Orientador: Sara T. Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T12:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pranke_PatriciaHelenaLucas_M.pdf: 3795822 bytes, checksum: fba966483775191a766c241619c01e17 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: No presente trabalho foram analisados 10 pacientes com EIH e seus familiares através do estudo das proteínas totais em SDS-P AGE (Sistema Fairbanks 3,5-17% e Sistema Laemmli 12%), estudo da auto-associação de heterodímeros de espectrina e digestão tríptica da espectrina. Seis destas famílias apresentaram defeito na auto-associação dos heterodímeros de espectrina, sendo dois casos de Sp a 1150-46, três famílias com Sp a 1165e uma família com uma ß-espectrina encurtada, conforme evidenciado por técnica de westem-blotting com anticorpo anti-ß espectrina. Numa das famílias com Sp a 1165, um dos pacientes apresentou também uma ß-espectrina alongada, mas esta associação não determinou maior gravidade da doença ou aumento dos dímeros de espectrina. Uma família e um paciente apresentaram deficiência de proteína 4.1 e em dois casos não foi possível detectar, pela metodologia empregada, o defeito proteico. Nos pacientes Sp a 1165 kDa a pesquisa de heteroduplex após a amplificação do exon 4 do DNA genômico da cadeia alfa da espectrina demonstrou o aparecimento de uma banda com migração retardada nas três famílias estudadas sugerindo a duplicação do codon TTG. Em uma paciente Sp a 1150-46 kDa o sequenciamento do exon 6 da cadeia a-sp mostrou uma mutação de ponto CTG leu -+ CCG pro em um alelo no codon 260. Este é o primeiro estudo das alterações proteicas da ElH na população brasileira. A ß-espectrina alongada observada neste trabalho é o segundo caso descrito na literatura enquanto que a ß-espectrina "truncada" é, provavelmente, a menor ß-sp já descrita. O estudo da auto-associação dos heterodíineros de espectrina foi também levado a efeito em 26 pacientes com doenças cujo aparecimento de eliptócitos no esfregaço de sangue periférico era freqüente (7 LMC, 6 mielofibrose, 5 anemia ferropriva, 3 anemia megaloblástica e 5 anemia falciforme). Destes, um paciente com LMC apresentou aumento de dímeros de espectrina sugerindo, neste caso, um prejuízo na auto-associação de heterodímeros de espectrina / Abstract: The aim of this work was to study the protein defects in Hereditary Elliptocytosis (HE) in a brazilian population and to analyse the self-association of spectrin in patients without HE whose elliptocytes are frequently observed. Red cell membrane of ten patients with HE and their rei atives were investigated by SDS-PAGE (Fairbanks' system 3,5-17% and Laemmli's system 12%), by non denaturing gels for spectrin heterodimer self-association study and by the tryptic digestion of spectrin. Six families presented a defect in the spectrin self-association: two had Sp a I/50-46, three with Sp a I/65 and one with a "truncated" ß-spectrin as observed by westem-blotting using anti-ß espectrin antibody. In one family with Sp a I/65, one patient presented also a elongated ß-espectrin but this association did not increase the amount of spectrin dimers or the clinical severity of the disease. One family and one patient presented a deficiency of protein 4.1 and in two families, the protein defect was not detected by the approach used in this study.In the Sp a I/65 kDa patients, the analysis of heteroduplex after amplification of exon 4 of the genomic DNA for the a-spectrin chain revealed the appearance of a slower migrating band in the three families studied suggesting the duplication of codon TTG. In one patient with Sp a I/50-46 kDa the sequencing of exon 6 of the a-sp chain showed a point mutation CTG leu - CCG pro in an allele in codon 260. As far as we know, this is the first study of red cell membrane in hereditary elliptocytosis in a brazilian population. The elongated ß -spectrin observed in this study is the second case described in the literature and the truncated ß-spectrin probably corresponds to the smaller ß-sp already described.The study of the spectrin heterodimer self-association was also performed in 26 patients with diseases in which elliptocytes are frequently observed in peripheral blood smears (7 CML, 6 myelofibrosis, 5 iron deficiency anemia, 3 megaloblastic anemia and 5 sickle cell disease). Only one patient with CML had increased IeveIs of the spectrin dimer, which suggested a defect in the spectrin heterodimer self-association / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la frecuencia de sífilis congénita en el Hospital San Juan de Lurigancho durante el período de Enero a Diciembre del 2013. El estudio es descriptivo, de corte transversal. Se estudió 18 recién nacidos diagnosticados con sífilis congénita y sus madres. Se revisó sus historias clínicas, determinándose frecuencias y porcentajes de las variables mediante el programa Microsoft Excel. Se encontró 26 casos de Sífilis Congénita confirmados, de los cuales solo se incluyeron 18 .En cuanto a las pruebas solicitadas, sólo a 2 de ellos se le realizó punción lumbar, a 4 de ellos no se le realizó examen radiológico de huesos largos, y 4 de ellos tuvieron presentaron alteraciones al examen físico. Respecto al tratamiento, 2 de ellos tuvieron dosis insuficiente de penicilina o no recibieron. Por otro lado dentro de antecedentes maternos, sólo 9 de ellas (50%) tuvo un control prenatal suficiente. Respecto al tratamiento, sólo 12 recibieron tratamiento completo. Mientras que sus parejas, solo 3. Se puede concluir que no se cumple un adecuado control prenatal, ni con los exámenes según la normativa dada. Además hay déficit en el tratamiento, vigilancia y prevención en todos sus niveles. / Tesis

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos caracterizados por la muerte, generalmente, progresiva de fotorreceptores y células del epitelio pigmentario retiniano. Las DHR afectan a más de 2 millones de personas en el mundo, produciendo una pérdida parcial y, en muchos casos, total de la visión, para la cual no existe ningún tratamiento que revierta o frene la progresión de la enfermedad. Se caracterizan por una elevada heterogeneidad clínica y genética, identificándose hasta la fecha mutaciones en más de 250 genes responsable de algún tipo de DHR. Esta tesis doctoral se ha centrado en el diagnóstico genético de 208 pacientes afectados de DHR no sindrómica (DHR-NS), mediante secuenciación masiva dirigida a un panel de 117 genes y cinco regiones intrónicas profundas en las que previamente se habían descrito mutaciones. Las variantes identificadas en los pacientes se priorizaron de acuerdo a la mínima frecuencia alélica y se clasificaron según los criterios de la guía del American College of Medical Genetics and Genomics. Las variantes de número de copias identificadas mediante la secuenciación del panel se validaron utilizando multiplex ligation-dependent probe amplification o array genómico. A todos los pacientes se les realizó un estudio oftalmológico, más o menos exhaustivo, incluyendo pruebas electrofisiológicas. Además, se realizaron ensayos in vitro con minigenes para comprobar la repercusión de ciertas variantes sobre el procesamiento del ARNm. Para ello, se empleó el plásmido pSPL3 en el que se introdujo la mutación a estudio, la transformación se realizó en bacterias E. coli electrocompetentes y la transfección en células HEK-293. Mediante la secuenciación del panel de genes, se obtuvo una tasa diagnóstica del 60%. Las mutaciones en los pacientes resueltos se distribuyeron en 30 genes diferentes, de las cuales 38 se describen por primera vez en este trabajo. Los genes mutados con mayor frecuencia en estos pacientes fueron ABCA4, USH2A, RPGR y PRPH2. Adicionalmente, se identificaron ocho variantes de número de copias en los genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 y ROM1, demostrando el enorme potencial de estas tecnologías. En total, se reclasificaron el 10% de las familias estudiadas y se observó variabilidad fenotípica intra e inter familiar en pacientes con mutaciones en C1QTNF5, CERKL y PROM1. Además, destacamos que el 50% de las mujeres heterocigotas para RPGR y sintomáticas presentaron retinosis pigmentaria (RP) con asimetría interocular. Asimismo, se identificó un caso con posible digenismo entre los genes CNGA1 y CNGB1, y la duplicación completa de ROM1 en dos familias no relacionadas diagnosticadas de RP. Por otra parte, se han identificado seis familias con mutaciones en dos genes que potencialmente ambos podrían ser la causa de la DHR. En el ensayo funcional mediante minigenes, se observó que seis de las variantes analizadas presentaron un splicing aberrante. Los resultados de esta tesis destacan la utilidad clínica de la secuenciación masiva dirigida para las DHR-NS y la importancia de un examen oftalmológico completo que nos permita establecer nuevas asociaciones genotipo-fenotipo y ampliar el conocimiento de este grupo de enfermedades. Identificar la causa de la enfermedad es esencial para mejorar el manejo del paciente, realizar un asesoramiento genético preciso y beneficiarse de los futuros tratamientos y ensayosclínicos basados en terapia génica. / [CA] Les distròfies hereditàries de la retina (DHR) són un conjunt de trastorns caracteritzats per la mort, generalment, progressiva de fotoreceptors i cèl¿lules de l'epiteli pigmentari retiniano. Les DHR afecten més de 2 milions de persones al món, produint una pèrdua parcial i, en molts casos, total de la visió, per la qual no hi ha cap tractament que revertisca o frene la progressió de la malaltia. Es caracteritzen per una elevada heterogeneïtat clínica i genètica, identificant-se fins a la data mutacions en més de 250 gens responsable d'algun tipus de DHR. Esta tesi doctoral s'ha centrat en el diagnòstic genètic de 208 pacients afectats de DHR no sindròmica (DHR-NS), per mitjà de seqüenciació massiva dirigida a un panell de 117 gens i cinc regions intròniques profundes en les que prèviament s'havien descrit mutacions. Les variants identificades en els pacients es van prioritzar d'acord a la mínima freqüència allèlica i es van classificar segons els criteris de la guia de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Les variants de nombre de còpies identificades per mitjà de la seqüenciació del panell es van validar utilitzant multiplex ligation-dependent probe amplification o array genòmic. A tots els pacients se'ls va realitzar un estudi oftalmològic, més o menys exhaustiu, incloent proves electrofisiològiques. A més, es van realitzar assajos in vitro amb minigens per comprovar la repercussió de certes variants sobre el processament de l'ARNm. Per a això, es va emprar el plasmidi pSPL3 en què es va introduir la mutació a estudi, la transformació es va realitzar en bacteris E. coli electrocompetentes i la transfecció en cèl-lules HEK-293. Per mitjà de la seqüenciació del panell de gens, es va obtindre una taxa diagnòstica del 60%. Les mutacions en els pacients resolts es van distribuir en 30 gens diferents, de les quals 38 es descriuen per primera vegada en este treball. Els gens mutats amb major freqüència en estos pacients van ser ABCA4, USH2A, RPGR i PRPH2. Addicionalment, es van identificar huit variants de nombre de còpies en els gens EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 i ROM1, demostrant l'enorme potencial d'estes tecnologies. En total, es van reclassificar el 10% de les famílies estudiades i es va observar variabilitat fenotípica intra i inter familiar en pacients amb mutacions en C1QTNF5, CERKL i PROM1. A més, destaquem que el 50% de les dones heterozigotes per RPGR i simptomàtiques van presentar retinosi pigmentària (RP) amb asimetria interocular. Així mateix, es va identificar un cas amb possible digenismo entre els gens CNGA1 i CNGB1, i la duplicació completa de ROM1 en dues famílies no relacionades diagnosticades de RP. D'altra banda, s'han identificat sis famílies amb mutacions en dos gens que potencialment ambdós podrien ser la causa de la DHR. En l'assaig funcional per mitjà de minigens, es va observar que sis de les variants analitzades van presentar un splicing aberrant. Els resultats d'esta tesi destaquen la utilitat clínica de la seqüenciació massiva dirigida per a les DHR-NS i la importància d'un examen oftalmològic complet que ens permeta establir noves associacions genotip-fenotip i ampliar el coneixement d'este grup de malalties. Identificar la causa de la malaltia és essencial per millorar el maneig del pacient, realitzar un assessorament genètic precís i beneficiar-se dels tractaments basats en teràpia gènica. / [EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of disorders generally characterized by the progressive death of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells. IRD affect more than 2 million people in the world, producing a partial and, in many cases, total loss of vision, for which there is no treatment that reverses or slows the progression of the disease. They are characterized by a high clinical and genetic heterogeneity, identifying mutations in more than 250 genes responsible for some type of IRD to date. This doctoral thesis has focused on the genetic diagnosis of 208 patients affected by non-syndromic IRD (NS-IRD), through targeted genomic sequencing focuses on a panel of 117 genes and five deep intronic regions in which mutations have previously been identified. The identified variants in patients are prioritized according to the minimum allelic frequency and are classified according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics guide. The copy number variants identified by panel sequencing were validated using multiplex ligation-dependent probe amplification or genomic array. All patients underwent an ophthalmological study, more or less comprehensive, including electrophysiological tests. In addition, in vitro assays with minigenes were performed to verify the impact of certain variants on mRNA processing. To do this, pSPL3 plasmid in which the mutation was introduced was used, the transformation was performed in electrocompetent E. coli bacteria and transfection in HEK-293 cells. By the panel sequencing, a diagnostic rate of 60% was obtained. The mutations in the resolved patients were distributed in 30 different genes, of which 38 were described for the first time in this work. The most frequently mutated genes in these patients were ABCA4, USH2A, RPGR and PRPH2. In addition, eight copy number variants were identified in the genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 and ROM1, that demonstrated the enormous potential of these technologies. In total, 10% of the families studied were reclassified and intra and inter-family phenotypic variability was detected in patients with mutations in C1QTNF5, CERKL and PROM1. In addition, we highlight that 50% of the symptomatic and heterozygous RPGR women showed retinitis pigmentosa (RP) with interocular asymmetry. Likewise, we identified a case with possible digenism between the CNGA1 and CNGB1 genes, and the complete duplication of ROM1 in two unrelated families diagnosed with RP. On the other hand, six families have been identified with mutations in two genes that could potentially be the cause of IRD. Functional assays by minigenes showed that six of the studied variants affected splicing. The results of this thesis highlight the clinical utility of targeted genomic sequencing in IRD and the importance of a complete ophthalmological examination that allows us to establish new genotype-phenotype associations and expand the knowledge of this group of diseases. Identifying the cause of the disease is essential to improve patient management, to perform an accurate genetic counseling and to take advantage of treatments based on gene therapy. / Rodríguez Muñoz, A. (2020). High-throughput strategies for molecular diagnosis of nonsyndromic inherited retinal dystrophies [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/139095

La empresa familiar es un fenómeno en crecimiento que, en nuestro país, carece de un marco regulatorio propio, por lo que resulta de suma importancia fortalecerla en el ámbito jurídico. El protocolo familiar consiste, así, en una reglamentación escrita, lo más completa y detallada posible, que actúa como marco para las relaciones entre la familia y la empresa, a la vez que establece las reglas de administración, gobierno, prevención y resolución de conflictos. A esto se añade que se debe implementar un sistema para promover una transferencia generacional adecuada,que procure la supervivencia de la empresa tanto en la propiedad como en la gestión.

Magíster en genética / Las paraplejias espásticas hereditarias (PEHs) corresponde a diversos desórdenes genéticos caracterizados por la espasticidad de miembros inferiores y una marcada debilidad muscular debido a una degeneración de los axones más largos en los seres humanos. Los genes más conocidos causantes de las PEHs (atlastina, espastina, VCP) están involucrados en el tráfico intracelular, localización y conformación de organelos membranosos. El gen atlastina (atl) codifica para una GTPasa que media la fusión homotípica en las membranas del retículo endoplásmico (RE). En el tratamiento de PEHs asociadas a mutaciones en atl no se han descrito blancos terapéuticos efectivos ya que inhibir cualquiera de las proteínas asociadas resulta en defectos en la morfogénesis del RE. En Drosophila melanogaster existen genes codificantes para moduladores de la expresión y actividad de atlastina. Como el gen es conservado tanto en humanos como en Drosophila, se utilizó este modelo biológico para identificar genes que modulen su actividad. En esta tesis se rastrearon genes del cromosoma 2 (aproximadamente un 40% del genoma de Drosophila) que actúen como modificadores dominantes del fenotipo asociado a la disminución de la expresión de atl en neuronas motoras. Nuestros resultados indican que existen genes que interactúan con atlastina, destacándose particularmente uno de ellos, en que la proteína codificada por este participa de la vía de señalización de BMP, que juega un rol fundamental en el correcto desarrollo de la unión neuromuscular. Esto es el inicio de una potencial investigación enfocada en encontrar más interactores de atlastina y los mecanismos moleculares que subyacen a estos descubrimientos. / The hereditary spastic paraplegias (HSPs) corresponds to a variety of genetic disorders, characterized by spasticity of the lower limbs and a marked muscle weakness due to degeneration of the longest axons in humans. The best known genes of the HSP (atlastin, spastin, VCP) are involved in intracellular trafficking, localization and formation of membranous organelles. The atlastin (atl) gene encodes a GTPase that mediates homotypic fusion of endoplasmic reticulum (ER) membranes. There have not been described effective therapeutic targets for the treatment of HSPs associated to atl mutations, because the inhibition of any associated proteins results in defects in morphogenesis ER. In Drosophila melanogaster there are genes coding for modulators of expression and activity of atlastin. As this gene is conserved in both humans as in Drosophila, this biological model is used to identify genes that modulate its activity. In this thesis we will screen genes of chromosome 2 (about 40% of the Drosophila genome) that acts as dominant modifiers of the phenotype associated with decreased expression of atl in motor neurons. Our results indicate that there are genes that interact with atlastin, particularly highlighting one of them, in which the protein encoded by this participates of the BMP signaling pathway, which plays a fundamental role in the proper development of the neuromuscular junction. This is the beginning of a potential research focused on finding more interactors of atlastin and the molecular mechanisms underlying these findings.

El síndrome de Lynch (SL) se caracteriza por presentar heterogeneidad genética, pleiotropismo y penetrancia incompleta y variable, sugiriendo la posibilidad de un riesgo poligénico y posiblemente, la implicación de otros genes de cáncer hereditario en familias con fenotipos complejos. La co-ocurrencia de diferentes variantes patogénicas en diferentes genes de predisposición hereditaria a cáncer en un individuo, lo que se conoce con las siglas MINAS, está probablemente infradiagnosticada. La identificación de segundas alteraciones genéticas en línea germinal en genes de cáncer hereditario tiene un importante impacto para el paciente y sus familiares. En esta tesis se realizó un estudio retrospectivo en una cohorte de casos índice de SL para intentar dimensionar esta situación a priori rara o muy rara. Los resultados obtenidos muestran que la prevalencia de más de un alelo patogénico que predispone a cáncer en pacientes con síndrome de Lynch es relevante, entorno al 6% y que la presencia de más de un alelo patogénico en genes de predisposición a cáncer no suele asociarse a las manifestaciones clínicas esperadas de ambos genotipos, en el momento del diagnóstico. Sin embargo, son necesarios más estudios para confirmar estos hallazgos. Por otro lado, la poliposis asociada a la actividad correctora de las polimerasas (PPAP) es otro síndrome de cáncer hereditario. Para este síndrome, existen pocas variantes patogénicas descritas y el fenotipo clínico asociado se basa en un número limitado, pero creciente, de familias descritas. La caracterización molecular exhaustiva y un análisis detallado del fenotipo clínico asociado a variantes patogénicas recurrentes en los genes responsables, podría ayudar a a mejora de la evaluación del riesgo de cáncer en estas familias; permitiendo así mismo ofrecer un seguimiento más personalizado y eficiente. Por ello, realizamos un estudio para intentar establecer el carácter fundador, el fenotipo clínico asociado y la penetrancia de la variante patogénica, no descrita previamente (POLD1:c.1421T>C; p.Leu474) e identificada dentro del Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad Valenciana en cuatro familias aparentemente no relacionadas. Los resultados obtenidos establecieron el carácter fundador de la variante de interés, con un haplotipo común de unas 3Mb, siendo la primera variante patogénica con carácter fundador identificada en el gen POLD1 y además el fenotipo clínico de la variante coincide a priori con el del SL.