs involved in this particular pathway has yet to be identified, it appears challenging to speculate that recipient-derived endothelial cells (ECs) repopulating the graft may represent the main cell targets recognized by indirectly primed alloreactive CD4+ T cells to mediate the rejection of cardiac transplants. In the first part of this thesis, we specifically studied the indirect pathway of allorecognition with a transgenic mice (Marilyn mice) model that expresses a T cell receptor (TCR) transgene which recognizes the male antigen H-Y in an I-Ab-restricted fashion. Our results provide evidence that graft endothelium replacement by recipient-type cells expressing MHC Class II molecules is required for the chronic rejection of vascularized cardiac transplants mediated by indirect pathway alloreactive CD4+ T cells.<p><p>The purpose of the second part of the thesis was to investigate the potential implication of interleukin-22 (IL-22), an early phase secreted proinflammatory cytokine of the IL-10 family, in the acute rejection of cardiac allografts. IL-22 was recently described as an effector key modulator of the inflammatory process produced mainly by differentiated CD4+ T cells of the Th17 lineage. As being closely related to IL-10 and IL-17, both involved in the rejection process of vascularized heart allografts, we attempted to determine the precise role of IL-22 in this process. Experiments were conducted with a recently developed murine model deficient for the IL-22 gene (IL-22KO). The results of the second part of the thesis show that IL-22 is not an effector cytokine in cardiac allograft rejection. In contrast, as being early expressed into the allograft, likely IL-22 plays a protective role in the inflammation leading to acute cardiac rejection, probably depending on a neutrophil-related mechanism. <p><p><p>In conjunction with current understanding of inflammatory and antigen-specific events in allografts, overall, our results provide new insights into the mechanisms of chronic and acute cardiac rejection, thus prompting to further interrogations and appealing novel therapeutic strategies. Pharmacologic manipulation of endothelium is challenging. Given their capacity to sense and rapidly respond to the local environment, ECs are the ideal targets for rapid systemic delivery of therapeutic agents. Combination therapy is required to reduce inflammatory reaction and endothelial activation, to modulate endothelial dysfunction and promote endothelial survival. Also, given that IL-22 may alleviate tissue destruction during inflammatory responses, therapies that enhance its production and protective action in the transplanted organs seem attractive to specifically affect tissue responses, without exerting direct effects on the immune response.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

Mon projet de thèse se déroule dans le cadre du projet ANR TecSan 2006 GRECO (GREffe de COrnée automatisée par laser femtoseconde avec optimisation de la longueur d'onde et correction du front d'onde, ANR-06-TecSan-025) piloté par notre groupe. Ce projet de 3 ans a été proposé suite au succès de l'utilisation des lasers à impulsions ultra-rapides dans la chirurgie réfractive et à la volonté d'étendre cette technologie à la greffe. La plupart des indications de greffe sont associées à une qualité optique de la cornée du patient insuffisante, ce qui rend difficile l'intervention par laser. Comme nos recherches l'ont démontré, la forte diffusion optique des cornées pathologiques aux longueurs d'onde actuellement utilisées peut être compensée par une augmentation de la longueur d'onde des lasers vers 1,65 µm. Nos partenaires sont l'hôpital Hôtel-Dieu de Paris, la société Imagine Eyes et l'Institut d'Optique Graduate School. *** Objectifs de la thèse *** Les principaux objectifs de mon projet étaient les suivants : - Le développement de sources lasers optimisées pour la greffe de cornée basées sur la conversion de longueurs d'onde par optique non-linéaire ; - L'étude de l'interaction laser-tissu en vue d'une optimisation des paramètres laser ; - La conception et la mise en place d'un système démonstrateur pour la chirurgie laser. *** Présentation des principaux résultats obtenus *** (1) Source accordable par Amplification Paramétrique Optique (OPA) Dans un premier temps, le plan de travail du projet GRECO prévoyait le montage d'une source flexible et accordable basée sur un laser titane:saphire disponible au laboratoire. Nous avons choisi une architecture originale de type OPA, composée de deux étages d'amplification (basés sur deux cristaux de caractéristiques différentes) avec injection d'un supercontinuum de lumière blanche. Le premier étage assure une bonne sélectivité en longueur d'onde et le deuxième étage fournit un fort gain notamment au double de la longueur d'onde de pompe. Les efficacités de conversion sur l'ensemble du système atteignent 20 % quelque soit la longueur d'onde amplifiée. Le système fournit des impulsions de 300 µJ accordables entre 1,2 µm et 1,75 µm pour le signal. Cette source a servi pour toutes les expériences chirurgicales exploratoires de la première moitié du projet GRECO. (2) Source accordable par Génération Paramétrique Optique (OPG) En parallèle des expériences chirurgicales sur l'interaction laser-tissu, une deuxième source, plus compacte et potentiellement adaptée à un contexte clinique, a été développée. Cette deuxième source est pompée par un laser industriel également compact et stable, et émettant à 1,03 µm. Cette longueur d'onde est convertie par génération paramétrique optique dans un seul cristal nonlinéaire périodiquement polarisé ne nécessitant aucune injection. Dans un premier temps, l'ajustement de la longueur d'onde du signal amplifié se fait par simple changement de la température du cristal sans nécessiter d'alignement, ce qui contribue à la robustesse du système. Un seul passage permet une efficacité de conversion d'environ 20 %, et un maximum d'énergie de 20 µJ ce qui correspond à une amélioration d'un facteur 100 par rapport à l'état de l'art. L'utilisation de plusieurs structures périodiques juxtaposées permet d'obtenir une accordabilitée totale entre 1450 nm et 1900 nm qui couvre donc les bandes d'absorption et notamment de transparence des tissus du segment antérieur. (3) Résultats chirurgicaux sur la cornée et la sclère Nos expériences chirurgicales ont été effectuées sur des cornées obtenues auprès de la Banque Française des Yeux. Nous avons réalisé une étude systématique de la profondeur de pénétration et de la qualité du résultat chirurgical en fonction de la longueur d'onde et de l'état pathologique de la cornée. En parallèle, des mesures systématiques de transparence cornéenne en fonction de la présence et du degré d'œdème ont été menées. Les mesures de transparence puis les expériences chirurgicales utilisant l'OPA ou l'OPG ont mis en évidence une forte dépendance entre profondeur de pénétration et longueur d'onde. - L'utilisation des longueurs d'onde autour de 1 µm correspondant aux systèmes cliniques actuels se heurte à une profondeur de pénétration très limitée dans des cornées œdémateuses. Ce constat est en accord avec l'expérience de nos partenaires cliniques qui estiment également que les performances des systèmes actuels sont limitées pour une application à la greffe de cornée. - L'augmentation de la longueur d'onde limite la contribution des processus de diffusion de la lumière. Néanmoins, la bande d'absorption de l'eau centrée à 1,45 µm augmente la contribution des effets thermiques. L'utilisation de longueurs d'onde proches de cette bande n'est donc pas réaliste. - Il existe une fenêtre de relative transparence optique centrée à 1,65 µm au sein de laquelle l'absorption est faible et la contribution de la diffusion de la lumière est quasi négligeable. Dans l'absolu, nous avons pu constater une amélioration d'environ un facteur 3 par rapport aux lasers cliniques travaillant aux longueurs d'onde autour de 1 µm. La qualité des incisions est excellente et la validité des hypothèses de travail du projet GRECO a pu être vérifiée. (4) Le dispositif démonstrateur pour la greffe de cornée automatisée et de géométrie complexe. Le programme de travail du projet GRECO prévoyait le montage d'un système démonstrateur regroupant les éléments d'un système de greffe de cornée. Le démonstrateur est composé de trois parties modulables. La première unité contient le laser qui peut être soit un laser fibré centré à 1590 nm développé par l'Institut d'Optique Graduate School soit le système laser accordable par OPG qui a été développée au cours de la présente thèse. La deuxième unité contient un module d'optique adaptative qui corrige la qualité du front d'onde du faisceau laser. La troisième unité permet la délivrance du faisceau en 3 dimensions dans le volume de la cornée. Le tout est piloté automatiquement à travers une interface ordinateur basée sur le logiciel LabView développé au cours de la présente thèse. *** Conclusion *** Durant mon doctorat, j'ai développé deux sources nonlinéaires performantes et innovantes basées respectivement sur le principe de l'amplification et de la génération paramétrique optique. Les performances notamment de la deuxième source sont largement supérieures à l'état d'art et nous ont permis d'anticiper un jalon d'un deuxième projet ANR. Elle respecte les contraintes de fiabilité et de compacité nécessaires à un appareil clinique. Cette source est à la base de discussions actuelles sur un projet de valorisation. Ces sources ont permis d'identifier puis de démontrer les avantages d'une chirurgie de la cornée à 1,65 µm. Nous avons mis en place un système démonstrateur basé sur cette longueur d'onde qui incorpore un module de correction du front d'onde et un dispositif d'administration du faisceau. Le groupe OPS est désormais en mesure d'étendre les champs d'investigations en chirurgie femtoseconde, tout d'abord dans la sclère puis plus généralement dans l'ensemble des tissus notamment au travers de nouveaux projets aujourd'hui en préparation tel que la chirurgie de la cataracte ou encore le transfert de gènes.

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au cours des prochaines années, il est prédit que le changement climatique va influencer la production des cultures et impacter négativement le secteur agricole. Parmi les cultures mondiales majeures, la vigne est cultivée pour ses baies, qui sont la base de produits à forte valeur ajoutée (vin, liqueurs, et métabolites secondaires utilisés dans les industries pharmaceutiques et cosmétologiques) et dont le métabolisme est fortement sensible au climat. Cependant, la réponse au niveau de la composition de la baie ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents mettant en évidence la capacité de l’interaction porte-greffe/greffon à influencer le métabolisme de la baie dans des conditions de stress hydrique est encore très peu étudiée et compris. Dans ce contexte, cette thèse a eu pour objectifs de répondre à ces questionnements en combinant des approches ecophysiologique, biochimique et transcriptomique. Vitis vinifera cv. Pinot noir greffé soit sur le porte greffe 110R (tolérance à la sécheresse, vigueur conférée moyenne à forte) ou 125AA (sensible à la sécheresse, forte vigueur conférée) ont été étudié au cours de 3 années (2009, 2010 et 2011), au vignoble et dans des conditions témoin (pluviométrie normale) ou de stress hydrique provoqué. Différents paramètres physiologiques (statut hydrique et rendement) ainsi que le profil métabolique de la baie (sucres, acides organiques, acides aminés et anthocyanes) ont été caractérisés à quatre stades de développement (E-L 33, E-L 35, E-L 36, E-L 38). D’autre part, une analyse microarray sur génome complet a également été réalisée pour deux années (2009 et 2010) et deux stades de développement critiques et représentatifs (E-L 35 et E-L 36). Dans son ensemble, cette thèse fournit des nouveaux éléments concernant la réponse métabolique de la baie au porte-greffe et à la contrainte hydrique, et met en évidence des possibles mécanismes moléculaires impliqués dans cette réponse. / Climate change is expected to influence crop production and to impact negatively the agricultural sector in the future. Among the major crops cultivated worldwide, grapevine provides berries that are the basis of high added value products (wines, liquors, and secondary metabolites used in the pharmaceutical and cosmetological industry) and whose metabolism is strongly sensitive to climate (vintage effect). However, the response of berry composition and the molecular mechanisms underlying the ability of rootstock/scion interaction to influence grape berry metabolism under drought stress are still poorly understood. In this context, this work aimed to fill the gaps on the aforementioned questions by combining comprehensive ecophysiological measurements, detailed metabolite analysis, and whole-genome transcriptome analysis. Vitis vinifera cv. Pinot noir grafted on either rootstock 110R (drought tolerant, mid- to high vigor) or 125AA (drought sensitive, high vigor) were studied during three growing seasons (2009, 2010, and 2011) in the field under normal rainfall or water shortage conditions. We characterized different physiological parameters (water status and yield components) and berry metabolomic profiles (sugars, organic acids, free amino acids and anthocyanins) during four developmental stages (E-L 33, E-L 35, E-L 36, E-L 38). Besides we also performed a microarray analysis in two years (2009 and 2010) at two critical and representative developmental stages (E-L 35 and E-L 36). Overall, this work provides novel insights into the response of grape berry metabolites to rootstock and to drought and uncovers some possible molecular mechanisms underlying the berry response to different rootstock/water status combinations.