Universiẗat, Diss., 2003--Bremen.

Bien que les travaux portant sur la biodégradation des hydrocarbures soient bien documentés, très peu d’études ont toutefois été effectuées dans les milieux de vie extrême. A ce jour, la plupart des études portant sur le devenir des hydrocarbures et le rôle joué par les micro-organismes hydrocarbonoclastes dans leur biodégradation ont été conduites dans des milieux presentant principalement des conditions physico-chimiques standards (e.g. pression hydrostatique de 0,1 MPa, salinité comprise entre 0 et 39 g L-1). Or, une partie importante des hydrocarbures déversés dans l’environnement peut aussi contaminer les milieux océaniques profonds (pression hydrostatique supérieure à 10 MPa) ainsi que les milieux hypersalés côtiers (salinité supérieure à 150 g L-1). Par ailleurs, le traitement des rejets hypersalins contaminés par les hydrocarbures qui sont générés par les exploitations pétrolières posent des problèmes sérieux et couteux. Ce travail de recherche porte sur l’étude de l’activité hydrocarbonoclaste de procaryotes présents dans des milieux extrêmes (hyperbares et hypersalés) pour d’une part, comprendre les processus naturels de biodégradation dans ces écosystèmes et d’autre part permettre le développement futur de techniques de réhabilitation spécifiques. Dans ce but, des expérimentations en laboratoire ont été réalisées. Une mise au point de méthodes d’incubation sous pression hydrostatique nous a permis d’obtenir des informations métaboliques et physiologiques importantes sur une souche bactérienne piézotolérante hydrocarbonoclaste (Marinobacter hydrocarbonoclasticus #5) lorsqu’elle se développe sous pression hydrostatique (35 MPa) sur hexadécane comme seule source de carbone et d’énergie. Cela confirme la capacité de certaines bactéries à dégrader les hydrocarbures en conditions hyperbares. Les résultats obtenus soulignent par ailleurs l’importance de la synthèse de cires dans le fonctionnement énergétique des souches hydrocarbonoclastes et soulèvent de nombreuses questions quant à l’augmentation du degré d’insaturation des acides gras cellulaires à pression hydrostatique élevée. D’une manière intéressante, nos résultats montrent aussi que les micro-organismes qui jouent potentiellement un rôle important dans la biodégradation des hydrocarbures dans les milieux océaniques profonds méditerranéens appartiennent aux mêmes genres que ceux isolés des milieux côtiers, notamment Alcanivorax. Notons également que dans les conditions de culture utilisées certaines souches isolées dégradent préférentiellement le n-hexadecane (e.g. Alcanivorax venustensis, Rhodobacter) ou l’heptadecane (e.g. Marinobacter sp.). De même, les archées halophiles extrêmes hydorcarbonoclastes que nous avons isolées appartiennent aux deux genres ubiquistes des environnements hypersalés que sont Haloarcula et Haloferax. En fonction des souches, les archées halophiles isolées montrent un taux important de dégradation de 32 à 95% (0.5 g L-1) du n-heptadécane après 30 jours d’incubation à 40°C dans les milieux sursalés synthétiques (225 g L-1 NaCl). Certaines souches comme Haloferax sp. MSNC 14 sont capables de dégrader à la fois des n-alcanes et un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP), le phénanthrène. Les résultats obtenus au cours de ce travail de thèse constituent une contribution à l’amélioration de nos connaissances sur le devenir des hydrocarbures dans les milieux océaniques profonds et les milieux hypersalins, jusqu’alors peu étudiés. Au regard de ces résultats, il apparaît indispensable de poursuivre l’étude des milieux extrêmes et de la biodiversité microbienne unique qu’ils abritent. Mots clés : hydrocarbures, biodégradation, souches hydrocarbonoclastes, milieux extrêmes, pression hydrostatique, salinité. / Limited information is available on the ability of prokaryotes living in the extreme environments to degrade hydrocarbon. To date, most studies on hydrocarbon biodegradation were conducted on microorganisms isolated from environments with so-called “standards” physicochemical properties (e.g. hydrostatic pressure 0,1 MPa and salinity between 0 and 39 g L-1), despite the evident occurrence of hydrocarbons in extreme environments. An important part of hydrocarbon spilled in the environment could contaminate the deep-sea (hydrostatic pressure higher than 10 MPa) as well as hypersalin (salinity higher than 300 g L-1) coastal areas. Moreover, hydorcarbon-contaminated hypersaline waste water produced during oil exploitation require the improvement of the remediation treatments. The present work deals with the hydrocarbon-degrading activity of prokaryotes living in these extreme environments. In order to deepen our knowledge on the hydrocarbon-degrading microorganisms potential role and also to contribute to the development of specific rehabilitation techniques in these type of environments, various experiments were carried out. A bacterial cultivation method under hydrostatic pressure was developped, through which we obtained important metabolical and physiological informations on a hydrocarbon-degrading piezotolerant bacterium (Marinobacter hydrocarbonoclasticus #5) grown using hexadecane as sole source of carbon and energy. Results confirm the capacity of certain bacteria to degrade the hydrocarbon under hyperbaric (35 MPa) conditions. They also highlight the importance of wax production in energetical functionning and raise numerous questions regarding the increase, under elevated hydrostatic pressure, of unsaturated fatty-acid degree that constitute the wax. Interestingly, our results indicated that the same groups of bacteria, in particular those belong to Alcanivorax, were potentially involved in hydrocarbon biodegradation in deep-sea environments as in coastal waters. Moreover, with the cultivation condition used, isolated strains preferred to degrade either n-hexadecane (e.g. Alcanivorax venustensis, Rhodobacter) or n-heptadecane (e.g. Marinobacter sp.). Similar result was obtained from experiments carried out with archaea isolated from a shallow crystallizer pond sample, in that these microorganisms belong to two ubiquistes genus (Haloarcula and Haloferax) in hypersalin environments. Depending on the strain, extremely halophilic archaea isolated degraded 32 to 95% (0.5 g L-1) of n-heptadecane after 30 days of incubation at 40°C in 225 g L-1 NaCl artificial medium. One of the strains (MSNC 14) was also able to degrade phenanthrene. This study provides useful informations on hydrocarbon biodegradation by microorganisms in deep-sea and hypersalin environments, which remains yet to be fully explored. Further studies seems thus indispensable to elucidate the physico-chemical and biological properties involved in these processes, as well as works on the particular microbial biodiversity living in this type of environment. Keywords: alkanes, biodegradation, hydrocarbon-degrading strains, extreme environments, hydrostatic pressure, salinity

The study of organisms from extreme environments is an emerging field of research with applications to multiple scientific areas. One of these extreme environments is Great Salt Lake (GSL), whose microbiology has yet to be extensively studied. This dynamic and unique environment offers an excellent opportunity to increase understanding of hypersaline ecology. Cultivation of microorganisms remains an important part of ecology research, as it is essential for understanding microbial physiology. We report here the culturing and characterization of isolates from Rozel Point, located on the northeastern shore of Great Salt Lake. This site was chosen because of the presence of petroleum seeps at Rozel Point and the extreme salinity of the North Arm of GSL. We hypothesize that culturing at GSL will reveal a diverse prokaryotic population, with both commonly isolated and novel organisms. We would predict that prokaryotes at GSL will share many features in common with other hypersaline microbial communities, but that given the distinctive properties of the site, there will be unique characteristics as well. Samples were taken from Rozel Point and cultured using direct plating, enrichment cultures, and dilution cultures with a variety of minimal and complex halophilic media. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to examine abundance of cultured organisms in the environment. Culturing and characterization has revealed both isolates novel and previously uncultured, with many unique characteristics. FISH demonstrated that, unlike most environments, in GSL the dominant species are culturable. These results show the value of culturing in discovering new organisms and demonstrating diversity at the microbial level. Culturing of these organisms will allow for further research to be done on microbial processes that occur in this system and the unique properties of halophilic microbes.

No / This study is primarily focused on proving the potential of miniaturized Raman systems to detect any biomolecular and mineral signal in natural geobiological samples that are relevant for future application of the technique within astrobiologically aimed missions on Mars. A series of evaporites of varying composition and origin from two extremely dry deserts were studied, namely Atacama and Mojave. The samples represent both dry evaporitic deposits and recent evaporitic efflorescences from hypersaline brines. The samples comprise halite and different types of sulfates and carbonates. The samples were analysed in two different ways: (i) directly as untreated rocks and (ii) as homogenized powders. Two excitation wavelengths of miniaturized Raman spectrometers were compared: 532 and 785 nm. The potential to detect carotenoids as biomarkers on Mars compared with the potential detection of carbonaceous matter using miniaturized instrumentation is discussed.

The Twin arginine translocation pathway translocates fully folded proteins across cellular membranes and is only utilised by proteins that fold before translocation. It is a unique process that is found in many bacteria, archaea and also in plant chloroplasts. Investigation of the bacterial and thylakoidal systems has revealed much of the substrates and the components involved in their translocation. Unfortunately, there are still many unanswered questions such as how substrates are directed to the membrane and the actual mechanism of translocation. This thesis specifically investigates the Tat pathway of halophilic and thermophilic archaea. To date, there has been a lack of research into the archaeal Tat pathway and it is possible that there are unique adaptations because of the extreme environments that these organisms inhabit. Chapter 3 specifically investigates the thermophiles Sulfolobus solfataricus and Sulfolobus tokodaii and attempts to purify their Tat complexes. By doing so it was hoped to learn more about the Tat components and their interactions. Further experiments were also performed to determine if the two S. solfataricus Tat operons provide specificity to the Tat substrates that translocate. Four separate areas of the Tat pathway of halophilic archaea (haloarchaea) were investigated in Chapters 4-7. Firstly, site-directed mutagenesis was used to analyse the signal peptides of haloarchaeal Tat substrates in more detail. Consequently, the resulting data led to the use of bioinformatics to analyse the Haloarchaeal signal peptide. The bioenergetics of the Tat system was then determined by analysing the effect of a variety of ionophores on translocation of the Tat substrates AmyH and SptA. Finally, a series of folding and stability assays were used to increase our understanding of AmyH, which could provide further information on why this protein, like many other haloarchaeal proteins, requires the Tat pathway for translocation.

Freshwater shortages causes challenges in mineral processing in Chile, especially in arid regions. As a result, froth flotation; a mineral process, is shifting usage of freshwater to seawater. This has consequences in the consumption of flotation reagents and decreasing the flotation efficiency. Biotechnological developments allow conceptualising the use of bacterial cells and their metabolites as bioreagents in flotation; classified as bioflotation. In this thesis, 5 halophilic bacteria, namely, Halomonas boliviensis, Marinobacter spp., Halobacillus litoralis Hol-1, Marinococcus halophilus KOR-3 and Halomonas eurihalina P6-1 have been screened for the potential use as pyrite biodepressants at micro- and batch-scale flotation. The effect of bioconditioning minerals with these bacteria was studied using zeta potential, fluorescence microscopy and contact angle. Experiments measuring zeta potential show the isoelectric point (IEP) of pyrite, chalcopyrite and molybdenite became more acidic post-bioconditioning. Fluorescence microscopy with Nile red; a hydrophobic stain, allowed for a method to visualize bacterial cells or collector potassium isopropyl xanthate (KIPX) on mineral particles of pyrite, chalcopyrite and molybdenite. Additionally contact angle experiments show that strains Halobacillus litoralis Hol-1, Marinococcus halophilus KOR-3 and Halomonas eurihalina P6-1 had an influence on the contact angle of pyrite and chalcopyrite, inducing changes in their hydrophobicity. Microflotation experiments showed a decreased recovery of pyrite in presence of all strains, but notably, Halobacillus litoralis Hol-1 and Marinococcus halophilus KOR-3, also showed an increased recovery of chalcopyrite, making them ideal candidates as pyrite biodepressants. Halomonas eurihalina P6-1 showed low recoveries of both minerals, but a higher selectivity depressing more pyrite than chalcopyrite. Usage of autoclaved biomass from the three aforementioned strains in batch-flotation experiments resulted in the recovery of chalcopyrite improving, with a small decrease in the recovery of pyrite, overall showing a positive potential but not improving the system. Halophilic bacteria such as the ones used in this study show an influence on the floatability of pyrite, which could be commercially exploited to substitute lime as a pyrite depressant. Furthermore, the work in this thesis focused on studying the effects of cells in artificial seawater, both at micro and batch-scales which brings the laboratory experiments a step closer to industrially relevant conditions.

Soil salinity is an increasing problem facing agriculture in many parts of the world. Climate change and irrigation practices have led to decreased yields of large areas of farmland due to increased salt levels in the soil. Irrigation introduces salts to the soil that with time accumulate and threaten crop yield. In arid climates like Utah, the practice of irrigation is especially threatening to salt-sensitive crops including alfalfa (Medicago sativa). Plants that have tolerance to salt are needed to feed livestock and the world's population. One approach to address this problem is to introduce genes encoding salt tolerance into the genomes of salt-sensitive plants through genetic engineering, but this approach has limitations. These limitations include the misinformed public perception of genetically modified organisms (GMOs). Even if the GMO salt-tolerant plants could produce palatable foods, in regions of the world with saline soils incongruous with farming, if consumers refuse to purchase the food then the engineering and upfront costs of production are negated. Another fairly new approach involves the isolation and development of salt-tolerant (halophilic) plant-associated bacteria. Several reports are now available demonstrating how the use of halophilic inoculants enhance plant growth in salty soil. This enhanced plant growth is most likely associated with changes in plant gene expression; however, the mechanisms behind this growth stimulation are not yet clear. Halomonas elongata 1H9, a rhizobacteria native to Goshen UT, has been identified as a plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) when used as an inoculant added to alfalfa seedlings grown in salty soils. Plants grown in the presence of this Halomonas sp. and 1% salt demonstrated an average increase of 2.4x the biomass of alfalfa plants grown without inoculum in salty soils. This suggests that this Halomonas sp. positively influences plant salt tolerance, which raises the question as to how the bacteria stimulate plant growth under these conditions. To identify and characterize plant genes induced by Halomonas elongata, transcriptional analysis was performed using RNA-sequencing (RNA-seq). This analysis identified a variety of differentially expressed genes (DEGs) including transcription factors (e.g. MYB14, GATA transcription factor 9, Ethylene-responsive transcription factors ER017 and ER109) and plant enzymes involved in growth and development (e.g. xyloglucan endotransglucosylase and phosphodiesterase). This was followed by gene validation via real-time quantitative PCR (RT-qPCR), the gold standard for RNA-seq validation, however this process was never successfully completed. Suggestions for next steps are included in the discussion section of chapter 3.

Une consommation élevée de sel a été associée à beaucoup de maladies et à un risque accru de décès. Plusieurs mécanismes sous-jacents, y compris le stress oxydatif, ont été étudiés. Mais la salinité dans l'intestin et l'altération possiblement associée de son microbiote, récemment identifiées comme un symbiote critique de la santé et de la maladie, n'ont pas encore été explorées chez l'homme. En testant 1334 prélèvements de selles, nous avons montré qu'une salinité élevée était associée à une diminution de la diversité globale et à l'émergence de populations microbiennes halophiles dans l'intestin. La salinité fécale était associée au régime alimentaire salé et à l'obésité, conformément aux données épidémiologiques. Aucun procaryote halophile n’a été cultivé en dessous d'un seuil de salinité fécale de 1,5 %. Au-delà de ce seuil, nous avons découvert une diversité inattendue de microbiote halophile humain dont la richesse était corrélée avec les concentrations de sel; 64 espèces différentes ont été isolées, dont 21 nouvelles espèces et 43 espèces connues dans l'environnement mais non chez les humains. Trois procaryotes extrêmement halophiles ont été isolés, dont deux Archaea appartenant au genre Haloferax, avec une nouvelle espèce Haloferax massiliensis, et un nouveau genre bactérien, Halophilibacterium massiliense. D'autres études devraient spécifier les facteurs qui conduisent à la salinité intestinale et préciser si les altérations de microbiota intestinal associées à des niveaux élevés de sel peuvent être liées à des causes humaines / High salt intake has been linked with many diseases and an increased risk of death. Several underlying mechanisms, including oxidative stress, have been investigated, but salinity in human gut and the possible associated alteration of its microbiota recently identified as a critical symbiote of health and disease, have not yet been investigated in humans. Here, by testing 1,334 stools, we have shown that high salinity is associated with a decrease in overall diversity but the emergence of halophilic microbial populations in the intestine. Fecal salinity was associated with saline diet and obesity, according to epidemiological data. No halophilic prokaryote can be grown below a fecal salinity threshold of 1.5%. Beyond this threshold, we discovered an unexpected diversity of human cultured halophilic microbiota whose richness was correlated with salt concentrations; 64 different species were isolated, including 21 new unknown species and 43 known species in the environment but not in humans. Three extremely halophilic prokaryotes were isolated, including two Archaea belonging to the genus Haloferax, with a new species Haloferax massiliensis, and a new bacterial genus, Halophilibacteriums massiliense. Further studies should specify the factors driving gut salinity, and clarify if the gut microbiota alterations associated with high salt levels could be causally related to human diseas

La cellule est un milieu très concentré où les interactions entre macromolécules, même faibles, jouent un grand rôle dans leur solubilité et dans l'assemblage des complexes labiles assurant les fonctions biologiques. Les interactions faibles entre protéines déterminant la non-idéalité de leurs solutions vont aussi gouverner leur cristallisation.<br />Dans quelle mesure les interactions protéine – solvant influencent-elles les interactions protéine – protéine ? Nous avons mis en relation ces deux types d'interactions pour la malate déshydrogénase (Hm MalDH) de Haloarcula marismortui, protéine halophile très acide qui a des solvatations variées et très riches en eau et en sel.<br />Nous avons développé une nouvelle méthode de détermination du second coefficient du viriel A2 par la modélisation des profils de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, qui permet l'étude de solvants complexes.<br />Les interactions protéine – protéine de la Hm MalDH en divers sels ont été caractérisées par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Les A2 et les facteurs de structure en solution ont été modélisés par des potentiels d'interaction de type DLVO. Les interactions répulsives sont principalement dues au terme de volume exclu et dans une moindre mesure au terme électrostatique. Les interactions attractives sont qualitativement corrélées à des valeurs positives ou négatives des paramètres d'interaction préférentielle avec le sel. Ces résultats permettent d'expliquer l'adaptation moléculaire des protéines halophiles qui doivent ainsi avoir une solvatation riche en sel pour rester soluble à haut sel.<br />La cristallisation par dilution de la Hm MalDH dans des mélanges sel – MPD (méthyl-2-pentanediol-2,4) résulte d'une lente évolution des interactions protéine – protéine, de répulsives à modérément attractives. Le MPD modifie les interactions protéine – protéine en divers sels en ajoutant une attraction qui est liée à la répulsion du MPD par les charges de la protéine.

L'hétérogénéité à différentes échelles constitue actuellement une problématique majeure pour la compréhension du fonctionnement des écosystèmes. Ce travail s'intéresse au caractère hétérogène du pâturage et aux mécanismes responsables de la formation de mosaïques végétales ainsi qu'aux conséquences sur les patrons d'hétérogénéité de certains paramètres fonctionnels du sol. Les prairies communales du Marais Poitevin représentent le modèle biologique de cette étude. Le pâturage collectif et mixte (bovin et équin) est pratiqué de façon traditionnelle depuis le Xième siècle sur ce milieu, où trois communautés végétales coexistent le long d'un gradient d'inondation et de salinité. Le pâturage sélectif par les herbivores, bovins et équins, intervient à deux échelles : (1) à l'échelle des trois communautés par l'utilisation préférentielle de certaines d'entre elles, les préférences étant ou non communes aux deux herbivores ; (2) à l'échelle intra-communauté par une utilisation différentielle de la végétation au sein de chaque communauté. Ce pâturage sélectif conduit à la formation de patchs de végétation, notamment des zones de gazons et des zones d'herbe haute. Ces dernières, dans le cas du pâturage équin ou mixte, correspondent aux zones de dépôt de fèces des chevaux (ou zones de latrines). Le nombre, la nature et la surface des patchs est dépendante du régime de pâturage en terme d'espèces d'herbivores (bovins, équins ou mixte) et de chargement en bovins. Ce sont les régimes de pâturage équin et mixte qui créent le plus d'hétérogénéité. Chaque patch de végétation est caractérisé par une structure (hauteur, couvert de sol nu), une composition floristique et une diversité particulière. Avec la présence d'équins seuls, les patchs les moins diversifiés sont les zones de dépôts de fèces, dominées par les pérennes Elymus repens ou Agrostis stolonifera selon la communauté. En pâturage mixte, le développement de ces deux espèces est limité par les bovins qui pâturent les zones de latrines, les deux espères d'herbivores présentant alors des effets compensatoires. Sur les zones de gazons, les deux herbivores ont des effets additifs. A l'échelle des parcelles, ce sont les régimes de pâturage les plus créateurs d'hétérogénéité qui conduisent à la diversité la plus élevée. Aux mosaïques végétales créées par les herbivores, correspond une hétérogénéité fonctionnelle analysée pour plusieurs paramètres : biomasse aérienne, épaisseur du mat racinaire, matière organique du sol, stocks d'azote organique et minéral du sol. C'est le sol de pentes intermédiaires, où se développe une communauté sub-halophile, qui présente le plus de variabilité des paramètres fonctionnels : les variations d'intensité de pâturage conduisent à des différences importantes de stocks d'azote minéral et de conductivité électrique. La formation des patchs de végétation de la communauté sub-halophile est, pour partie, dépendante de l'action des différentes composantes du pâturage que sont la défoliation, le piétinement, la création de sol nu dont les effets respectifs ont été testés expérimentalement. La réponse de la végétation montre des composition floristiques variées qui sont parfois semblables à celles observées en condition de pâturage. Certains de ces patchs sub-halophiles ont été soustraits temporairement aux herbivores et présentent des dynamiques de réversibilité contrastées. Le maintien de la diversité floristique associée à la présence de ces patchs, semble grandement dépendant de la permanence du pâturage.