Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/08/2014 / Inclui referências / Resumo: Estudos com a finalidade de produzir bioplásticos, como polihidróxialcanoatos (PHA), têm crescido nas últimas décadas por ser uma alternativa sustentável para a produção de plásticos biodegradáveis e, portanto, uma alternativa ambientalmente viável para a substituição dos processos petroquímicos utilizados massivamente nos dias de hoje. Herbaspirillum seropedicae tem um grande potencial biotecnológico quanto à produção de PHA, sendo que essa capacidade já foi reportada sobdiferentes condições de cultivo. O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a produção de PHB na estirpe parental H. seropedicae SmR1 e no seu mutante ntrC, defectivo na expressão de NtrC, um importante regulador do metabolismo de nitrogênio em diversas bactérias. A estratégia desenhada nos permitiu avaliar a produção em alta e baixa relação carbono/nitrogênio (C/N) utilizando NH4Cl como fonte de nitrogênio e monossacarídeos ou ácidos carboxílicos como fontes de carbono. Entre os ácidos carboxílicos avaliados, o citrato se mostrou o mais promissor, já que a produção de polihidroxibutirato atingida foi de 47,1% de PHB/psc para H. seropedicae SmR1 e 76% de PHB/psc para o mutante ntrC. Entre os monossacarídeos testados, a D-frutose se destacou como a melhor fonte de carbono deste grupo, atingindo produções de 30,5% e 65,8% de PHB para SmR1 e o mutante ntrC, respectivamente. Interessantemente, a fonte de carbono em que H. seropedicae teve o melhor desempenho quanto a produção de PHB foi o glicerol. As produções de PHB atingidas foram de 74,4% e 78% para H. seropedicae SmR1 e mutante ntrC, respectivamente. De modo geral, observou-se que independente da fonte de carbono utilizada, as maiores produções de PHB foram obtidas quando as concentrações de amônio no meio eram menores que 5mM/L, o que indica que altas relações C/N favorecem a síntese de PHB em H. seropedicae. O mutante ntrC demonstrou em todas as condições avaliadas produzir entre 20 a 100% mais PHB do que a estirpe parental SmR1. A complementação do mutante ntrC com uma cópia integra do gene ntrC de H. seropedicae SmR1 reverteu sua maior produção de PHB, retornando aos níveis da estirpe SmR1. Este resultado indica que a proteína NtrC está regulando o processo de síntese de PHB em H. seropedicae. As principais conclusões deste trabalho são: (i) a produção de PHB depende da natureza da fonte de carbono e provavelmente da sua via de metabolização e da produção de metabólitos como acetil-CoA e equivalentes reduzidos(NADPH e NADH); (ii), o mutante ntrC em todas as condições testadas apresentou maior produção de PHB, indicando que a ausência de NtrC pode afetar o balanço metabólico em H. seropedicae favorecendo a produção de PHA. Palavras chaves: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), razão carbono/nitrogênio, sistema NTR, ntrC. / Abstract: Studies aiming to produce bioplastics such as polyhydroxyalkanoates (PHA) has grown in recent decades to be a sustainable alternative for production of biodegradable plastics is therefore an environmentally feasible alternative to the substitution of petrochemical processes use in massively days today. Herbaspirillum seropedicae has great biotechnological potential for the production of PHA, and this ability has been reported under different culture conditions. The main objective of this study was to evaluate the production of PHB in the parental strain H. seropedicae SmR1 and its ntrC mutant, defective in the expression of NtrC, an important regulator of nitrogen metabolism in various bacteria. The strategy allowed us to evaluate the production in high and low carbon/nitrogen (C/N) using NH4Cl as a nitrogen source and monosaccharides or carboxylic acids as carbon sources compared. Among the tested monosaccharides, D-fructose emerged as the best source of carbon this group, reaching yields of 30.5% and 65.8% PHB for SMR1 and ntrC, respectively. Interestingly, the carbon source that seropedicae H. had the best performance as PHB production was glycerol. The PHB production was achieved of 74.4% and 78% for H. seropedicae SMR1 and mutant ntrC, respectively. In general, it was observed that independent of the carbon source used, the highest production of PHB were obtained when the concentration of ammonia in the medium were lower than 5mM / L, indicating that high C/N ratios favoring the synthesis of PHB H. seropedicae. The ntrC mutant demonstrated in all conditions evaluated to produce between 20 and 100% higher than PHB SMR1 parental strain. The complementation of mutant ntrC integrates with a copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. The complementation of mutant ntrC integrates with the copy of the ntrC gene of H. seropedicae SmR1 reversed its largest production of PHB, returning to levels of strain SmR1. This result indicates that indeed the NtrC protein is regulating the process of synthesis of PHB in H. seropedicae. The main conclusions are: (i) the production of PHB depends on the nature of the carbon source and probably its route of metabolism and the production of metabolites such as acetyl-CoA and reduced equivalnetes (NADPH and NADH); (ii) the ntrC mutant under all conditions tested showed higher production of PHB, indicating that the absence of NtrC can affect the metabolic balance in H. seropedicae favoring the production of PHA. Key words: Herbaspirillum seropedicae, Pohidroxibutirato (PHB), carbon/nitrogen ratio, NTR system, ntrC. XIII

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jesica_F_S_Genero.pdf: 1260489 bytes, checksum: da1efddef812f7eb843220dbd5d18a24 (MD5) Previous issue date: 2016-08-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bacteria Azospirillum brasilense and Herbaspirillum seropedicae are nitrogen fixers and promoting plant growth, able to promote partnerships with the trigo. O objective of this study was to evaluate the crop wheat agronomic performance in response to inoculation with Azospirillum brasilense diazotrophs and Herbaspirillum seropedicae with or without nitrogen fertilization and quantify the number of viable cells of bacteria of the wheat plant roots. The experiment was conducted in the crop year 2014/2014 and 2015/2015. The experimental design was a randomized block in factorial 2 x 4, with four repetitions. The first factor relates to the nitrogen topdressing applications (with and without nitrogen). The second factor relates to inoculating seeds with diazotrophs [without inoculation treatment (control), strain A. brasilense, H. seropedicae strain and combination of the two strains. The combined inoculation of strains A. brasilense + H. seropedicae with nitrogen fertilization promoted an increase of 48% and 13% in grain yield, in the 2014 season and 2015 season, respectively, for the plants that were not inoculated. You can check the inoculation Herbaspirillum, showed better total amount of viable cells with the application of nitrogen. The reduction in the number of CFU of Azospirillum under nitrogen fertilization condition can point to a lower competitiveness of these individuals by exudates and nutrients / As bactérias Azospirillum brasilense e Herbaspirillum seropedicae são fixadoras de nitrogênio e promotoras de crescimento vegetal, capazes de promover associações com a cultura do trigo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho agronômico do trigo em resposta a inoculação de bactérias diazotróficas com Azospirillum brasilense e Herbaspirillum seropedicae associada ou não à adubação nitrogenada e quantificar o número de células viáveis de bactérias das raízes de plantas de trigo. O experimento foi realizado nas safras agrícolas 2014/2014 e 2015/2015. O delineamento experimental foi de blocos casualizados em esquema fatorial 2 x 4, com 4 repetições. O primeiro fator refere-se às aplicações de nitrogênio em cobertura (com e sem nitrogênio). O segundo fator refere-se à inoculação de sementes com bactérias diazotróficas [tratamento sem inoculação (testemunha), estirpe de A. brasilense, estirpe de H. seropedicae e combinação das duas estirpes. Na ausência da inoculação, a adubação nitrogenada em cobertura promoveu um acréscimo de 18% no diâmetro do colmo. Na ausência da adubação nitrogenada em cobertura, a inoculação com H. seropedicae promoveu um acréscimo de 16% no diâmetro de colmo, e na presença da adubação nitrogenada esta bactéria promoveu um acréscimo de 24% no número de espiguetas por espiga em relação às plantas que não foram inoculadas. A inoculação combinada das estirpes A. brasilense + H. seropedicae com adubação nitrogenada em cobertura promoveu um acréscimo de 26% no número de espiguetas por espiga e o dobro do número de grãos obtidos, em relação à combinação sem adubação. A inoculação combinada das estirpes A. brasilense + H. seropedicae com adubação nitrogenada em cobertura promoveu um acréscimo de 48% e 13% na produtividade de grãos, na safra de 2014 e na safra de 2015, respectivamente, em relação as plantas que não foram inoculadas. A inoculação de H. seropedicae apresentou maior quantidade de células viáveis totais com a aplicação de nitrogênio. A redução do número de UFC de A. brasilense sob condição de adubação nitrogenada pode apontar para uma menor competitividade destes indivíduos por exsudatos e nutrientes

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:36:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_Diss_Adriano_Mitio_Inagaki.pdf: 1578705 bytes, checksum: fefbbbdade22e914fa0b6ff3629e6ef3 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to determine the population of diazotrophic bacteria in the roots of corn plants, and soil cultivation of these plants, as well as evaluating the initial development as a function of seed inoculation with Azospirillum brasilense and Herbaspirillum seropedicae and levels of acidic pH of the soil, no added nitrogen fertilizer. Experiment was conducted in a greenhouse in pots of 13 dm3 of soil, with the hybrid corn 30F53H. For the evaluation of the initial development we used a randomized block design in a 3x4 factorial design, with one factor levels of soil acidity [pH (CaCl2) of 4,5; 5,0 and 5,5] and another the seed inoculation : no inoculation; A. brasilense (Ab-V5), H. seropedicae (SmR1) and the association of strains Ab-V5+SmR1. To measure the population of diazotrophs expressed in colony forming units (CFU), using the design was randomized blocks in a factorial 12 x 2 x 2 and four blocks, totaling 48 experimental plots. The first factor was composed of twelve combinations using inoculation with A. brasilense and H. seropedicae and different levels of soil pH; The second factor, the time of sampling at 15 and 41 days after sowing (DAS). And the third factor, the culture media, and NFb Lactate and Malate used the growth of bacteria and enumeration of CFU. Inoculation was performed via seed 12 hours before sowing, with a volume of 4 mL concentration of 107 CFU mL-1 for a thousand seeds. The evaluations were done at 15 and 41 DAS, and used the method of the most probable number (MPN) for the estimation of bacterial population, in addition to evaluation of plant height, dry weight of root, stem, leaf and total area leaf, stem diameter, SPAD index, foliar N, P, and K, and measurements of gas exchange A, gs , E and EUA. Soil acidity negatively influenced plant height, root dry matter, stem diameter, SPAD index, leaf P concentration, rate of net CO2 assimilation, stomatal conductance, transpiration and water use efficiency. Maize plants grown in soil with pH 4,5 had higher leaf P content regardless of inoculation, indicating probable solubilization of phosphorus. Inoculation of growth promoting bacteria from plants (GPBPs) in maize (30F53H), showed higher accumulation of leaf N, regardless of soil pH, increase in leaf area, SPAD index and stem diameter, and did not influence the accumulation of matter dried plants. The population of bacteria found in soil and roots of maize, regardless of seed inoculation and soil pH levels, showed elevated levels. The inoculation with strains of A. brasilense and H. seropedicae showed no preference for colonization in the soil or in the roots of corn plants. Samples taken at 41 DAS resulted in greater population of diazotrophs when comparing the collection held at 15 DAS. The different levels of soil pH and isolated or in combination, GPBPs did not influence the population of colonies of bacteria detected in the media NFB Lactate and Malate used. The BPCPs proved promising when compared to the control treatment and subjected to stress conditions of soil acidity and nitrogen deficiency, indicating possible biological nitrogen fixation and solubilization of phosphorus. Although the number of CFU of bacteria present is higher in roots and soil, momentary gas exchange measurements recorded, showed no difference between treatments for both inoculation of seeds on the soil pH / O objetivo do trabalho foi verificar a população de bactérias diazotróficas nas raízes de plantas de milho, bem como no solo de cultivo destas plantas, além de avaliar o desenvolvimento inicial das plantas em função da inoculação de sementes com Azospirillum brasilense e Herbaspirillum seropedicae e níveis de pH ácido do solo, sem adição fertilizante nitrogenado. Foi realizado experimento em casa de vegetação, em vasos de 13 dm3 de solo, com o híbrido de milho 30F53H. Para a avaliação do desenvolvimento inicial das plantas utilizou-se delineamento de blocos ao acaso em esquema fatorial 3x4, sendo um fator os níveis de acidez do solo [pH (CaCl2) de 4,5; 5,0 e 5,5] e outro a inoculação das sementes: sem inoculação; A. brasilense (Ab-V5), H. seropedicae (SmR1) e associação das estirpes Ab-V5+SmR1. Para a mensuração da população de bactérias diazotróficas expressa em unidades formadoras de colônias (UFC), o delineamento utilizando foi de blocos casualizados em esquema fatorial 12 x 2 x 2 e quatro blocos, totalizando 48 parcelas experimentais. O primeiro fator foi formado por doze combinações utilizando inoculações com A. brasilense e H. seropedicae e diferentes níveis de pH do solo; O segundo fator, a época de coleta de amostras, aos 15 e 41 dias após a semeadura (DAS). E o terceiro fator, os meios de cultura, NFb Lactato e Malato utilizado o crescimento das bactérias e a contagem das UFC. A inoculação foi realizada via sementes, 12 horas antes da semeadura, com volume de 4 mL na concentração de 107 UFC mL-1 para mil sementes. As avaliações foram realizadas aos 15 e 41 DAS, e utilizou-se o método do número mais provável (NMP) para a estimativa da população bacteriana, além da avaliação de altura de plantas, massa seca de raiz, colmo, folha e total, área foliar, diâmetro de colmo, índice de SPAD, teor foliar de N, P, e K, e medidas de trocas gasosas A, gs, E e EUA. A acidez do solo influenciou negativamente a altura das plantas, matéria seca de raiz, diâmetro de colmo, índice SPAD, teor de P foliar, taxa de assimilação líquida de CO2, condutância estomática, transpiração e eficiência no uso da água. Plantas de milho cultivadas em solo com pH 4,5 apresentaram maior teor de P foliar independente da inoculação, indicando provável solubilização de fósforo. A inoculação das bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCPs) no milho (30F53H) promoveu maior o acúmulo de N foliar, independente do pH do solo, incremento em área foliar, índice SPAD e diâmetro de colmo, e não influenciaram no acúmulo de matéria seca das plantas. A população de bactérias encontradas no solo e nas raízes de milho, independente da inoculação das sementes e níveis de pH do solo, apresentaram valores elevados. A inoculação das estirpes de A. brasilense e H. seropedicae não apresentaram preferência de colonização no solo ou nas raízes de plantas de milho. Coletas realizadas aos 41 DAS resultaram em maior população de bactérias diazotróficas quando compara à coleta realizada aos 15 DAS. Os diferentes níveis de pH do solo e as BPCPs isoladas ou em associação, não influenciaram na população de colônias de bactérias detectadas nos meios NFb Lactato e Malato utilizados. As BPCPs se mostraram promissoras quando comparadas ao tratamento controle e submetidas em condições de estresse de acidez do solo e deficiência de nitrogênio, indicando possível fixação biológica de nitrogênio e solubilização de fósforo. Apesar do número de UFC de bactérias apresentarem-se elevados nas raízes e solo, as medidas momentâneas de trocas gasosas registradas, não demonstraram diferenças entre os tratamentos, tanto para inoculação de sementes quanto ao pH do solo

The sweet sorghum (Sorghum bicolor) presents high potential to be utilized as a raw material for the generation of ethanol. Recent studies indicated that sorghum can be colonized by diazotrophic bacteria that may provide part of the necessary crop N through biological N fixation (BNF). Therefore, the present study was aimed to evaluate the efficiency of inoculation with diazotrophic bacteria in sweet sorghum genotypes for growth, biomass production, stalk yield and N accumulation. Two studies were conducted. The first study was conducted in a greenhouse where fifteen sorghum genotypes were grown under four N sources i.e, control (without any N source), Herbaspirillumrubrisubalbicans, Azospirillum brasilense and 60 kg N ha-1. The second study was conducted in the field for two consecutive years with four sorghum genotypes under five sources of N: control (without any N source); A. brasilense;40 kg N ha-1 (40 N) + A. brasilense; 40 kg N ha-1 and 80 kg N ha-1 (80 N). In both studies, biometric variables of growth, dry matter, biomass and total N accumulation were evaluated besides sugarcane stalk and grain head yield in the field study. In both studies there was no interaction between genotypes and N sources.In the first study, the best results were obtained with the inoculation of Azospirillum brasilense which promoted an increase in dry matter (MSR), plant height, stalk diameter and N accumulation of 30%, 9 %, 10% and 8%, respectively, compared to control. In the second study, the genotype BRS 511 had high stalk production and grain head and low plant height and higher average stalk diameter which minimized the risk of lodging , Inoculation of plants did not increase the variables analyzed, except the production of grain head. The isolated use of inoculant resulted in production of similar grain head that was obtained with 40N treatment. Combined use of inoculant with N (40N) resulted in an increase of 6% in grain head production compared to treatment 40N and reached to 93% obtained with 80N treatment. The results of this study indicated a positive effect of inoculation with Azospirillumbrasilense on the production of grain head in sweet sorghum. / O sorgo sacarino (Sorghum bicolor) apresenta elevado potencial para ser utilizado como matéria prima na geração de etanol. Estudos recentes apontam que o sorgo pode ser colonizado por bactérias diazotróficas que podem fornecer parte do N necessário da cultura através da fixação biológica de N (FBN). O presente estudo teve por objetivo avaliar a eficiência da inoculação de bactérias diazotróficas em genótipos de sorgo sacarino sobre o crescimento, a produção de biomassa, produtividade de colmos e acúmulo de N. Foram realizados dois estudos. O primeiro foi realizado em casa de vegetação com o cultivo de quinze genótipos de sorgo sacarino sob quatro fontes de N: Testemunha, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Azospirillum brasilense e 60 kg ha-1 N. O segundo estudo, foi conduzido a campo por dois anos consecutivos, e avaliados quatro genótipos de sorgo sob cinco fontes de N: Testemunha; A. brasilense; 40 kg de N ha-1 (40 N) + A. brasilense; 40 N; 80 kg de N ha-1 (80 N). Foram avaliadas em ambos os estudos, variáveis biométricas de crescimento, matéria seca, biomassa e N total acumulado, além de produtividade de colmos e de caldo no estudo de campo. Nos dois estudos não houve interação entre genótipos e fontes de N. No estudo I, os melhores resultados foram obtidos com a inoculação de Azospirillum brasilense o qual promoveu um incremento em MSR, altura, diâmetro de colmos e acúmulo de N de 30%, 9%, 10% e 8%, respectivamente, em relação à testemunha. No estudo II, o genótipo BRS 511 teve alta produção de colmos e de caldo, além de minimizar o risco de acamamento, por possuir baixa estatura de planta e o maior diâmetro médio de colmos. A inoculação não aumentou as variáveis analisadas, exceto a produção de caldo. O uso isolado do inoculante resultou em produção de caldo semelhante aquela obtida no tratamento 40N. Combinando o uso do inoculante com N (40N) houve um incremento de 6% na produção de caldo em relação ao tratamento 40N e atingiu 93% da produção obtida no tratamento 80N. Os resultados desse estudo apontam para um efeito positivo da inoculação de Azospirillum brasilense sobre a produção de caldo em sorgo sacarino.