In recent years, second harmonic generation (SHG) microscopy has revolutionised the field of biological imaging by offering a new means of visualising the fine structures of collagen tissues with excellent image penetration while minimising photodamage. This project involves the design and construction of a SHG microscope that is built around a compact femtosecond fibre laser for collagen imaging. Operating at 1032 nm, the microscope has demonstrated a penetration depth of beyond 320 microns in collagen, which is considerably superior to depths of 250 to 300 microns achievable with a conventional SHG microscope coupled to a Ti:sapphire excitation laser. The imaging characteristics of the microscope have been tested with a modified sample of bovine pericardium. The results indicate the microscope is polarisation-sensitive to the tissue structure and is capable to detecting signal changes at 10 μm resolution. This thesis will describe in detail, to our best knowledge, the first SHG microscope equipped with a compact and robust all-fibre femtosecond 1032 nm laser source.

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Thesis deals with ultrasonographic contrast examinations, that are performed to assess tissue perfusion and non-invasive ultrasound method speckle tracking, overcoming the weaknesses of Doppler techniques used to scanning the movement of the tissue.

Die fokale noduläre Hyperplasie (FNH) ist der zweithäufigste gutartige Lebertumor. Die sonografischen Befunde von 161 Patienten mit FNH wurden retrospektiv ausgewertet. Die FNH erschien lobuliert (94%) und scharf abgrenzbar (85%). In 96% der Fälle war ein zentraler Narbenstern nachzuweisen. Bei Verfettung des umgebenden Leberparenchyms zeigte sich die Raumforderung überwiegend reflexarm. Ein echoarmes Halo wurde in 22% beobachtet; intratumorale Verkalkungen traten in 15% der Fälle auf. Im nativen Doppler erschien die FNH zu 97% als gefäßreicher Herd. Die Tumorarterien wiesen im Mittel einen geringen Widerstand (RI 0,42+/-0,11) bei niedriger Pulsatilität auf (PI 0,57+/-0,20). Die mittlere Differenz zwischen den RI der Tumorarterien und dem der Arteria hepatica communis betrug 0,34+/-0,13. In einer weiteren Studie wurde das Verhalten von 138 FNH unter Einsatz eines Echosignalverstärkers mit der Power-Doppler-Sonographie und 2nd Harmonic Imaging untersucht. Bei 26 Läsionen war die Diagnose von vornherein gesichert, 112 wurden prospektiv als Raumforderung unklarer Dignität untersucht. Die retrospektive Untersuchung zeigte, dass ein charakteristischer Ablauf der Tumorkontrastierung auftritt. Entsprechend dem niedrigen Gefäßwiderstand begann der Mikroblaseneinstrom in die Läsion sehr frühzeitig. In der früharteriellen Phase kontrastierte sich das zuführende Gefäß mit zentrifugaler Auffüllung radspeichenartig angordneter Tumorarterien entlang der Narbensepten. In der Kapillarphase war die Läsion scharf und signalintensiv abzugrenzen. Das Kontrastierungsmaximum lag in der Portalphase. In der prospektiven Untersuchung von 112 unklaren Raumforderungen gelang die Diagnose der FNH nach diesen Kriterien in 94% der Fälle. In den übrigen 6% wurde zumindest eine bösartige Neubildung ausgeschlossen. Die FNH kann unter Einsatz eines Echosignalverstärkers sonographisch ausreichend sicher diagnostiziert werden. Beim Nachweis der kontrastspezifischen Kriterien ist die Biopsie nicht notwendig. Voraussetzung ist ein erfahrener Untersucher. Neben weit geringerer Kosten bei einfacher Handhabung und vertretbarem technischen Aufwand stellt die Vermeidung der Strahlenbelastung durch CT oder Szintigraphie einen Gewinn für die Patienten dar. Ein abwartendes Verhalten bei einer FNH ist gerechtfertigt, da tumorbedingte Beschwerden selten und Komplikationen der Neoplasie rar sind. Zusätzlich kann in der zweiten Hälfte des Lebens von einer spontanen Regression der fokalen nodulären Hyperplasien ausgegangen werden. / Focal nodular hyperplasia (FNH) is the secondmost of the benign liver tumors. The sonografic findings of 161 patients with FNH were retrospectively evaluated. The FNH appeared lobulated (94%) and sharply definable (85%). In 96% of the cases there was to be proven a central starlike scar. In case of a fatty surrounding liverparenchyma the tumor was presented reflex-poor. An echo-poor halo was observed in 22%; intratumorale calcification was present in 15%. In the native Doppler the FNH appeared hypervascular in 97%. The arteries of the tumor pointed on the average a slight resistance (RI 0,42+/-0,11) with low pulsatility (PI 0,57+/-0,20). The difference between the RI of the arteries of the tumor and that of the Arteria hepatica communis amounted 0,34+/-0,13. In a further study the behavior was examined by 138 FNH under employment of a contrastenhancer with the power Doppler sonografie and 2nd Harmonic Imaging. With 26 lesions the diagnosis was from the beginning secured, while 112 tumors of unclear dignity were examined prospektivly. The retrospective investigation showed that a characteristic operational sequence of the tumor contrasting arises. According to the low resistance the micro blister influx began into the lesion very fast. In the early arterial phase the tumor feeding artery contrasted with centrifugal filling and a spokewheel like sign along the fibrotic central scar. In the capillary phase the lesion was to be defined sharply and signal-intensively. The contrast maximum lay in the portal phase. In the prospektive investigation of 112 unclear tumors the diagnosis of the FNH succeeded according to these criteria in 94%. In the other 6% at least a malign new formation was excluded. The FNH can be diagnosed sonografically sufficient under employment of a contrastenhancer. With the proof of the contrast-specific criteria the biopsy is not necessary. An experienced examiner is necessary. Beside far smaller costs with simple handling and justifiable technical expenditure the avoidance of the radiation dose represents a profit by CT or Szintigraphie for the patients. A cautious behavior with a FNH is justified, because tumor-conditioned complaints and complications of neoplasia are rare. Further on a spontaneous involution of focal nodular hyperplasias can be proceeded in the second half of the life.

L'échographie est aujourd'hui une technique d'imagerie de diagnostic répandue. Si l'imagerie dite ‘classique' basée sur la réponse linéaire des tissus est couramment utilisée, l'imagerie harmonique, basée sur la réponse non linéaire des tissus, est maintenant aussi utilisée en routine clinique. L'estimation du paramètre de non linéarité d'un milieu par une technique ultrasonore amène de nouvelles perspectives en termes d'imagerie et de diagnostic. Cependant, la méthode de mesure du paramètre de non linéarité est limitée par deux facteurs, la présence du speckle et la concentration de l'énergie à une profondeur donnée (la zone focale). Cette thèse a pour objectifs de répondre aux deux limitations mentionnées précédemment en proposant de nouvelles méthodes de lissage de l'image pour réduire le speckle et d'améliorer l'estimation du paramètre de non linéarité en mode écho par de nouvelles méthodes d'émission. Dans un premier temps, il a été proposé d'utiliser une méthode de filtrage spatiale basée sur des filtres orthogonaux (filtres de Thomson) lors de la formation de voie en réception pour lisser le speckle. Ce filtrage spatiale intervient après la transmission d'ondes planes sous différents angles pour améliorer la résolution spatiale et le contraste tout en accélérant la cadence d'imagerie. Dans un deuxième temps, l'estimation du paramètre de non linéarité est faite avec une méthode comparative. Le champ de pression du second harmonique d'une zone de référence est comparé avec le champ de pression d'une zone dont le paramètre de non linéarité est inconnu. Cependant, dans le cas des images échographiques, le champ de pression du second harmonique n'est pas accessible. Nous faisons l'hypothèse que la pression acoustique locale est liée à l'intensité de l'image échographique si le speckle est réduit et lissé. La transmission d'ondes planes et l'application de filtres orthogonaux permet de mieux délimiter le paramètre de non linéarité par rapport à une transmission focalisée / Nowadays, ultrasound imaging is a common diagnostic tool thanks to its non-invasive behavior and relatively cheap equipment. Classic medical echographic imaging is based on the linear response of the biological tissue. However harmonic imaging, based on the harmonic frequencies generated by the nonlinear properties of the tissue, is more and more used for clinical application. The quantification of nonlinearity is based on the evaluation of the nonlinearity parameter which strongly influences the harmonics generation. The nonlinearity parameter estimation using an echographic approach would bring new modalities for imaging and diagnosis. However the echographic method for nonlinearity estimation is limited by two factors: the presence of speckles in the image and the focalization used during transmission, which concentrates the energy at one particular depth. The objectives of this thesis work are developing novel approaches to reduce the speckle noise using original smoothing techniques and improving the nonlinearity parameter estimation in echo mode using new transmission-reception strategies. Firstly, new speckle noise reduction approaches were investigated. The Thomson’s multitaper approach was proposed, consisting in using several different orthogonal apodizations during beamforming. This method was combined to a coherent plane-wave compounding transmission-reception strategy improving the spatial resolution and the contrast while improving the frame rate. In a second time, the nonlinearity parameter was estimated using a comparative method. The second-harmonic pressure field of a reference area was compared to the pressure field of an area where the nonlinearity parameter is unknown. However in echo-mode, the pressure field of the medium is unknown. It is assumed in this thesis work that the local pressure can be derived from envelope image local amplitude if the speckle noise is smoothed. The nonlinearity parameter estimation has been improved using plane-wave transmission and orthogonal apodizations compared to the use of a single focalization transmission / Oggigiorno, le tecniche di imaging ad ultrasuoni sono un comune strumento di diagnosi, grazie alla loro non invasività e alla relativa economicità dei sistemi. La risposta lineare dei tessuti biologici è la base per le tecniche di imaging ecografico tradizionali. La generazione di frequenze ad armoniche superiori da parte dei tessuti può essere sfruttata per sviluppare tecniche di imaging innovative (i.e., imaging armonico), che sono sempre più utilizzate per applicazioni cliniche. Tali tecniche sono basate sul metodo di valutazione del parametro di non linearità che influenza fortemente la generazione delle armoniche all’interno dei tessuti. I metodi per la stima dei suddetti parametri sfruttano solitamente un approccio ecografico tradizionale. Di conseguenza, gli effetti legati alla focalizzazione impiegata durante la trasmissione, che concentra l’energia ad una particolare profondità, e la presenza di speckle nell’immagine finale, rendono più incerta la stima del parametro di non linearità. In questa tesi sono proposti metodi innovativi finalizzati a due scopi: ridurre, nelle immagini, il rumore dovuto a speckle, tramite l’adozione di nuove tecniche di smoothing; migliorare la stima dei parametri di non linearità, tramite l’impiego di nuove strategie di beamforming in trasmissione e ricezione. Per ridurre il rumore dovuto a speckle, è stato proposto un approccio di filtraggio spaziale basato sull’impiego dei filtri di Thomson. Tale tecnica consiste nell’impiego di numerose apodizzazioni ortogonali fra di loro in fase di beamforming. Il metodo è stato in particolare combinato con la tecnica di imaging coherent plane-wave compounding, con lo scopo di migliorare la risoluzione spaziale e il contrasto e, al contempo, incrementare il frame rate. Il parametro di non linearità è stato misurato tramite un approccio comparativo. Il campo di pressione della seconda armonica in un’area di riferimento dell’immagine è stato confrontato con quello di un’area in cui il parametro di non linearità è ignoto. In questa tesi, grazie alla riduzione del rumore speckle, è stato possibile assumere che il campo di pressione

Utilisés dans de nombreux domaines d'applications, les ultrasons se révèlent être sensibles aux propriétés visco-élastiques des milieux traversés. L'investigation spatiale et temporelle des propriétés visco-élastiques des matériaux par méthodes ultrasonores permet notamment le contrôle de l'intégrité de structures ainsi que le suivi de processus. Un dispositif auto-calibrée en émission-réception, basé sur l'application du principe de réciprocité, a été développé pour la mesure du paramètre non linéaire B/A. Cette mesure repose sur une étude harmonique des signaux ultrasonores se propageant dans le milieu. L’instrumentation ultrasonore mise en œuvre a été choisie pour assurer une mesure rapide en émission-réception du paramètre B/A imposant un choix technologique spécifique. L'évolution au cours du temps des paramètres acoustiques dans les matériaux de type sol-gel fait apparaitre un temps caractéristique lié à la structuration du matériau (gélification). Les temps de gélification extraits des mesures permettant de retrouver la loi d'Arrhenius cohérente avec celle obtenue par des méthodes rhéologiques conventionnelles. Une image du paramètre non linéaire a été réalisée sur un fantôme contenant deux fluides non miscibles (eau et huile de silicone). A travers ces deux applications, nous montrons l'efficacité du système de mesure du paramètre non linéaire dans le cadre du suivi d'un matériau en évolution ainsi qu'en imagerie. / Used in many application areas, ultrasound proved to be sensitive to determine viscoelastic properties. The spatial and temporal investigation of viscoelastic properties of materials by ultrasonic methods can be used to monitor structure integrity and processes. A self-calibrated method, based on reciprocity principle has been developed for measuring the nonlinear parameter B/A. Instrumentation has been development to ensure the rapid determination of the parameter B/A imposing a specific technology. The time evolution of the acoustic parameters of sol-gel materials shows a characteristic time related to the structuration of the material (Arrhnius law). A picture of the nonlinear parameter was performed on a phantom containing two immiscible fluids (water and silicone oil). Through these two examples, the effectiveness of the nonlinear parameter measurements has shown in the follow-up of a material changes as well as imaging.

Thesis deals with ultrasonographic contrast examinations, that are performed to assess tissue perfusion and non-invasive ultrasound method speckle tracking, overcoming the weaknesses of Doppler techniques used to scanning the movement of the tissue.

L’amélioration du contraste des images échographiques occupe une place importante en imagerie ultrasonore médicale puisque la qualité des images impacte directement le diagnostic médical. Les imageries de contraste sous et ultra-harmoniques sont deux techniques permettant de produire des images à fort contraste. Le développement de techniques de filtrage, permettant de mieux extraire les composantes sous et ultra-harmoniques présentes dans les signaux renvoyés par les produits de contraste ultrasonore, a pour conséquence d’améliorer encore plus le contraste des images. Les modèles non linéaires dits « boîtes noires » du type Volterra, Hammerstein, et Wiener, sont souvent utilisés pour identifier et modéliser les systèmes non linéaires tels que les produits de contraste ultrasonore. Ces modèles, bien que très bien adaptés pour modéliser les composantes harmoniques entières, ne le sont plus en présence de sous et ultra-harmoniques. Dans les années 2000, une méthode permettant la modélisation de sous et ultra-harmoniques en utilisant un modèle de Volterra à plusieurs entrées (Multiple Input Single Output : MISO) a été développée. Pourtant, bien que cette méthode soit complètement originale dans le domaine considéré, les points clés qui la sous-tendent ne sont pas clairement identifiés. C’est en identifiant clairement les points clés de la méthode existante que nous pouvons la généraliser et proposer plusieurs nouveaux paradigmes pour la modélisation et l’extraction de sous et ultra-harmoniques. Nous proposons alors des alternatives beaucoup plus simples du type mono-entrée mono-sortie (Single Input Single Output : SISO). En modulant en fréquence l’entrée du système, nous avons pu ainsi identifier les réponses impulsionnelles des différents canaux du modèle de Hammerstein généralisé. À partir de ce cadre général, nous avons aussi proposé de nouvelles approches pour réduire la complexité du modèle de Volterra. / Contrast enhancement of echographic images occupies an important place in medical ultrasound imaging, since the quality of images has a direct impact on medical diagnosis. Sub and ultraharmonic contrast imaging are two imaging techniques that provide high contrast images. Developing filtering techniques, that allow better extraction of sub and ultra-harmonic components present in the echo backscattered by the ultrasound contrast agents, results in additional improvement of the contrast. Non linear models known as “black box” models, like Volterra model, Hammerstein model, and Wiener model are usually used to identify and model non linear systems such ultrasound contrast agents. Although these models are well suited to model integer harmonic components, they are not suitable in the presence of sub and ultra-harmonic components. In the 2000s, A method that allows the modeling of sub and ultra-harmonic components, using a multi inputs single output Volterra model (MISO) has been developed. Although this method was original in the considered domain, the key points underlying this method are not clearly identified. By clearly identifying the key points of the existing method, we can generalize it and propose new paradigms for modeling and extraction of sub and ultra-harmonics. We propose much simpler alternatives based on single input single output (SISO) models. By modulating the input frequency of the system, we can also identify the different impulse responses of the different channels of the generalized Hammerstein model. From this general framework, we also propose new approaches to reduce the complexity of Volterra model.