Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Ulm, Univ., Diss., 2002.

Kohlenmonoxid (CO) wird nach Einatmung weitgehend an Hämoglobin gebunden, eine minimale Bindung findet auch an Myoglobin statt. Die Kohlenmonoxid-Hämoglobinkonzentration (COHb) im Blut steigt nach Inhalation proportional zur inhalierten CO-Menge und zur Hämoglobinmasse an. Dieser Anstieg wird über die CO-Hämoxymetrie ermittelt und resultierend aus der CO-Verdünnung die Hämoglobinmenge berechnet. Über die Hämoglobinkonzentration und den Hämatokrit kann im Anschluss das Blutvolumen berechnet werden. Grundsätzlich ist dieses Verfahren seit über 100 Jahren bekannt und wird seit ca. 1995 als Routinemethode zur Blutvolumenbestimmung in der Sportmedizin verwendet. Es existieren darüber hinaus methodische Probleme durch die CO-Abatmung und die Evaluierung in großen Kollektiven. Die hier vorgestellte Methodik beinhaltet die Weiterentwicklung der CO-Methode zur Direktmessung im geschlossenen System. Die Probanden atmen dabei ein exakt definiertes Bolus-Volumen in einem geschlossenen Atmungssystem über 15 Minuten ein. Die maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK: COHb 5%), also die resultierende COHb-Konzentration im Blut bei einer CO-Langzeitexposition von 35 ppm, wird in der Regel nur leicht überschritten. Dazu wurden an 104 Probanden zwei Vergleichsmessungen in definiertem Abstand und an 20 Probanden Wiederholungsmessungen nach Blutspende zum Nachweis der Reliabilität und Validität durchgeführt. Zusätzlich ist die Abfallkinetik von COHb an 20 Probanden bestimmt worden. Im Ergebnis stellt sich methodenbedingt ein COHb-Steady-State nach 9 Minuten Rückatmung im geschlossenen System ein. Der Typical-Error der Messwiederholung der Methodik liegt bei 1,9% bzw. nach weiterer Modifizierung der Methodik bei 1,3%. Der Nachweis eines Blutverlustes von 490 ml im Rahmen einer Blutspende zeigt nur eine minimale Abweichung von 10 g Hämoglobinmasse zwischen gemessenem und kalkuliertem Verlust. Die Halbwertszeit von COHb wurde mit 135 min bestimmt. Die verwendete Methodik zeigt aufgrund der induzierten COHb-Steady-State-Kinetik Vorteile bei der Anwendung und Genauigkeit. Der Nachweis der Wiederholbarkeit und Messgenauigkeit konnte an einem hinreichend großen Kollektiv gezeigt werden. Bei Mehrfachanwendung bietet die Sensitivität der Methodik die Möglichkeit der Aufdeckung von Manipulationen des Blutes über Erythropoetin (EPO) oder Eigenbluttransfusion. Dabei bewegt sich die eingesetzte CO-Belastung während der Methode im Bereich des Konsums von wenigen Zigaretten.

Der RAF-MEK-ERK-Signalweg steuert grundlegende, oftmals entgegengesetzte zelluläre Prozesse wie die Proliferation und Apoptose von Zellen. Die Dauer des vermittelten Signals wurde als entscheidener Faktor für die Steuerung dieser Prozesse identifiziert. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt, wie die verschiedenen früh und spät reagierenden Genexpressionsmodule kurze und lange Signale unterscheiden können und durch welche kinetischen Merkmale ihre Antwortzeit bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Proteinphosphorylierungsdaten als auch Genexpressionsdaten aus HEK293-Zellen gewonnen, die ein induzierbares Konstrukt des Proto-Onkogens RAF tragen. Hierbei wurde ein neues Genexpressionsmodul identifiziert, dass sich aus sofort induzierten aber spät antwortenden Genen zusammensetzt. Es unterscheidet sich in der Genexpressionsdynamik und Genfunktion von anderen Modulen, und wurde mit Hilfe mathematischer Modellierung experimenteller Daten identifiziert. Es wurde festgestellt, dass diese Gene aufgrund von langen Halbwertszeiten der vermitteltenden mRNA in der Lage sind spät auf das eingehende Signal zu reagieren und die Dauer des Signals in die Amplitude der Genantwort zu übersetzen. Trotz der langsamen Akkumulation und damit späten Antwortzeit, konnte aufgrund einer GC-reichen Promoterstruktur zunächst vermutet und mit Hilfe eines Markerverfahrens bestätigt werden, dass die Transkription dieser Gene instantan mit Beginn der ERK-Aktivierung startet. Eine vergleichende Analyse zeigte, dass das Prinzip der Signaldauer-Entschlüsselung in PC12-Zellen und MCF7-Zellen, zwei paradigmatischen Zellsystemen für die ERK-Signaldauer, konserviert ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse der Untersuchung darauf hin, dass das neu identifizierte Genexpressionsmodul der Entschlüsselung der ERK-Signaldauer dient und das mRNA Halbwertszeiten sowohl hierfür, als auch für die zeitliche Abfolge der Genantwort eine entscheidende Rolle spielen. / The RAF-MEK-ERK signalling pathway controls fundamental, often opposing cellular processes such as proliferation and apoptosis. Signal duration has been identified to play a decisive role in these cell fate decisions. However, it remains unclear how the different early and late responding gene expression modules can discriminate short and long signals and what features govern their timing. Both protein phosphorylation and gene expression time course data was obtained from HEK293 cells carrying an inducible construct of the proto-oncogene RAF. A new gene expression module of immediate-late genes (ILGs) distinct in gene expression dynamics and function was identified by mathematical modelling. It was found that mRNA longevity enables these ILGs to respond late and thus translate ERK signal duration into response amplitude. Despite their late response, their GC-rich promoter structure suggested and metabolic labelling with 4SU confirmed that transcription of ILGs is induced immediately. A comparative analysis showed that the principle of duration decoding is conserved in PC12 cells and MCF7 cells, two paradigm cell systems for ERK signal duration. Altogether, the findings of this study indicate that ILGs decode ERK signal duration and that both decoding capacity and gene expression timing are governed by mRNA half-life.

Kohlenmonoxid (CO) wird nach Einatmung weitgehend an Hämoglobin gebunden, eine minimale Bindung findet auch an Myoglobin statt. Die Kohlenmonoxid-Hämoglobinkonzentration (COHb) im Blut steigt nach Inhalation proportional zur inhalierten CO-Menge und zur Hämoglobinmasse an. Dieser Anstieg wird über die CO-Hämoxymetrie ermittelt und resultierend aus der CO-Verdünnung die Hämoglobinmenge berechnet. Über die Hämoglobinkonzentration und den Hämatokrit kann im Anschluss das Blutvolumen berechnet werden. Grundsätzlich ist dieses Verfahren seit über 100 Jahren bekannt und wird seit ca. 1995 als Routinemethode zur Blutvolumenbestimmung in der Sportmedizin verwendet. Es existieren darüber hinaus methodische Probleme durch die CO-Abatmung und die Evaluierung in großen Kollektiven. Die hier vorgestellte Methodik beinhaltet die Weiterentwicklung der CO-Methode zur Direktmessung im geschlossenen System. Die Probanden atmen dabei ein exakt definiertes Bolus-Volumen in einem geschlossenen Atmungssystem über 15 Minuten ein. Die maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK: COHb 5%), also die resultierende COHb-Konzentration im Blut bei einer CO-Langzeitexposition von 35 ppm, wird in der Regel nur leicht überschritten. Dazu wurden an 104 Probanden zwei Vergleichsmessungen in definiertem Abstand und an 20 Probanden Wiederholungsmessungen nach Blutspende zum Nachweis der Reliabilität und Validität durchgeführt. Zusätzlich ist die Abfallkinetik von COHb an 20 Probanden bestimmt worden. Im Ergebnis stellt sich methodenbedingt ein COHb-Steady-State nach 9 Minuten Rückatmung im geschlossenen System ein. Der Typical-Error der Messwiederholung der Methodik liegt bei 1,9% bzw. nach weiterer Modifizierung der Methodik bei 1,3%. Der Nachweis eines Blutverlustes von 490 ml im Rahmen einer Blutspende zeigt nur eine minimale Abweichung von 10 g Hämoglobinmasse zwischen gemessenem und kalkuliertem Verlust. Die Halbwertszeit von COHb wurde mit 135 min bestimmt. Die verwendete Methodik zeigt aufgrund der induzierten COHb-Steady-State-Kinetik Vorteile bei der Anwendung und Genauigkeit. Der Nachweis der Wiederholbarkeit und Messgenauigkeit konnte an einem hinreichend großen Kollektiv gezeigt werden. Bei Mehrfachanwendung bietet die Sensitivität der Methodik die Möglichkeit der Aufdeckung von Manipulationen des Blutes über Erythropoetin (EPO) oder Eigenbluttransfusion. Dabei bewegt sich die eingesetzte CO-Belastung während der Methode im Bereich des Konsums von wenigen Zigaretten.

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Das Proteasom spielt eine zentrale Rolle beim Proteinabbau und der Antigen-Generierung für die adaptive Immunantwort. Vertebraten exprimieren zwei Typen des proteolytischen 20S-Kernkomplexes: das konstitutive c20S (mit den aktiven Untereinheiten beta 1, 2, 5) und das Immunoproteasom i20S (mit den Immunountereinheiten LMP2, MECL-1, LMP7). Die i20S-Expression wird durch Interferon_gamma (IFNg) induziert, was die Antigen-Präsentation auf MHC Klasse I und die Immunantwort gegen infizierte bzw. maligne entartete Zellen durch cytotoxische T-Zellen steigert. Proteasomen werden über komplexe, bisher unvollständig verstandene Biogenese-Prozesse formiert. Die initialen Schritte der humanen 20S-Formation wurden in dieser Arbeit untersucht und eine Methode zur Isolation früher Assemblierungsintermediate (EPIs) etabliert. Die 20S-Biogenese bedarf der Assistenz von Hilfsfaktoren wie dem Proteasom-Maturierungsprotein POMP. Diese Komponente von Precursorkomplexen stellt das erste Substrat gereifter c20S dar. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass POMP ebenfalls die i20S-Formation vermittelt und sich die Biogenese von c20S und i20S hinsichtlich der Maturierungskinetik unterscheidet. POMP wird durch IFNg induziert und interagiert mit der Immunountereinheit LMP7. Dieses molekulare Zusammenspiel bewirkt eine schnellere Maturierung von i20S- im Vergleich zu c20S- Precursorkomplexen, wodurch POMP einem schnelleren Abbau unterliegt. Die forcierte i20S-Biogenese ist eine intrinsische Eigenschaft und unabhängig von weiteren, IFNg-induzierten Faktoren. Nur die LMP7_E2-Variante vermittelt die schnelle Degradation von POMP, während das nicht funktionelle LMP7_E1 mit einer anderen Prosequenz nicht in i20S-Vorläufer inkorporiert wird. Somit führt die alleinige LMP7_E1-Expression in IFNg-stimulierten Carcinom-Zellen zu einer i20S-Defizienz, was eine mögliche Immunevasions-Strategie darstellt. Weiterhin besitzen beide 20S-Typen unterschiedliche Halbwertszeiten: i20S sind, unabhängig von weiteren IFNg-induzierten Proteinen, signifikant instabiler als c20S. Somit werden i20S sowohl schneller formiert als auch zügiger wieder abgebaut als c20S, womit sie typische Eigenschaften cytokin-regulierter Proteine aufweisen. Die i20S-Formation ist also eine transiente Antwort und stellt ein effizientes Instrument zur schnellen Reaktion auf immunologische Herausforderungen wie z.B. eine Infektion dar. Nach einer wirksamen Immunantwort erlaubt die geringere i20S-Stabilität eine schnelle Rückkehr zur standardmäßigen c20S-Expression. / The proteasome plays a crucial role in protein degradation and antigen generation for the adaptive immune response. Vertebrates express two types of the proteolytic 20S core complex: the constitutive proteasome c20S (with the active subunits beta 1, 2 and 5) and the immunoproteasome i20S (with the immunosubunits LMP2, MECL-1 and LMP7). Interferon_gamma (IFNg) induces the i20S expression, that supports a more efficient MHC class I antigen presentation and an effective immune response against infected or malignant cells by cytotoxic T-cells. Proteasomes are formed by a complex and not well understood biogenesis program. The initial steps in the human 20S formation have been analyzed in this thesis and a method for the isolation of ´early proteasome assembly intermediates´ (EPIs) has been established. The 20S biogenesis requires the assistance of accessory factors like the proteasome maturation protein POMP. This component of precursor complexes becomes the first substrate of the matured c20S. The described experiments demonstrate for the first time that POMP mediates the i20S formation and that biogenesis of c20S and i20S differ in their maturation kinetics. POMP is induced by IFNg and interacts with the immunosubunit LMP7. This molecular interplay provokes a faster maturation of i20S compared to c20S precursor complexes, whereby POMP becomes subject to a faster degradation. The accelerated i20S biogenesis is an intrinsic characteristic and independent of additional IFNg-induced factors. Exclusively the LMP7_E2 variant causes the rapid degradation of POMP, whereas the non-functional LMP7_E1 bearing another prosequence is not incorporated into i20S precursor complexes. Thus, LMP7_E1 expression in IFNg-stimulated carcinoma cells leads to a i20S deficiency pointing out a possible immune evasion strategy. In addition, both 20S types display different half-life values: i20S are, independent of other IFNg-induced proteins, significantly less stable than c20S. Thus, i20S are not only faster assembled, but also more quickly decomposed compared to c20S, showing typical attributes of proteins regulated by cytokines. Consequently, i20S formation is a transient response and represents an efficient instrument for a rapid adjustment to varying immunological challenges like an infection. Once the immune response has been effective, the lower stability of i20S permits an expeditious return to the standard c20S expression.