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Hämatopoetische Stammzellen besitzen die Fähigkeit, die dauerhafte Erhaltung ihrer eigenen Population im Knochenmark zu gewährleisten und gleichzeitig zur Neubildung der verschiedenen Zelltypen des peripheren Blutes beizutragen. Die Sequenz von Entscheidungsprozessen, die den Übergang einer undifferenzierten Stammzelle in eine funktionale ausgereifte Zelle beschreibt, wird als Linienspezifikation bezeichnet. Obwohl viele Details zu den molekularen Mechanismen dieser Entscheidungsprozesse mittlerweile erforscht sind, bestehen noch immer große Unklarheiten, wie die komplexen phänotypischen Veränderungen hervorgerufen und reguliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wird ein geeignetes mathematisches Modell der Linienspezifikation hämatopoetischer Stammzellen entwickelt, welches dann in ein bestehendes Modell der hämatopoetischen Stammzellorganisation auf Gewebsebene integriert wird. Zur Verifizierung des theoretischen Modells werden Simulationsergebnisse mit verschiedenen experimentellen Daten verglichen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Beschreibung und Analyse der Entwick- lungsprozesse von Einzelzellen, die aus diesem integrierten Modell hervorgehen. Aufbauend auf den entsprechenden Modellsimulationen wird dazu eine topologische Charakterisierung der resultierenden zellulären Genealogien etabliert, welche durch verschiedener Maße für deren Quantifizierung ergänzt wird. Das vorgestellte mathematische Modell stellt eine neuartige Verknüpfung der intrazellulären Linienspezifikation mit der Beschreibung der hämatopoetischen Stammzellorganisation auf Populationsebene her. Dadurch wird das Stammzellm- odell von Röder und Löffler um die wichtige Dimension der Linienspezifikation ergänzt und damit in seinem Anwendungsbereich deutlich ausgedehnt. Durch die Analyse von Einzelzellverläufen trägt das Modell zu einem grundlegenden Verständnis der inhärenten Heterogenität hämatopoetischer Stammzellen bei.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells that continuously regenerate the entire hematopoietic system by producing billions of blood cells. Dormant HSCs (dHSCs) represent a distinct subpopulation of HSCs characterized by deep quiescence and very low overall biosynthetic activity. Despite this, dHSCs have the highest reconstitution and self-renewal potential and reside at the apex of the hematopoietic hierarchy. While dHSCs do not significantly contribute to daily blood cell production under steady-state conditions, they can be reversibly activated in response to inflammatory signals or blood loss. Thus, dHSCs serve as a reserve pool of HSCs during the entire life. Insufficient dormancy can subject dHSCs to replication stress and promote the accumulation of somatic mutations, increasing the risk of their exhaustion or malignant transformation. Conversely, excessive dormancy can limit normal blood cell production, potentially resulting in bone marrow failure. Therefore, further investigations exploring the mechanisms controlling HSC dormancy are required, as this knowledge is essential for developing novel therapeutic interventions for supporting blood production following chemotherapy or HSC transplantation. Progress in dHSC research has been impeded by technical difficulties associated with isolating these cells. Current methods include either label retention assay, which is very time-consuming, or the use specialized reporter mouse strains that are not readily available. Herein, we utilized single-cell RNA sequencing of HSCs to identify potential surface markers which would facilitate the direct isolation of dHSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS). We selected CD38 as a candidate gene and confirmed that its high expression levels in LT-HSCs, the most functional HSCs identified by the latest surface phenotype, correspond to the dormant subpopulation. Namely, we employed four techniques (staining for cell cycle, label incorporation assay, label retention assay, and single-cell division tracking assay) and demonstrated that CD38+ HSCs are the most quiescent among LT-HSCs. Additionally, through serial competitive transplantation into lethally irradiated mice, we compared CD38+ and CD38- LT-HSCs and discovered that CD38+ LT-HSCs have superior repopulation and self-renewal capacities compared to CD38- LT-HSCs. Thus, we concluded that CD38 is a marker for dHSCs in mice. Besides, we applied the models of hematopoietic stress – acute thrombocytopenia, injection of viral mimetic polyinosinic:polycytidylic acid, and the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil, and showed that high expression levels of CD38 on LT-HSCs define dHSCs both in homeostasis and under stress conditions. Notably, we showed that CD38 is not only a marker but also has a functional role in mediating HSC dormancy. Using CD38 knock-out mice, small molecule inhibitor for CD38 enzymatic activity, in vitro assays, bulk RNA sequencing, and confocal microscopy, we discovered a previously unknown signaling axis that promotes HSC dormancy via CD38 enzymatic activity. We demonstrated that second messenger cADPR, synthesized by CD38 through the conversion of nicotinamide adenine dinucleotide - NAD+, elevates free cytoplasmic Ca2+ in dHSCs. This elevation induces the expression of the transcription factor c-Fos. Subsequently, c-Fos forms complexes with the Smad2/3, ultimately promoting dHSC quiescence in p57Kip2-dependent manner. Thus, we revealed that CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2 axis supports dHSCs. Human HSCs (hHSC) are defined as CD38lo/- ; however, CD38 is expressed by various immune cell types present in human bone marrow, such as B-lymphocytes, T-lymphocytes, NK-cells, neutrophils and monocytes. Our co-culture experiments of hHSCs with CD38+ cells and human bone marrow imaging suggest that CD38 promotes hHSC quiescence, however indirectly, in a paracrine manner. Besides, several hematological malignancies (e.g. multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia) express CD38 at a high level. We hypothesize that tumor microenvironment enriched in the products of CD38 ecto-enzymatic activity may suppress the cell cycle of healthy hHSCs leading to cancer-related pancytopenia. Therefore, inhibiting CD38-mediated cADPR production might support healthy hematopoiesis in patients with hematologic malignancies. In summary, while CD38/Ca2+ and c-Fos have individually been implicated in proliferation in other cell types, our study for the first time reveals their role in promoting HSC dormancy in collaboration with well-known mediators of HSC quiescence Smad2/3 and p57Kip2. Therefore, we gathered the pieces of the puzzle together and discovered the novel CD38 enzymatic activity-driven signaling pathway controlling HSC dormancy. Manipulation of this axis can potentially stimulate an efficient dHSC response to hematopoietic stress. / Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind seltene Zellen, die das gesamte blutbildende System kontinuierlich regenerieren, indem sie Milliarden von Blutzellen produzieren. Ruhende HSZ (rHSZ) stellen eine besondere Subpopulation von HSZ dar, die sich durch tiefe Ruhephasen und eine sehr geringe Biosyntheseaktivität auszeichnet. Trotzdem haben rHSZ das höchste Rekonstitutions- und Selbsterneuerungspotenzial und stehen an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie. Während rHSZs unter Normalbedingungen nicht wesentlich zur täglichen Blutzellproduktion beitragen, können sie als Reaktion auf Entzündungssignale oder Blutverlust reversibel aktiviert werden. Somit dienen rHSZ während des gesamten Lebens als HSZ-Reservoir. Eine gestörte Ruhe der rHSZs kann die Zellen einem Replikationsstress aussetzen und die Anhäufung somatischer Mutationen fördern, was das Risiko für Zellerschöpfung oder maligne Transformation erhöht. Umgekehrt kann eine übermäßige Ruhephase die normale Blutzellproduktion einschränken und möglicherweise zu Knochenmarksversagen führen. Daher ist eine weitere Erforschung der Mechanismen erforderlich, die die HSZ-Ruhephase steuern, da dieses Wissen für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Maßnahmen zur Unterstützung der Blutproduktion nach einer Chemotherapie oder HSZ-Transplantation unerlässlich ist. Der Fortschritt in der rHSZ-Forschung wurde durch technische Schwierigkeiten bei der Isolierung dieser Zellen behindert. Zu den derzeitigen Methoden gehören entweder der sehr zeitaufwändige Label-Retentionstest oder die Verwendung spezieller Reportermausstämme, die nicht ohne Weiteres verfügbar sind. In dieser Arbeit haben wir die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von HSZs genutzt, um potenzielle Oberflächenmarker zu identifizieren, die die direkte Isolierung von rHSZs mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) erleichtern würden. Wir wählten CD38 als Kandidatengen aus und überprüften, dass dessen hohe Expression auf den funktionellsten HSZ (LT-HSZ), welche mit dem neuesten Oberflächenphänotyp isoliert wurden, die ruhenden Subpopulation identifizieren kann. Wir haben vier Techniken angewandt (Färbung für den Zellzyklus, Label-Inkorporationstest, Label-Retentionstest und Einzelzellteilungstest) und gezeigt, dass CD38+ HSZ die am tiefsten ruhenden LT-HSZs sind. Darüber hinaus haben wir durch serielle konkurrierende Transplantation in letal bestrahlte Mäuse CD38+ und CD38- LT-HSZs verglichen und festgestellt, dass CD38+ LT-HSZs im Vergleich zu CD38- LT-HSZs eine höhere Wiederbesiedlungs- und Selbsterneuerungskapazität haben. Daraus schlossen wir, dass CD38 ein Marker für rHSZs in Mäusen ist. Außerdem wendeten wir Modelle für hämatopoetischen Stress an - akute Thrombozytopenie, Injektion des viralen Mimetikums Polyinosin:Polycytidylsäure und des Chemotherapeutikums 5-Fluorouracil - und zeigten, dass eine hohe Expressionsrate von CD38 auf LT-HSZs rHSZs sowohl in Homöostase als auch unter Stressbedingungen definiert. Besonders bemerkenswert ist, dass wir zeigen konnten, dass CD38 nicht nur ein Marker ist, sondern auch eine funktionelle Rolle bei der Vermittlung der HSZ-Ruhe spielt. Mithilfe von CD38-Knock-out-Mäusen, kleinen Molekül-Inhibitoren für die CD38-Enzymaktivität, In-vitro-Tests, Massen-RNA-Sequenzierung und konfokaler Mikroskopie entdeckten wir eine bisher unbekannte Signalachse, die die HSZ-Ruhe über die enzymatische Aktivität von CD38 fördert. Wir konnten nachweisen, dass der sekundäre Botenstoff cADPR, der von CD38 durch die Umwandlung von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) synthetisiert wird, das freie zytoplasmatische Ca2+ in rHSZs erhöht. Diese Erhöhung induziert die Expression des Transkriptionsfaktors c-Fos. Anschließend bildet c-Fos Komplexe mit Smad2/3 und fördert schließlich die Ruhe der rHSZ in Abhängigkeit von p57Kip2. Wir konnten also zeigen, dass die CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2-Achse rHSZs unterstützt. Humane HSZ (hHSZ) werden als CD38lo/- definiert; CD38 wird jedoch von verschiedenen Immunzellarten im menschlichen Knochenmark exprimiert, z. B. von B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, NK-Zellen, Neutrophilen und Monozyten. Unsere Co-Kulturexperimente von hHSZs mit CD38+-Zellen und die Bildgebung des menschlichen Knochenmarks deuten darauf hin, dass CD38 die Ruhe von hHSZs fördert, wenn auch indirekt auf parakrine Weise. Außerdem exprimieren mehrere hämatologische Malignome (z. B. multiples Myelom, chronische lymphatische Leukämie, akute myeloische Leukämie) CD38 in hohem Maße. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Mikroumgebung des Tumors, die mit den Produkten der ektoenzymatischen Aktivität von CD38 angereichert ist, den Zellzyklus gesunder hHSZs unterdrücken kann, was zu krebsbedingter Panzytopenie führt. Daher könnte die Hemmung der CD38-vermittelten cADPR-Produktion die gesunde Hämatopoese bei Patienten mit hämatologischen Malignomen unterstützen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD38/Ca2+ und c-Fos zwar bereits einzeln für die Proliferation in anderen Zelltypen verantwortlich gemacht wurden, unsere Studie jedoch zum ersten Mal ihre Rolle bei der Förderung der HSZ-Ruhe in Zusammenarbeit mit den bekannten Mediatoren der HSZ-Ruhe Smad2/3 und p57Kip2 aufzeigt. Wir haben also die Teile des Puzzles zusammengefügt und den neuartigen, von der enzymatischen Aktivität von CD38 gesteuerten Signalweg entdeckt, der die HSZ-Ruhephase kontrolliert. Die Manipulation dieser Achse kann möglicherweise eine effiziente rHSZ-Reaktion auf hämatopoetischen Stress stimulieren.

Das moderne Therapiekonzept der Hochdosischemotherapie von soliden Tumoren und hämatologischen Neoplasien erfordert die prätherapeutische Sammlung, die extrakorporale Reinigung und die nachfolgende Tieftemperaturlagerung von menschlichen Blutstammzellen zur späteren Retransplantation. Stammzellpräparate (Transplantate) von 22 Patienten wurden durch extrakorporale Trennung von peripheren Blut hergestellt. Von jedem Patienten wurde eine Probe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt, bei - 196 oC gelagert und nach ca. 3 Wochen aufgetaut. Eine Vergleichsprobe jedes Patienten wurde ohne den Zusatz von DMSO und ohne einen Einfrierschritt untersucht. Die Exposition von DMSO, das Frieren und Auftauen der Zellen zeigte eine geringfügige des Zell- und Kerndurchmessers, eine konstante Anzahl an Mitochondrien und eine Reduktion der Vesikel. Ein markantes Merkmal der Schädigung nach Tieftemperaturlagerung war das Auftreten von Flüssigkeitseinlagerungen in die Kerndoppelmembran und die Ausbildung von zisternenartigen Erweiterungen des endoplasmatischen Retikulums. Regelmäßig konnten Mitochondrien von verringerter Größe und randständig kondensierter Cristae gefunden werden. Insgesamt konnten keine schwerwiegenden zellulären Schäden beim Vergleich der unbehandelten und der DMSO- versetzten , eingefrorenen und wieder aufgetauten Proben festgestellt werden. Die morphologischen Ergebnisse korrespondieren mit der vollständigen Restitution aller hämatopoetischer Zelllinien nach Transplantation. / The modern therapeutic concept of high-dose chemotherapy of solid tumors and hematologic neoplasias demands a pretherapeutic harvest, an extracorporal purification and an consecutive deep temperature storage of human blood stem cells which will be retransplanted later. Stem cell preparates (transplants) of 22 patients were produced by extracorporal separation of peripheral blood. From each patient a stem cell specimen was mixed with dimethylsulfoxide (DMSO), storaged at - 196 °C and thawed after about 21 days. A corresponding specimen of each patients material was investigated without DMSO addition and without freezing under native conditions. The DMSO exposed, frozed and again defrosted cells showed a mild increase of total cell and nucleus diameters, a constant number of mitochondrias and a reduction of vesicles. A markedly feature of deep temperature damage was the occurance of liquide storages in the nucleus double membrane and the forming of cisterne-like enlargement of the endoplasmatic reticulum. Persistantly we found mitochondrias with reduced size and marginal condensed cristae. Alltogether there were no severe cellular damages in the comparative investigated overlifed specimen cells of the same patient with and without DMSO and deep temperature storage. The morphological results correspond with clinical investigations of a sufficient restitution of all hematopoietic cell lineages in transplanted patients.

Die Gentherapie hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) besitzt das Potenzial, verschiedene erbliche, nur symptomatisch behandelbare, Erkrankungen dauerhaft zu heilen. Die Mehrheit der aktuell angewandten Verfahren dazu, basiert auf der Isolation von hämatopoetischen Stammzellen, der ex vivo Modifikation dieser Zellen durch retrovirale Vektoren und der Reinfusion der modifizierten Zellen in den immunsupprimierten Patienten. Dieser Ansatz ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden, unter anderem einem teilweisen Verlust des Rekonstitutionsvermögens der Stammzellen nach ex vivo Kultur oder der Gefahr der Transformation durch Integration des retroviralen Vektorgenoms. Darüber hinaus sind aktuelle Gentherapieansätze mit hohen Kosten und großem logistischem Aufwand verbunden, was den Zugang zu diesen Behandlungen für potentielle Patienten stark einschränkt. Die vorliegende Arbeit verfolgt einen neuen Ansatz zur Gentherapie von HSCs, der auf der Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark in den peripheren Blutstrom und der Transduktion dieser Stammzellen mit adenoviralen Vektoren basiert. Hierbei codieren die Vektoren sowohl ein Transgen als auch eine Integrationsmaschinerie. Der erste Teil der Arbeit belegt in einem humanen CD46-transgenen Mausmodell, dass adenovirale Vektoren der ersten Generation in der Lage sind, mobilisierte HSCs im Blut zu transduzieren und dass es den so transduzierten Stammzellen möglich ist, zurück ins Knochenmark zu migrieren und dort das Transgen zu exprimieren. Allerdings wurde im Verlauf von zwei Wochen ein Rückgang der Transgenexpression beobachtet. Um dies zu umgehen, wurde ein adenovirales Vektorsystem der dritten Generation genutzt, das eine hochaktive Sleeping Beauty Transposase, zum Zweck der Transgenintegration, codiert. Dieses System ermöglichte die stabile Genmodifikation mobilisierter hämatopoetischer Stammzellen nach intravenöser Injektion. Die Expression des Transgens konnte über längere Zeitspannen (bis 12 Wochen) beobachtet werden. Die modifizeirten Stammzellen waren darüber hinaus in der Lage, genmodifizierte Kolonien in vitro zu bilden und das hämatopoetische System letal bestrahlter Mäuse nach Knochenmarkstransplantation zu rekonstituieren. Es wurde somit gezeigt, dass HSCs nach in vivo Modifikation weiterhin funktional waren. / The gene therapy of hematopoietic stem cells holds the potential for curative treatment of several otherwise incurable inherited diseases. The majority of current gene therapy treatments relies on the collection of hematopoietic stem cells, their ex vivo modification with retroviral vectors and their transplantation into a myeloconditioned patient. This approach entails several disadvantages, including a reduction of stem cell engraftment potential after ex vivo culture and the potential danger of integrational mutagenesis. In addition, the high costs and complex logistics of this approach limit the access of patients to gene therapeutic regimens. This work explores an alternative approach to hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy, termed stem cell in vivo transduction. This approach is based on the mobilization of HSCs from the bone marrow into the peripheral blood and the transduction of the stem cells with adenoviral vectors delivering a transgene as well as a transgene integration machinery. In the first part of this work, it was shown that first-generation adenoviral vectors could be used for the transduction of mobilized HSCs in the periphery of human CD46-transgenic mice. Further, the transduced HSCs were able to home back to the bone marrow and express the transgene. However, over the course of 14 days, a loss of transgene expression in HSCs was observed. To ameliorate these shortcomings, helper-dependent adenoviral vectors encoding a hyperactive Sleeping Beauty transposase for transgene integration were used for stable gene modification of hematopoietic stem cells following intravenous vector administration in mobilized human CD46-transgenic mice. Using this improved vector platform, gene marking of bone marrow HSCs could be observed for extended periods of time (up to 12 weeks). Further, the functionality of the modified HSCs was demonstrated both in colony-forming progenitor assays as well as through the transplantation of gene-modified HSCs into lethally irradiated recipients. Transplantation of modified HSCsled to long-term multi-lineage reconstitution showing that gene-modified stem cells were fully functional. Subsequently the safety of systemic vector administration in mobilized hosts as well as of the Sleeping Beauty-mediated transgene integration was assessed in human CD46- transgenic mice. Lastly, the stem cell in vivo transduction approach was employed in NOG mice transplanted with human CD34+ cells, as well as in Macaca nemestrina non-human primates.

DNS-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, der essentiell für die Differenzierung embryonaler Stammzellen ist, über dessen Funktion in somatischen Zellen allerdings wenig bekannt ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Mausmodelle analysiert, um die Rolle der durch DNS Methyltransferase 1 (DNMT1) hergestellten DNS-Methylierung im adulten hämatopoetischen System zu untersuchen. Als erstes wurde ein „Knockout“-Modell gewählt, um DNMT1 im hämatopoetischen System zu eliminieren. Des Weiteren wurde eine Mausmutante mit reduzierter DNMT1 Expression analysiert. Die vollständige Entfernung von DNMT1 aus dem hämatopoetischen System adulter Mäuse resultierte in Zytopenie und Anämie, gefolgt vom raschen Tod aller Tiere. Die Analyse des Knochenmarks dieser Mäuse zeigte einen fast vollständigen Verlust von hämatopoetischen Stamm- sowie Vorläuferzellen. Dies zeigt, dass die durch DNMT1 erzeugte DNS-Methylierung essentiell für Homöostase und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Mäuse mit reduzierter DNMT1 Expression hingegen sind lebensfähig und zeigen einen niedrigen Grad an DNS-Methylierung in verschiedensten Geweben, einschließlich des hämatopoetischen Systems. Durch eine detaillierte phänotypische und funktionelle Analyse der hämatopoetischen Stammzellen zeigte sich, dass der veränderte DNS-Methylierungsgrad ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial zur Folge hat. Interessanterweise fehlen DNMT1 hypomorphen Mäusen lymphoide Vorläuferzellen sowie reife lymphoide Zellen, wohingegen myeloide und erythroide Zellpopulationen keine Veränderungen zeigten. Genomweite Expressionsanalysen von Stammzellen sowie myeloiden Vorläuferzellen zeigten, dass hypomethylierte Stammzellen eine verfrühte myeloerythroide Entwicklung vollziehen und liefern damit eine Erklärung für den Verlust des Selbsterneurungspotenzials und der lymphoiden Entwicklung. Diese Resultate identifizieren eine bis hierhin unbekannte Funktion von spezifischen DNS-Methylierungsgraden für die Steuerung von funktionellen Programmen wie Selbsterneuerung und Differenzierung in hämatopoetischen Stammzellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic mechanisms which is known to play a role in embryonic stem cell fate, but its function in somatic stem cells is not well understood. In this thesis two different genetic mouse models were chosen to address the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) controlled DNA methylation in adult hematopoiesis. First, a conditional knockout approach was used to delete DNMT1 in the adult hematopoietic system. Second, DNMT1 hypomorphic mice with reduced DNMT1 expression were analyzed. Complete DNMT1 deletion in hematopoietic cells led to severe cytopenia and anemia causing rapid lethality of all animals. Bone marrow analysis revealed an almost complete absence of hematopoietic stem and progenitor cells in DNMT1 ablated primary mice as well as in secondary chimeric mice. These results indicated that DNMT1 controlled maintenance of DNA methylation is indispensable for HSCs preservation and differentiation. In contrast to complete DNMT1 deletion, mice with hypomorphic DNMT1 expression were viable, but showed low methylation levels in multiple tissues including the hematopoietic system. Detailed phenotypical and functional analysis of the hypomethylated hematopoietic stem cell (HSCs) compartment revealed an impaired homeostasis and self-renewal capacity. Intriguingly, mutant animals had profoundly reduced lymphoid cell compartments, whereas myeloid and erythroid compartments were unchanged. Expression profiling of stem and myeloid progenitor cells unexpectedly demonstrated that reduced DNA methylation forces the HSC to adopt a myeloid lineage identity. These results, showing the inability of hypomethylated HSCs to maintain an undifferentiated state, provided an explanation for their disturbed capability to self-renew and produce lymphocytes. Taken together, these findings suggest that distinct levels of DNA methylation are required to control different functional programs such as self-renewal and alternative lineage choices in HSCs, thus uncovering a previously unrecognized function for DNMT1 activity.

Mobilization of peripheral blood stem cells (PBSC) in healthy volunteers with granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is currently carried out at many institutions worldwide. This report presents the experience of the Dresden center regarding donor evaluation and mobilization schedule. Data regarding efficacy, short- and long-term safety of G-CSF treatment gained from 8290 PBSC collections in healthy donors are outlined. These results are discussed against the background of the available evidence from the literature. Although established as a standard procedure, G-CSF application to allogeneic donors will always be a very delicate procedure and requires the utmost commitment of all staff involved to ensure maximum donor safety. (PBSC) donation does not require hospitalization and is generally assumed to be less physically demanding for the donor. However, application of mobilizing agents is stringently required for successful HSC mobilization. The standard substance, which is almost exclusively used in healthy donors worldwide, is recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF). Two preparations – filgrastim and lenograstim – are available and have been approved for PBSC mobilization for about 15 years in Germany. Currently, more than 20,000 healthy donors worldwide receive rhG-CSF for PBSC mobilization every year [7]. At the Dresden University Hospital, PBSC collections have been performed since 1996. In the two collection facilities associated with the university hospital, 8,290 allogeneic PBSC collections from 8,005 donors (i.e. 285 second collections) have been documented in a database up until May 2012. This paper presents the data of our own group, and summarizes the current knowledge regarding the short- and long-term effects of G-CSF treatment in healthy stem cell donors.

Hintergrund: Endothelzellen spielen sowohl in Homöostase als auch in Stresssituationen eine wesentliche Rolle bei der Regulation und der Erhaltung der hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Viele Zytokine und Wachstumsfaktoren werden für die natürliche HSC-Aktivität benötigt und von den Endothelzellen exprimiert. Neben der Unterstützung der hämatopoetischen Stammzellaktivität stellen Endothelzellen ein Gefäßversorgungsnetzwerk zur Verfügung, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Fragestellung: In der hier vorgestellten Arbeit habe ich die Hypothese verfolgt, dass eine Veränderung der Sauerstoffsensorik in Endothelzellen eine Modifizierung der Aktivität hämatopoetischer Stammzellen ermöglicht. Material und Methoden: Trotz des Wissens um die Bedeutung von Sauerstoff für die Endothelzellen fehlt uns das Verständnis dafür, wie die Sauerstoffsensorik der Endothelzellen die lokalen Knochenmark-Nischenzellen und die HSCs reguliert. Um einen Einblick in diesen Mechanismus zu erhalten, haben wir ein Mausmodell mit einem endothelzellenspezifischen Knockout des zentralen Sauerstoffsensors PHD2 entwickelt. Mit diesem in vivo-Ansatz habe ich versucht, den Einfluss von Veränderungen der Hypoxie-Signalwegproteine in Endothelzellen auf HSCs und ihre Nische zu untersuchen. Ergebnisse: Ich konnte in der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Morphologie der sinusförmigen Endothelzellen des Knochenmarks nach Verlust von PHD2 verändert ist. Außerdem konnte ich eine ausgeprägte Gefäßvasodilatation, begleitet von reduzierten hypoxischen Bereichen im angrenzenden Knochenmark beobachten. Zudem stellte ich fest, dass die Inaktivierung von PHD2 in Endothelzellen zu einem Rückgang des Knochenvolumens und zu einer Verminderung der an das Endothel angrenzenden Perizyten führt. Auffallend ist, dass sich gravierende Unterschiede in den hämatopoetischen Zellen der Peripherie zeigten, insbesondere war ein deutlicher Anstieg der zirkulierenden Leukozyten bei den KO-Mäusen zu erkennen. Dieser Phänotyp ist mit einer Vermehrung der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in Knochenmark und Milz verbunden. Darüber hinaus konnte ich zeigen dass die B-Zelldifferenzierung in der Milz vollständig zum Erliegen kommt, was zu einem signifikanten Rückgang der B-Zellen in der Marginalzone führt. Um die Funktionalität von Endothelzellen mit deletiertem PHD2 zu beurteilen, habe ich die Mäuse mit einer nicht-tödlichen Dosis ionisierender Strahlung behandelt. Die Analyse der endothelialen Zellregeneration im KO-Knochenmark zeigte eine Verminderung der Gefäßneubildung ohne Einfluss auf das gesamte Gefäßlumen im Vergleich zu unbehandelten Wurfgeschwistern. Außerdem stellte ich fest, dass sich in den ersten 3 Wochen nach der Bestrahlung bei Mäusen mit fehlendem PHD2 auf der Endothelzellenoberfläche das RBC-Kompartiments schneller regeneriert. Ich konnte ausschließen, dass dieser Effekt auf eine erhöhte Produktion von RBCs zurückzuführen ist, was zu der Hypothese führte, dass eine Verminderung des endothelialen PHD2 entweder zu einem längerfristigen Überleben der RBCs oder zu einer beeinträchtigten RBC-Clearance führt. Zusätzlich habe ich einen Anstieg in der Anzahl der quieszenten hämatopoetischen Vorläuferzellen bei Mäusen mit endothelialer PHD2-Deletion beobachtet, was darauf hindeutet, dass das endotheliale PHD2 Downstream-Signaling den Zellzyklus von hämatopoetischen Vorläuferzellen bei myeloablativen Stress beeinflusst. Abschließend konnte ich zeigen, dass ein Großteil der beobachteten Phänotypen bei KO-Mäusen durch den nachgeschalteten Transkriptionsfaktor HIF-2α vermittelt wird. Die Verwendung meiner selbstgenerierten Doppel-Knockout-Mauslinie, bei der erstmalig gleichzeitig PHD2 und HIF-2 in den Endothelzellen deletiert sind, führte zu eine vollständige Umkehrung des hämatopoetischen Phänotyps der bei den PHD2-Knockout-Mäusen im Steady-State beobachtet wurde. Zusätzlich wird der zuvor beobachtete signifikante Anstieg der Lymphozyten und der Rückgang der Erythrozyten- und Thrombozytenzahl in den Doppel-Knockout-Mäusen genetisch wiederhergestellt. Gleichzeitig reduziert sich die Entwicklung der marginalen B-Zellen im stationären Zustand wieder auf das Wildtyp-Niveau. Des Weiteren habe ich nach der Bestrahlung von Mäusen mit ionisierender Strahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen WT und KO in ihrer hämatopoetischen Zellregeneration mehr feststellen können. Schlussfolgerungen: Zusammengenommen konnte ich in meiner Dissertation neue Eigenschaften von Hypoxie-Pathway-Proteinen in Endothelzellen mit Einfluss auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen sowie auf verschiedene Kompartimente ihrer Nische demonstrieren; sowohl im stationären Zustand als auch nach Belastung durch Bestrahlung. Abschließend unterstreicht meine Arbeit die entscheidende Bedeutung der Sauerstoffsensorik im Knochenmark und gibt neue Einblicke in das Zusammenspiel zwischen dem Knochenmark-Endothel und dem hämatopoetischen System.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations / Background: Endothelial cells have an essential role in hematopoietic stem cell (HSC) regulation and maintenance during homeostasis and stress. Many cytokines and growth factors are required for normal HSC activity and are expressed by the endothelial cells. Along the support of hematopoietic stem cell activity, endothelial cells provide vessel delivery network to ensure proper oxygen delivery. Despite the importance of oxygen on endothelial cells, we lack the understanding of how oxygen sensing in endothelial cells regulates the local bone marrow niche cells and HSCs. Hypothesis: I have hypothesized that by modulating oxygen sensor in endothelial cells I will be able to modify the activity of hematopoietic stem cells Material and methods: To gain insight into this system, we developed a mouse model with an endothelial cell-specific knockout of the central oxygen sensor PHD2. Using this in vivo approach I sought to determine the impact of changes in hypoxia pathway proteins in endothelial cells on HSCs and their niche. Results: First, I revealed that the morphology of bone marrow sinusoidal endothelial cells is altered upon loss of PHD2. I observed prominent vessel vasodilation accompanied by reduced hypoxic areas in their adjacent marrow. Moreover, I determined that inactivation of PHD2 in endothelial cells led to a decrease in bone volume and pericytes adjacent to endothelium. Remarkably, I observed profound differences in the hematopoietic cells of the periphery. Specifically, I observed a profound increase in circulating leukocytes of KO mice. This phenotype was related to an increase in hematopoietic stem and progenitor cells in bone marrow and spleen. Moreover, I found a complete impairment of B cell differentiation in the spleen, which consequently led to a profound decrease in marginal zone B cells. To assess the functionality of endothelial cells lacking PHD2, I subjected the mice to a non-lethal dose of ionizing radiation. Analysis of endothelial cell recovery in KO bone marrow revealed a decrease in the formation of new vessels without an impact on the overall vascular lumen compared to WT littermates. Similarly, I found an enhanced recovery of the RBC compartment during the first 3 weeks after irradiation in mice lacking PHD2 on endothelial cells. I excluded the possibility that this effect was due to an increased RBC production, which led to hypothesis that inhibition of endothelial PHD2 results in prolonged RBC survival or impaired RBC clearance. Additionally, I observed an increase in quiescent hematopoietic progenitors cells in mice lacking PHD2 in endothelial cells that implies that endothelial PHD2 downstream signaling impact cycling of hematopoietic progenitors upon myeloablative stress. Finally, I demonstrated that a majority of the observed phenotypes in KO mice are mediated by the downstream HIF-2α transcription factor. Using my unique self-made double knockout mouse line simultaneously lacking PHD2 and HIF-2 in their endothelial cells, I was able to reveal a reversal of the hematopoietic phenotypes observed in the single PHD2 knockout mice during steady state. Additionally, the previously observed significant increase in lymphocyte and decrease in erythrocyte and thrombocyte numbers was genetically rescued in double knockout mice. Similarly, marginal zone B cell development returned to wild-type levels during steady state. Moreover, after subjecting mice to ionizing radiation I did not observe any significant differences between WT and KO in their hematopoietic cell recovery. Conclusions: Taken together, during my thesis I was able to demonstrate novel properties of hypoxia pathway proteins in endothelial cells having an impact on hematopoietic stem and progenitor cells as well as different compartments of their niche; both during steady state and radiation stress. In conclusion, my work underscores the critical importance of oxygen sensor signaling in the bone/bone marrow and provides new insight into the interplay between the bone marrow endothelium and the hematopoietic system.:1 Introduction 1.1 Oxygen is necessary for survival of multicellular organisms 1.2 Oxygen sensing is necessary for induction of rapid cellular response 1.3 Endothelial and hematopoietic tissues together deliver oxygen 1.4 Hematopoietic stem cells give rise to blood cells 1.5 Regulation of HSCs is dependent on cells of the hematopoietic niche 1.6 Types of HSC regulation 1.7 Cancer therapy affects all highly proliferating cells 1.8 Irradiation stress disrupts hematopoietic stem cell niche signaling 1.9 Hypoxia induced signaling during recovery after irradiation 2 Aims of the thesis Aim 1: Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche. 3 Materials and methods 3.1 Mice. 3.2 Histology, immunohistochemistry and immunofluorescence staining 3.2.1 Tissue processing prior to staining: 3.2.2 Staining: 3.3 Endothelial cell sorting 3.4 Mature hematopoietic cell isolation 3.5 Expression analysis 3.6 Hypoxyprobe 3.7 Quantitative image analysis 3.8 Bone structure analysis 3.9 Blood analysis 3.10 FACS analysis 3.11 Cell cycle analysis 3.12 RBC transfusion 3.13 Statistics. 4 Results 4.1 Determination of the role of endothelial PHD2 on the signaling towards the hematopoietic stem cells and its niche 4.1.1 Validation of the Flk1:cre line endothelial cell targeting 4.1.2 Characterization of the endothelial cell morphology and vessel function upon PHD2 inactivation 4.1.3 Loss of endothelial PHD2 leads to a decrease in bone marrow niche 4.1.4 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to alterations of hematopoietic cells in the periphery 4.1.5 Significant increase of white blood cells in the periphery upon loss of endothelial PHD2 4.1.6 Loss of endothelial PHD2 does not impact the hematopoietic stem cells in the bone marrow. 4.1.7 Loss of PHD2 leads to increase in hematopoietic stem cells in the spleen 4.1.8 Loss of endothelial PHD2 impacts lineage-committed progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.9 Loss of PHD2 in endothelial cells leads to an increase in frequency and activity of myeloid progenitors in bone marrow and the spleen 4.1.10 Loss of endothelial PHD2 impacts lymphocyte progenitors in secondary lymphatic organs but not in the bone marrow 4.2 Defining the impact of radiation exposure on the recovery of PHD2-deficient endothelial cells and its hematopoietic compartment. 4.2.1 Characterization of the non-lethal ionizing radiation damage to bone marrow endothelial and hematopoietic recovery 4.2.2 Loss of PHD2 from endothelium impacts endothelial recovery after myeloablative assault 4.2.3 Loss of PHD2 in endothelial cells and its subsequent effect on hematopoietic recovery following ionizing radiation exposure 4.2.4 Mechanism of increased RBC numbers is not due to an increase in hematopoietic stem cell frequency or activity in bone marrow or the spleen, 2 weeks after irradiation 4.3 Characterization of the influence of the transcription factor HIF-2α in mice lacking EC PHD2 4.3.1 The molecular signal transduction upon PHD2 inactivation is mediated by the HIF-2 transcription factor. 4.3.2 Loss of PHD2 and HIF-2α from endothelial cells partially rescues alterations in bone marrow endothelial cell morphology 4.3.3 Simultaneous loss of PHD2 and HIF-2α in endothelial cells completely reverses the hematopoietic phenotype observed in KO mice. 4.3.4 HIF-2α transcription factor induce signaling on endothelial cells that leads to marginal zone B cell impairment 4.3.5 Loss of PHD2 and subsequent stabilization of the HIF-2αtranscription factor is responsible for the increased recovery of RBCs following ionizing radiation 5 Discussion 6 References 7 List of abbreviations 8 Abstract 9 Zussamenfassung 10 Acknowledgements 11 Deklarations

Prominin-1 (alias CD133) has received considerable interest because of its expression by several stem and progenitor cells originating from various sources, including the neural and hematopoietic systems. As a cell surface marker, prominin-1 is now used for somatic stem cell isolation. Its expression in cancer stem cells has broadened its clinical value, as it might be useful to outline new prospects for more effective cancer therapies by targeting tumor-initiating cells. Cell biological studies of this molecule have demonstrated that it is specifically concentrated in various membrane structures that protrude from the planar areas of the plasmalemma. Prominin-1 binds to the plasma membrane cholesterol and is associated with a particular membrane microdomain in a cholesterol-dependent manner. Although its physiological function is not yet determined, it is becoming clear that this cell surface protein, as a unique marker of both plasma membrane protrusions and membrane microdomains, might reveal new aspects of the cell biology of rare stem and cancer stem cells. The aim of this review is to outline the recent discoveries regarding the dynamic reorganization of the plasma membrane of rare CD133+ hematopoietic progenitor cells during cell migration and division. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Background The role of allogeneic hematopoietic cell transplantation (alloHCT) in acute myeloid leukemia (AML) with mutated IDH1/2 has not been defined. Therefore, we analyzed a large cohort of 3234 AML patients in first complete remission (CR1) undergoing alloHCT or conventional chemo-consolidation and investigated outcome in respect to IDH1/2 mutational subgroups (IDH1 R132C, R132H and IDH2 R140Q, R172K). Methods Genomic DNA was extracted from bone marrow or peripheral blood samples at diagnosis and analyzed for IDH mutations with denaturing high-performance liquid chromatography, Sanger sequencing and targeted myeloid panel next-generation sequencing, respectively. Statistical as-treated analyses were performed using R and standard statistical methods (Kruskal–Wallis test for continuous variables, Chi-square test for categorical variables, Cox regression for univariate and multivariable models), incorporating alloHCT as a time-dependent covariate. Results Among 3234 patients achieving CR1, 7.8% harbored IDH1 mutations (36% R132C and 47% R132H) and 10.9% carried IDH2 mutations (77% R140Q and 19% R172K). 852 patients underwent alloHCT in CR1. Within the alloHCT group, 6.2% had an IDH1 mutation (43.4% R132C and 41.4% R132H) and 10% were characterized by an IDH2 mutation (71.8% R140Q and 24.7% R172K). Variants IDH1 R132C and IDH2 R172K showed a significant benefit from alloHCT for OS (p = .017 and p = .049) and RFS (HR = 0.42, p = .048 and p = .009) compared with chemotherapy only. AlloHCT in IDH2 R140Q mutated AML resulted in longer RFS (HR = 0.4, p = .002). Conclusion In this large as-treated analysis, we showed that alloHCT is able to overcome the negative prognostic impact of certain IDH mutational subclasses in first-line consolidation treatment and could pending prognostic validation, provide prognostic value for AML risk stratification and therapeutic decision making.