Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.

FIGUEIREDO, Ítalo Leite. Separação materna prolongada induz desnutrição e inflamação sistêmica com deficiência de igf-1 e leptina e alterações hipocampais em camundongos lactentes. 145 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas)- Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Eliene Nascimento (elienegvn@hotmail.com) on 2015-10-27T13:35:14Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_ilfigueiredo.pdf: 2768416 bytes, checksum: 7d1870d3391b21936ed36fc5f2c93abd (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2015-10-27T13:35:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_ilfigueiredo.pdf: 2768416 bytes, checksum: 7d1870d3391b21936ed36fc5f2c93abd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-27T13:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_ilfigueiredo.pdf: 2768416 bytes, checksum: 7d1870d3391b21936ed36fc5f2c93abd (MD5) Previous issue date: 2015 / A separação materna prolongada (SMP) pode causar uma desnutrição energético-proteica devido à restrição do leite materno, o que pode levar a alterações no hipocampo, além de afetar a barreira intestinal, induzindo translocação bacteriana e inflamação sistêmica. Um estudo recente mostrou uma correlação negativa entre marcadores inflamatórios sistêmicos e níveis séricos do fator de crescimento insuliniforme 1 (IGF-1) em crianças desnutridas com baixa estatura. Contudo, ainda há uma lacuna no conhecimento quanto ao impacto da inflamação sistêmica no desenvolvimento do hipocampo em animais desnutridos. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito da SMP no desenvolvimento físico, na ontogenia de alguns reflexos neonatais e nas alterações hipocampais em camundongos C57BL/6J, incluindo alterações morfológicas, neuroquímicas e expressão de marcadores de plasticidade cerebral, incluindo sinaptofisina (SYN) e proteína básica de mielina (PBM). Um segundo objetivo desse estudo foi avaliar o efeito na SMP nos níveis séricos de corticosterona, IGF-1, leptina e adiponectina e de uma proteína de fase aguda, a proteína C reativa (PCR), essa última como um marcador de inflamação sistêmica. A SMP foi induzida isolando metade dos filhotes de sua mãe em cada ninhada por períodos definidos (4h no dia 4, 8h no dia 5, e 12h nos demais dias) numa gaiola incubadora. Medições diárias de peso e comprimento de cauda foram realizadas, sendo a última como marcador de crescimento linear. Testes para avaliar reflexos neonatais incluindo recuo do abismo (cliff avoidance), correção da posição (surface righting), comportamento de nado (swimming behavior) e imobilidade dorsal (dorsal immobility) foram realizados nos dias 6, 8, 10, 12 e 14. No dia 14, os filhotes foram sacrificados por decapitação para obtenção do sangue para as análises hormonais e PCR no soro através de ELISA; e coleta de hipocampo para dosagens de aminoácidos por HPLC; imuno-histoquímica para SYN; e expressão de SYN e PBM no tecido encefálico por western blot. Uma parte dos animais foi submetida à perfusão transcardíaca com solução fixadora para análises estereológicas. A SMP induziu uma desnutrição com redução significativa do ganho de peso corporal (a partir do sexto dia) e do comprimento da cauda (a partir do décimo primeiro dia) (p<0,05). A avaliação do comportamento revelou diferenças entre os grupos nos testes de correção da posição e imobilidade dorsal (p<0,05). Na estereologia, foram observadas diferenças no volume total e no volume da camada de células piramidais de CA3 nos animais submetidos à SMP quando comparados com o grupo controle não separado (CNS) (p<0,05). A dosagem de aminoácidos indicou menor concentração de aspartato, glutamato, glicina e GABA nos animais do grupo SMP quando comparado ao CNS (p<0,05). Os animais do grupo CNS apresentaram maior marcação para SYN quando comparado ao grupo SMP. A SMP reduziu os níveis leptina e IGF-1, bem como nos níveis séricos de PCR (P<0,05). Em conjunto, esses resultados sugerem que a SPM causa inflamação sistêmica, com redução dos níveis séricos de leptina e IGF-1, déficits de crescimento e comportamentais e alterações na estrutura e atividade neuroquímica do hipocampo.

Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.

Uma das principais características do hipocampo após a isquemia é a vulnerabilidade diferencial das células da região CA1 e DG à morte celular. Os neurônios granulares do DG são resistentes, enquanto que os neurônios piramidais da região CA1 são mais sensíveis. Nosso objetivo nesse estudo foi investigar o possível envolvimento da via de sinalização celular PI3K, uma via que possui efeito proliferativo e antiapoptótico, e das proteínas de choque térmico (HSPs) no fenômeno da vulnerabilidade seletiva. Para isso foram usadas culturas organotípicas de hipocampo de ratos Wistar de 6-8 dias. As culturas foram tratadas com o inibidor da PI3K, LY294002 (LY), nas doses 10μM e 50μM. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo e da atividade das caspases 3 e 7. Alterações na fosforilação e no imunoconteúdo das proteínas foram obtidas com o uso de anticorpos específicos. Os resultados mostraram que a região do DG parece responder de forma tempo dependente e precocemente à presença da droga, sugerindo uma importância da via nessa região. Para investigar se a proteína AKT, uma cinase ativada por PI3K, estava envolvida na vulnerabilidade seletiva das células às condições de privação de oxigênio e glicose (POG), medimos a fosforilação e o imunoconteúdo dessa cinase após 60 minutos de POG seguida dos tempos de recuperação de 30 minutos, 6 horas e 24 horas. Nenhuma alteração foi observada nesses parâmetros, sugerindo que , nesse caso, a fosforilação da AKT não está envolvida na vulnerabilidade seletiva. Quando o imunoconteúdo da HSP27 e da HSP70 foi investigado após as condições de POG em ambas as áreas do hipocampo, não foi observada nenhuma alteração na HSP27 nos tempos de recuperação escolhidos. Por outro lado, observou-se aumento no imunoconteúdo da HSP70 em ambas as regiões 24 horas após a exposição às condições de POG, sendo este maior no CA1. Quando as quantidades das HSPs nas duas regiões em condições basais foram comparadas, observou-se que ambas estão em maior quantidade na região do DG. Esta diferença poderia estar relacionada com a resistência à morte celular observada no DG, uma vez que, possuindo maior quantidade HSPs, estas poderiam atuar como protetoras contra a morte. Esses resultados sugerem que a via de sinalização da PI3K pode estar envolvida na vulnerabilidade seletiva observada no hipocampo em resposta à condições de POG, e esta não envolve alterações na fosforilação da AKT. Por outro lado, HSP27 e HSP70 podem estar envolvidas no fenômeno da vulnerabilidade seletiva, protegendo o DG das lesões. / One of the main characteristics of hippocampus after ischemic episodes is the different vulnerability to cell death of cells from CA1 and from DG areas. DG granular neurons are resistant while CA1 pyramidal neurons are more vulnerable. Our intent in this study was to investigate a possible involvement of PI3K pathway and HSPs in the selective vulnerability phenomenom. For these purposes we used organotypic hippocampal cultures from 6-8 days old Wistar rats. Our first focus was PI3K, a known proliferative and antiapoptotic pathway. The cultures were exposed to treatment with LY294002 (LY), a PI3K inhibitor, in doses 10μM and 50μM. Cellular death was assessed by propidium iodide uptake and mesurement of caspase 3 and 7 activity. The results showed an effect time and dose dependent, always with earlier cellular death in DG area, suggesting the importance of this pathway in this region. To investigate if AKT protein, a downstream kinase in PI3K pathway, was involved in selective vulnerability of cells after oxygen and glucose deprivation (OGD) conditions, we measured the phosphorylation and imunocontent of this protein after 60 minutes of OGD, followed by to 30 minutes, 6 hours and 24 hours of reperfusion. No alterations were observed in this parameters, suggesting that, in this case, phosphorylation of AKT is not involved in the selective vulnerability. When we investigate HSP27 and HSP70 imunocontent after OGD conditions in both areas of hippocampus, we observed no alterations in HSP27 in these reperfusion times. Interestingly, HSP70 showed an imunocontent increase in both areas 24 hours after the insult, with higher levels in CA1 area. Comparing basal level of HSPs in CA1 and DG we observe that both proteins are higher in DG area. The difference could explain why DG area is more resistant to cell death, once there are more HSPs blocking cell death. These results are pointing that PI3K is involved in selective vulnerability of hippocampus in a way that does not require AKT phosphorylation. On the oder hand, HSP27 and HSP70 may be involved in this phenomenom, protecting DG from insults.

O envelhecimento é um fator de risco para o desenvolvimento de alterações estruturais e funcionais associadas a doenças neurodegenerativas. A perda de neurônios em conjunto com alterações das conexões neurais, principalmente no hipocampo, tem sido associada ao declínio cognitivo no envelhecimento, e várias alterações neuroquímicas moduladas pela ação de hormônios neuroendócrinos parecem participar desse processo. Realmente, prejuízos na sinalização cerebral de insulina têm sido envolvidos na etiologia dos prejuízos cognitivos e de doenças neurodegenerativas. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração intracerebroventricular (ICV) de insulina na memória espacial, plasticidade mitocondrial e de células neurais. Ratos Wistar machos (jovens: 4 meses e velhos: 24-26 meses; n=10-12) foram tratados com insulina ICV (20mU) ou veículo uma vez ao dia durante 5 dias. A insulina aumentou os níveis extracelulares de lactato no hipocampo de animais jovens, mas não nos animais velhos. A produção de H2O2 mitocondrial, estimulada por succinato, diminuiu no grupo velho-insulina, em relação aos outros grupos. Além disso, o imunoconteúdo da proteína estimuladora de biogênese, PGC1-α, aumentou em animais jovens tratados com insulina. A insulina também melhorou o desempenho dos animais jovens na tarefa do Labirinto Aquático de Morris e aumentou os níveis hipocampais de BDNF nesses animais. A insulina modulou de maneira distinta a morfologia das subregiões CA1, CA3 e GD em animais jovens e velhos, mas aumentou a neurogênese em CA1 e CA3 somente nos animais velhos. Em resumo, o envelhecimento diminuiu a sensibilidade hipocampal à insulina no que se refere ao metabolismo do lactato, biogênese, BDNF e neuroplasticidade (número de células neurais e neurogênese). Entretanto, a administração de insulina ICV foi efetiva em aumentar a neuroplasticidade hipocampal no envelhecimento. / Aging is a risk factor for the development of brain structural and functional alterations associated with neurodegenerative disorders. The loss of neuronal cells along with the disruption of neural systems, mostly in the hippocampus, has been implicated in the cognitive decline associated with aging. A multitude of neurochemical changes modulated by neuroendocrine hormones may participate in this process. Indeed, impaired brain insulin/insulin receptor (IR) signaling that occurs through central insulin resistance is involved in the etiology of cognitive dysfunction and neurodegenerative disorders. The main goal of this study was to assess the effects of intracerebroventricular (ICV) insulin on spatial memory and mitochondrial and neural plasticity in aged rats. Male Wistar rats (young: 4 months and aged: 24-26 months; n= 10-12) were given ICV injections of insulin (20 mU) or vehicle daily over the course of five days. Insulin significantly increased extracellular fluid lactate levels in the hippocampus of young but not in aged rats. Mitochondrial H2O2 production induced by succinate was decreased in aged-insulin group relative to other groups. In addition, the immunocontent of mitochondrial PGC1-α, a biogenesis-stimulate protein, was increased by insulin administration in young animals. Insulin ICV improved spatial memory in the Water Maze task and hippocampal BDNF levels only in young animals. Insulin differentially modulated the hippocampal CA1, CA3 and DG morphology of young and aged rats but increased neurogenesis in CA1 and CA3 regions of aged animals. In summary, aging decreased hippocampal insulin sensitivity regarding lactate metabolism, mitochondrial biogenesis, BDNF expression and neuroplasticity (cell counts and neurogenesis). However, ICV insulin administration was effective in improving neuroplasticity in the hippocampus of aged rats.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434469-Texto+Completo-0.pdf: 522845 bytes, checksum: 1a6aa11b2380d6b39eabb139c21770ae (MD5) Previous issue date: 2011 / The nonreinforced expression of long-tem memory may lead to two opposite protein synthesis-dependent processes: extinction and reconsolidation. Extinction weakens consolidated memories, whereas reconsolidation allows incorporation of additional information into them. Knowledge about these two processes has accumulated in recent years, but their possible interaction has not been evaluated yet. Here, we report that inhibition of protein synthesis and gene expression in the CA1 region of the dorsal hippocampus after retrieval of fear extinction impairs subsequent reactivation of the extinction memory trace without affecting its storage or that of the initial fear memory. Our results suggest that extinction memory is susceptible to a retrieval-induced process similar to reconsolidation in the hippocampus. / A expressão de uma memória já consolidada pode levar à ocorrência de dois processos opostos, que requerem a síntese de novo de proteínas nas mesmas áreas do cérebro: a extinção e a reconsolidação. A extinção debilita a expressão da memória original, enquanto que a reconsolidação permite a incorporação de nova informação a ela. O conhecimento acerca destes dois processos acumulou-se durante os últimos anos, porém a possível interação entre ambos ainda não foi avaliada. Neste trabalho demonstramos que a inibição da síntese protéica e expressão gênica hipocampal imediatamente após a reativação prejudicam a expressão da memória de extinção sem afetar a memória original aversiva. A partir desses dados, sugere-se que, assim como a reconsolidação, a memória de extinção após a reativação também requer a participação de síntese protéica e expressão gênica para sua manutenção na região CA1 do hipocampo.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / O empinar (rearing) tem sido considerado um comportamento exploratório gerado pela novidade de um ambiente.Dados de literatura demonstram que o hipocampo é uma das regiões cerebrais envolvidas na geração do comportamento de empinar.Em trabalhos anteriores observamos que ratos machos,adultos,da linhagem Wistar, selecionados no teste do Campo Aberto,em subgrupos de baixo empinar e alto empinar,diferem na susceptibilidade a convulsões clônicas induzidas pela DMCM,uma droga agonista inversa benzodiazepínica,e na atividade da Na+/K+-ATPase no hipocampo.Os dados,além de indicarem o envolvimento da Na+/K+-ATPase hipocampal no comportamento de empinar, indicam uma possível diferença na neurotransmissão gabaérgica hipocampal,envolvendo o sítio alostérico benzodiazepínico do receptor GABAA,já que convulsões clônicas podem ser geradas pela estimulação química ou elétrica do hipocampo.Entre outros,o objetivo deste trabalho foi verificar se os subgrupos de alto e baixo empinar,seleciondados no teste do campo aberto,diferem na excitabilidade neuronal do hipocampo medida:pela diferença da densidade da Na+/K+-ATPase hipocampal e pela neurotransmissão inibitória gabaérgica(por meio da determinação do número e afinidade do sítio benzodiazepínico no receptor GABAA e do tempo de sono com drogas que se ligam em diferentes sítios desse receptor).Foi também avaliada a possibilidade de uma diferença entre os subgrupos na neurotransmissão excitatória glutamatérgica hipocampal(pela ligação da MK801,uma droga antagonista do receptor NMDA).Além disso,os subgrupos foram observados em outros teste comportamentais,com o intuito de verificar se o comportamento de empinar se mantém inalterado nesses outros modelos e se estaria relacionado com a‘ansiedade’e‘depressão’.Ratos com diferentes idades e nascidos em diferentes meses e anos foram observados no Campo Aberto com o intuito de verificar se o empinar é influenciado pela idade e por mudanças sazonais.Também foi realizada uma análise hormonal para verificar se há diferença entre esses subgrupos quanto a ativação dos eixos hipófise-adrenal(HPA)e hipófise-gonadas(HPG),ambos envolvidos na resposta ao estresse.Os resultados comportamentais obtidos indicam que o comportamento de empinar se mantém inalterado com a idade e que o padrão comportamental é o mesmo nos diferentes testes. Além disso,foi possível verificar que esses subgrupos selecionados pelo comportamento de empinar não diferem na‘ansiedade’medida pelo Campo Aberto,Labirinto em Cruz Elevado e Labirnto em T Elevado e nem na‘depressão’verificada no teste da Natação Forçada.Quanto à excitabilidade neuronal,foi determinada uma diferença entre os subgrupos na afinidade e densidade do sítio alostérico benzodiazepínico do receptor GABAA(o subgrupo baixo empinar apresenta maior afinidade e menor densidade desse sítio quando comparado ao subgrupo alto empinar)e no tempo de sono induzido pelo diazepam(tempo de sono do subgrupo baixo empinar foi maior que do subgrupo alto empinar).A ligação da [3H]-Ouabaína determina o número de moléculas da Na+/K+-ATPase presente nas membranas.Não foi encontrada diferença na curva de saturação da[3H]-Ouabaína,mas foi encontrada diferença na concentração do ligante nM entre os subgrupos quando a concentração do ensaio da [3H]-Oubaína foi de 1200 nM .Com relaçãoao ensaio de ligação com o[3H]-MK-801(4,6 nM)não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os subgrupos.Os subgrupos também parecem responder de forma semelhante ao estresse,já que não apresentam diferença entre si nos testes hormonais.Os resultados obtidos mostrando diferença na afinidade e no número de receptores GABAA hipocampais indicam que os subgrupos de ratos baixo empinar e alto empinar diferem na omposição das subunidades do receptor GABAA.Os dados da ligação da[3H]-Ouabaína indicam que a diferença na atividade Na+/K+-ATPase no hipocampo parece estar relacionada a diferença de densidade e/ou afinidade das isoformas de baixa afinidade à ouabaína.. / Rearing is an exploratory behavior induced by novelty, such as exposure to an open field. Several data in the literature point to an involvement of hippocampus in the rearing behavior. Our previous work has shown that adult male Wistar rats, selected in the open field test according to the number of rearings as low (LR) and high (HR) responders, can differ with respect to clonic convulsions induced by DMCM, a benzodiazepine inverse agonist, as well as in the activity of Na+ /K+ -ATPase in the hippocampus. These data suggest the involvement of hippocampal Na+ /K+ -ATPase and of the GABAA/benzodiazepine alosteric site receptor in the rearing behavior. Therefore, the aim of this study was to verify if HR and LR rearing subgroups of rats selected in the open field test would differ in the hippocampus electrical excitability mediated through activity of Na+ /K+ -ATPase (binding experiments with ouabain, a specific inhibitor of the enzyme), GABAergic neurotransmission (experiments of the binding to the GABAA/benzodiazepine alosteric site receptor in the hippocampus as well as sleeping time with drugs acting in the GABAA receptor through of the several sites of the binding) and glutamatergic neutransmission (binding with MK-801, a NMDA antagonist). Furthemore, we tested whether LR and LRA differ in measures of anxiety in the elevated plus-maze and the elevated t-maze, in measures of depression in the forced swimming test. Animals outbred in several years and tested in different months of the year were observed in the open field test to verify if differences between LR and HR depend on the year´s season and of the age. The hormonal analysis was realized to verify if the subgroups differs in the HPA and HPG axis envolved in the stress responsiveness. The data obtained in this study showed that the mean number of rearings in the open field test in our outbred Wistar stock of adult rats is highly reproductible . This is shown by using rats from different age and tested in different times of the year. The difference in the mean rearings number between selected HR and LR subgroups was also showed to be very consistent throughout the several selections carried out and several behavioral tests. The subgroups did not differ in the anxiety, depression or levels hormonals. The BR subgroup presented a lower sleeping time induced by diazepam compared to the HR subgroup, and did not differ in the sleeping time induced by pentobarbital and ethanol.Concearning the biochemical experiments, it was observed a lower affinity and higher density of [3H]-flunitrazepam in the hippocampus in the HR subgroup, but the subgroups did not differ in the binding of [3H]-MK 801 in the hippocampus. The higher binding in the hipocampus of HR rats in the 1200 nM [3H]Ouabain, but absence of differences in the Bmax and Kd determined for the saturation curve of the ouabain binding sites, suggest the involvement of the low-affinity isoenzimes in the inter-individual differences in rearing behaviour. To conclude, the data obtained suggest that inter-individual differences in rearing behaviour is related to the level of brain excitability controlled by GABAergic neurotransmission and by activity of Na+/K+-ATPase located in the hippocampus. / FAPESP: 05/60297-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Distintas evidências indicam que os endocanabinóides estão envolvidos no processamento de memórias. No entanto, a participação dos distintos subtipos de receptores canabinoides na memória de reconhecimento não é, ainda, muito clara. Esta Dissertação tem como objetivo avaliar as conseqüências da ativação dos receptores canabinóides hipocampais na consolidação da memória de reconhecimento de objetos. Com este intuito, ratos com cânulas estereotáxicamente implantadas na região CA1 do hipocampo dorsal foram treinados em uma tarefa de reconhecimento utilizando dois objetos estímulo. A retenção da memória foi avaliada em diferentes tempos após o treino. Para isto, na sessão de teste, um dos objetos apresentados durante o treino foi substituído por um objeto novo. Quando infundidos na região CA1 imediatamente após o treino, o agonista canabinóide não seletivo WIN-55,212-2, e o inibidor da recaptação celular de endocanabinóides VDM-11, impediram a retenção da memória de longa duração de reconhecimento de maneira dose-dependente sem, no entanto, afetar a memória de curta duração, a atividade exploratória e locomotora, o estado de ansiedade nem a integridade funcional do hipocampo. Os efeitos do WIN- 55,212-2 e VDM-11 foram completamente revertidos pela co-infusão de AM 251, um antagonista seletivo dos receptores CB1. Ainda, o agonista dos receptores CB1 ACEA, mimetizou os efeitos de WIN-55,212-2 e VDM-11, entanto que a administração intrahipocampal de dois agonistas diferentes dos receptores CB2, JWH-015 e palmitoiletanolamida, não tiveram efeito algum na retenção da memória em questão. Estes dados indicam que a ativação de receptores CB1 hipocampais imediatamente após o treino bloqueia a consolidação da memória de reconhecimento de objetos. / Evidence indicates that brain endocannabinoids are involved in memory processing. However, the participation of CB1 and CB2 cannabinoid receptors in recognition memory has not been yet conclusively determined. Therefore, we evaluated the effect of the posttraining activation of hippocampal cannabinoid receptors on the consolidation of object recognition memory. Rats with infusion cannulae stereotaxically aimed to the CA1 region of the dorsal hippocampus were trained in an object recognition learning task involving exposure to two different stimulus objects. Memory retention was assessed at different times after training. In the test session, one of the objects presented during training was replaced by a novel one. When infused in the CA1 region immediately after training, the non-selective cannabinoid receptor agonist WIN-55,212-2 and the endocannabinoid membrane transporter inhibitor VDM-11 blocked long-term memory retention in a dose-dependent manner without affecting short-term memory, exploratory behavior, anxiety state or the functionality of the hippocampus. The amnesic effect of WIN-55,212-2 and VDM-11 was completely reversed by co-infusion of the CB1 receptor antagonist AM-251 and mimicked by the CB1 receptor agonist ACEA but not by the CB2 receptor agonists JWH-015 and palmitoylethanolamide. These data indicate that activation of hippocampal CB1 receptors early after training hamper consolidation of object recognition memory.

Magister en neurociencias / El gen klotho fue descrito a finales del siglo pasado como el “gen del envejecimiento”, pues su ausencia gatillaba en ratones un fenotipo de progeria y su sobre-expresión extendía la expectativa de vida hasta en un 30,8%. Con los años de investigación se descubrió que es una pieza clave de un nuevo eje endocrino entre hueso y riñón para la regulación de la homeostasis mineral. Sin embargo, en los últimos años, creciente evidencia empieza a explorar su rol en el sistema nervioso sobre cognición tanto en animales como en el ser humano en el contexto de sub o sobre-expresión sistémica. En la presente tesis desarrollamos la hipótesis que Klotho juega un rol importante en memoria y para ello montamos un experimento de memoria espacial denominado oasis maze, que es equivalente al Morris water maze, para evaluar la capacidad de aprendizaje en animales con una expresión disminuida de klotho únicamente en su hipocampo. Esto último lo conseguimos mediante la expresión local de un shRNA interferente de klotho gracias a la inyección, mediante cirugía estereotáxica, de un vector lentiviral para dicho interferente. Nuestros resultados confirman la hipótesis al demostrar que los animales que presentan una menor expresión de klotho demuestran un peor desempeño en el oasis maze vs control de inyección sin interferente y control sin inyección. Aún más, para fortalecer estos resultados, estos mismos animales fueron expuestos a una configuración random del oasis maze donde la memoria espacial se vuelve innecesaria para completar la tarea. En esta configuración fue evidente la pérdida de la diferencia entre grupos. Indicando de esta manera que el deterioro en cognición detectado en nuestra investigación es producto de un déficit en memoria espacial.

O envelhecimento é um fator de risco para o desenvolvimento de alterações estruturais e funcionais associadas a doenças neurodegenerativas. A perda de neurônios em conjunto com alterações das conexões neurais, principalmente no hipocampo, tem sido associada ao declínio cognitivo no envelhecimento, e várias alterações neuroquímicas moduladas pela ação de hormônios neuroendócrinos parecem participar desse processo. Realmente, prejuízos na sinalização cerebral de insulina têm sido envolvidos na etiologia dos prejuízos cognitivos e de doenças neurodegenerativas. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração intracerebroventricular (ICV) de insulina na memória espacial, plasticidade mitocondrial e de células neurais. Ratos Wistar machos (jovens: 4 meses e velhos: 24-26 meses; n=10-12) foram tratados com insulina ICV (20mU) ou veículo uma vez ao dia durante 5 dias. A insulina aumentou os níveis extracelulares de lactato no hipocampo de animais jovens, mas não nos animais velhos. A produção de H2O2 mitocondrial, estimulada por succinato, diminuiu no grupo velho-insulina, em relação aos outros grupos. Além disso, o imunoconteúdo da proteína estimuladora de biogênese, PGC1-α, aumentou em animais jovens tratados com insulina. A insulina também melhorou o desempenho dos animais jovens na tarefa do Labirinto Aquático de Morris e aumentou os níveis hipocampais de BDNF nesses animais. A insulina modulou de maneira distinta a morfologia das subregiões CA1, CA3 e GD em animais jovens e velhos, mas aumentou a neurogênese em CA1 e CA3 somente nos animais velhos. Em resumo, o envelhecimento diminuiu a sensibilidade hipocampal à insulina no que se refere ao metabolismo do lactato, biogênese, BDNF e neuroplasticidade (número de células neurais e neurogênese). Entretanto, a administração de insulina ICV foi efetiva em aumentar a neuroplasticidade hipocampal no envelhecimento. / Aging is a risk factor for the development of brain structural and functional alterations associated with neurodegenerative disorders. The loss of neuronal cells along with the disruption of neural systems, mostly in the hippocampus, has been implicated in the cognitive decline associated with aging. A multitude of neurochemical changes modulated by neuroendocrine hormones may participate in this process. Indeed, impaired brain insulin/insulin receptor (IR) signaling that occurs through central insulin resistance is involved in the etiology of cognitive dysfunction and neurodegenerative disorders. The main goal of this study was to assess the effects of intracerebroventricular (ICV) insulin on spatial memory and mitochondrial and neural plasticity in aged rats. Male Wistar rats (young: 4 months and aged: 24-26 months; n= 10-12) were given ICV injections of insulin (20 mU) or vehicle daily over the course of five days. Insulin significantly increased extracellular fluid lactate levels in the hippocampus of young but not in aged rats. Mitochondrial H2O2 production induced by succinate was decreased in aged-insulin group relative to other groups. In addition, the immunocontent of mitochondrial PGC1-α, a biogenesis-stimulate protein, was increased by insulin administration in young animals. Insulin ICV improved spatial memory in the Water Maze task and hippocampal BDNF levels only in young animals. Insulin differentially modulated the hippocampal CA1, CA3 and DG morphology of young and aged rats but increased neurogenesis in CA1 and CA3 regions of aged animals. In summary, aging decreased hippocampal insulin sensitivity regarding lactate metabolism, mitochondrial biogenesis, BDNF expression and neuroplasticity (cell counts and neurogenesis). However, ICV insulin administration was effective in improving neuroplasticity in the hippocampus of aged rats.