In France, road transport accounts for 50% and 30% of the NOx and CO2 emissions respectively. Asphalt recycling consists in including Reclaimed Asphalt Pavement (RAP) into new Asphalt Concrete. This technique can allow firms in the road construction field to reduce their impacts on the environment and thus to achieve the goals set by the European Commission. Unfortunately, asphalt recycling just began to have more importance in France. Additionally, the lack of easily available data and studies about this method makes it complicated to enhance the development of asphalt recycling. The thesis aimed to picture a good overview of the current asphalt recycling practices in France and to analyze them from an environmental point of view. The main attention was concentrated on GreenHouse Gases (GHGs) emissions and energy consumptions of those techniques. Moreover, the thesis tried to describe the main advantages and drawbacks of the different asphalt recycling techniques in order to understand their proportions in France. The study also aimed to learn from the experiences of other regions by comparing the French practices with other European countries and analyzing these differences. The methodology used is literature review, interviews and use of a Life Cycle Assessment (LCA) tool: asPECT.  The literature review provided all the theoretical background needed to understand asphalt recycling and also data about its impacts on the environment. In order to add a current component that reflects the reality of road constructions firms, data was also collected with interviews and interpreted with the LCA tool. Finally, the LCA approach was used to compare and analyze all the results collected by providing the necessary simplifications. Study results show that France increased its proportion of RAP recycled significantly lately to reach 63%. The main two asphalt recycling techniques used are Hot In-Plant recycling and Cold In-Place Recycling (CIR). CIR is the most environmental friendly asphalt recycling technique, reaching a reduction of 80% in GHGs emissions and energy consumptions compared to a classical rehabilitation method. Hot In-Plant recycling only allows a reduction of approximately 30% in the same environmental factors. Thanks to those techniques 113 000 tons of CO2e and 10,3 * 105 GJ have been saved in 2010. Asphalt recycling also enables making economic profits and improving social conditions. However, pollutants, tar or asbestos contaminated asphalt, haulage distance limit the development of asphalt recycling in France. It was also observed that France is behind its neighbors but is catching up lately. The main reasons for this delay are the aggregates’ supplies; the number of plants fit for recycling and the legislation about waste disposal and RAP recycling rates. It was concluded that to enhance the use of asphalt recycling in France, French authorities, research centers, road construction firms and certification organisms have to cooperate and work together in order to stem the main drawbacks of asphalt recycling, settle the LCA problems, to win the trust of the State and the firms and to increase the competition.

This thesis investigates the application of In-Situ Recycling and provides guidelines for localities to aid in the selection of recycling methods, as well as documents a local government's experience with Cold In-Place Recycling. The recycling methods discussed in this study include Cold In-Place Recycling (CIR), Hot In-Place Recycling (HIR), and Full Depth Reclamation (FDR). These methods are performed onsite and in-place in a continuous process of milling, mixing, and placement. The In-Situ Recycling guidelines include suggestions based on: traffic characteristics, existing road condition, distress types, road access, local climate, road geometry, and other road characteristics. The guidelines are based on information from sources including NCHRP Synthesis 421, American Recycling and Reclamation Association (ARRA), FHWA, and state agencies with recycling experience. This study also resulted in documenting obstacles that localities may face when in-situ recycling, as well as the impact of limited experience with recycling. The study also evaluated the construction of Cold In-Place Recycled pavement sections in Christiansburg, VA, using Falling Weight Deflectometer (FWD) and Ground Penetrating Radar (GPR). Additionally, using the FWD and GPR data, alternate recycled designs were proposed in addition to a cost comparison to a conventional design. / Master of Science

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones. / Nucleosome assembly entails a controlled mechanism that is tightly coupled to DNA and histone synthesis during DNA replication and repair in S-phase. Importantly, this contributes to the prompt and carefully orchestrated assembly of newly replicated DNA into chromatin, which is essential for the maintenance of genomic integrity. This thesis describes the mass spectrometric characterization of proteins critical in the regulation of nucleosome assembly behind the replication fork and chromatin structure. More specifically, the phosphorylation of Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), a nucleosome assembly factor that uniquely functions during replication-coupled de novo nucleosome assembly in S-phase and the Hir protein complex, a second nucleosome assembly factor that also contributes to the transcriptional regulation of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage, was examined. We first demonstrated that characterization of protein phosphorylation by mass spectrometry (MS), which often relies on the separation of proteins by gel electrophoresis followed by silver staining for visualization, should be given careful considerations. In chapter 2, we report a potential pitfall in the interpretation of phosphorylation modifications due to the artifactual sulfation of serine, threonine and tyrosine residues caused by a specific reagent used during silver staining. Sulfation and phosphorylation both impart an 80 Da addition of these residues making them distinguishable only with MS systems offering high resolution and high mass accuracy capabilities. Chapter 3 and 4 present the MS characterization of in vivo phosphorylation occurring on CAF-1 and Hir proteins, respectively. We first demonstrated that Cac1, the largest subunit of CAF-1, is phosphorylated on several novel residues containing the consensus sequences recognized by either Cdc7-Dbf4 (DDK) or cyclin-dependent kinases(CDKs). These results have provided the first evidence that CAF-1 is regulated by these two kinases in vivo. The function of all identified Cac1 phosphorylation sites was then assessed. In vivo phenotypic studies showed that the specific phosphorylation of Ser-503, a Cac1 DDK-like site identified in our study, is essential for heterochromatin-mediated telomeric silencing. Cac1-Ser-503 did not appear to be required for other known functions of CAF-1, including DNA damage resistance and mitotic chromosom segregation, indicating that blocking Cac1 phosphorylation on Ser-503 sepcifically cripples CAF-1 function at telomeres. Next, biochemical purifications identified a physical interaction between CAF-1 and Cdc7-Dbf4. Consistent with this physical interaction data, in vitro kinase assay studies showed that Cdc7-Dbf4 specifically phosphorylates Cac1 Ser-503 thereby uncovering a novel role for Cdc7-Dbf4 in heterochromatin assembly and/or stability that is potentially mediated through CAF-1. Finally, MS analysis also showed that the Hpc2 subunit of the Hir protein complex is phosphorylated on several CDK- and DDK-like consensus sites. Furthermore, MS quantification of a specific phosphorylation site,Hpc2 Ser-330, was shown to be highly induced following the activation of the DNA damage checkpoint in response to DNA damage. We show that Hpc2 Ser-330 is phopshorylated by checkpoint kinases in a Mec1/Tel1- and Rad53-dependent manner. Our preliminary data suggest that the ability of the Hir protein complex to regulate the transcriptional repression of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage is mediated through the regulated phosphorylation of Hpc2 by these kinases. Finally, these two studies highlight the importance of mass spectrometry in characterizing protein phosphorylation events, which has yielded novel insights into the regulation of chromatin assembly by CAF-1 and histone synthesis mediated by Hir proteins.

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain. / The chromatin is a complex structure and its plasticity is essential to complete different fundamental cellular processes such as DNA replication, transcription and repair. Furthermore, chromatin malfunction is often associated with cancer emergence. The focus of this thesis will be on the function and regulation of histones, as they are essential components of nucleosomes and they ensure proper chromatin formation. Chapter II of this thesis focuses on the transcriptional repression of histone genes by the HIR (HIstone gene Repressor) complex in response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. When DNA damage occurs in early S phase, the DNA damage checkpoint kinases Mec1, Tel1 and Rad53 block late origins of replication to limit potentially mutagenic or cytotoxic collisions between DNA polymerases and remaining DNA lesions. When the total DNA synthesis rate drops suddenly in S- phase, following the checkpoint control activation, accumulation of newly synthesized histones becomes detrimental for the cells because free histones bind non-specifically to nucleic acids. One mechanism that contributes to a reduction in free histones at this time is the repression of histone gene transcription; however, the molecular basis of this repression was not known. Our study on histone gene repression in response to genotoxic agents allowed us to identify the checkpoint kinases as major players in the repression of histone genes. Before initiating this project, it was known that the HIR complex is required to repress histone genes in G1 and G2/M phases and during DNA damage. Nonetheless, HIR complex regulation was not well characterized. We demonstrated by mass spectrometry (MS) analyses that Rad53 regulates the HIR complex by directly phosphorylating one of its subunits, Hpc2, at many residues in vivo and in vitro. Hpc2 phosphorylation is essential to recruit the RSC complex (Remodels the Structure of Chromatin) to histone gene promoters where its presence correlates with histone gene repression. Moreover, we uncovered a novel mechanism for the HIR complex regulation during a normal cell cycle progression and in response to genotoxic agents. Indeed, during a normal cell cycle, the Hpc2 protein is very unstable at the G1/S transition to allow histone gene transcription and production of a pool of newly synthesized histones just before DNA replication initiation. These results suggest that Hpc2 is a key player in the regulation of HIR complex activity and can repress histone gene expression both during a normal cell cycle and in response to DNA damage. In order to pursue our study on histone regulation, chapter III of this thesis covers histone acetylation induced by histone deacetylase inhibitors (HDACi) in normal and cancer cells. Histone deacetylases (HDACs) are enzymes that remove acetyl groups from lysine residues on histones, condensing the chromatin and effectively repressing local transcription. Several types of cancers are characterized by epigenetic abnormalities and HDACs contribute to oncogenesis by aberrant fusion with oncogenic protein complexes. The disruptions often lead to an abnormal silent state of tumour suppressors. HDACs are then targets of interest in cancer treatment caused by those fusion proteins. Our study of the effects of two clinically relevant HDAC inhibitors, vorinostat (SAHA) and entinostat (MS-275) on acetylation of histones demonstrated an obvious increase of histones H3 and H4 acetylation, unlike histones H2A and H2B in both normal and cancer cells. Unexpectedly, our MS quantification of histone acetylation revealed that the stoichiometry of histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56Ac) was only 0.03% and, surprisingly, this stoichiometry did not increase upon HDACi treatments. Several reported studies in the literature of H3K56Ac in humans are irreconcilable. Furthermore, H3K56Ac was considered as a potential biomarker in diagnosis and prognosis in many cancer types. Therefore we focussed on antibody specificity and determined that the majority of antibodies used in the literature recognize other acetylation sites in histone H3, especially H3K9Ac whose stoichiometry of acetylation in vivo is much higher than H3K56Ac. Additionally, chapter IV is a follow-up of our study on histone acetylation and consists of a special report describing the function of H3K56Ac in yeast and human and also contains an evaluation of a supposedly specific H3K56Ac antibody as a diagnostic tool in human cancers.

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones. / Nucleosome assembly entails a controlled mechanism that is tightly coupled to DNA and histone synthesis during DNA replication and repair in S-phase. Importantly, this contributes to the prompt and carefully orchestrated assembly of newly replicated DNA into chromatin, which is essential for the maintenance of genomic integrity. This thesis describes the mass spectrometric characterization of proteins critical in the regulation of nucleosome assembly behind the replication fork and chromatin structure. More specifically, the phosphorylation of Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1), a nucleosome assembly factor that uniquely functions during replication-coupled de novo nucleosome assembly in S-phase and the Hir protein complex, a second nucleosome assembly factor that also contributes to the transcriptional regulation of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage, was examined. We first demonstrated that characterization of protein phosphorylation by mass spectrometry (MS), which often relies on the separation of proteins by gel electrophoresis followed by silver staining for visualization, should be given careful considerations. In chapter 2, we report a potential pitfall in the interpretation of phosphorylation modifications due to the artifactual sulfation of serine, threonine and tyrosine residues caused by a specific reagent used during silver staining. Sulfation and phosphorylation both impart an 80 Da addition of these residues making them distinguishable only with MS systems offering high resolution and high mass accuracy capabilities. Chapter 3 and 4 present the MS characterization of in vivo phosphorylation occurring on CAF-1 and Hir proteins, respectively. We first demonstrated that Cac1, the largest subunit of CAF-1, is phosphorylated on several novel residues containing the consensus sequences recognized by either Cdc7-Dbf4 (DDK) or cyclin-dependent kinases(CDKs). These results have provided the first evidence that CAF-1 is regulated by these two kinases in vivo. The function of all identified Cac1 phosphorylation sites was then assessed. In vivo phenotypic studies showed that the specific phosphorylation of Ser-503, a Cac1 DDK-like site identified in our study, is essential for heterochromatin-mediated telomeric silencing. Cac1-Ser-503 did not appear to be required for other known functions of CAF-1, including DNA damage resistance and mitotic chromosom segregation, indicating that blocking Cac1 phosphorylation on Ser-503 sepcifically cripples CAF-1 function at telomeres. Next, biochemical purifications identified a physical interaction between CAF-1 and Cdc7-Dbf4. Consistent with this physical interaction data, in vitro kinase assay studies showed that Cdc7-Dbf4 specifically phosphorylates Cac1 Ser-503 thereby uncovering a novel role for Cdc7-Dbf4 in heterochromatin assembly and/or stability that is potentially mediated through CAF-1. Finally, MS analysis also showed that the Hpc2 subunit of the Hir protein complex is phosphorylated on several CDK- and DDK-like consensus sites. Furthermore, MS quantification of a specific phosphorylation site,Hpc2 Ser-330, was shown to be highly induced following the activation of the DNA damage checkpoint in response to DNA damage. We show that Hpc2 Ser-330 is phopshorylated by checkpoint kinases in a Mec1/Tel1- and Rad53-dependent manner. Our preliminary data suggest that the ability of the Hir protein complex to regulate the transcriptional repression of histone genes during normal cell cycle progression and in response to DNA damage is mediated through the regulated phosphorylation of Hpc2 by these kinases. Finally, these two studies highlight the importance of mass spectrometry in characterizing protein phosphorylation events, which has yielded novel insights into the regulation of chromatin assembly by CAF-1 and histone synthesis mediated by Hir proteins.

Chez les cellules humaines, environ 2 mètres d'ADN est compacté dans le noyau cellulaire par la formation d'une structure nucléoprotéique appelée chromatine. La chromatine est composée d'ADN enroulé à la surface d'un octamère de core histones pour former une structure appelée nucléosome. La structure de la chromatine doit être altérée afin d'accéder à l'information génétique pour sa réplication, sa réparation et sa transcription. La duplication de la chromatine lors de la phase S est cruciale pour la prolifération et la survie des cellules. Cette duplication de la chromatine requière une ségrégation des histones parentales, mais aussi une déposition d'histones néo-synthétisées sur l'ADN. Ces deux réactions résultent en formation de chromatine dès qu'une quantité suffisante d'ADNest générée par la machinerie de réplication. De plus, en raison de conditions intrinsèques et extrinsèques, la machinerie de réplication est souvent confrontée à de nombreux obstacles, sous la forme de lésions à l'ADN qui interfèrent avec la réplication de l'ADN. Sous ces conditions, l'assemblage de nucléosomes et la synthèse d'histones sont étroitement régulées afin d'éviter la production d'un excès d'histones et leurs nombreuses conséquences nuisibles à la cellule. "Chromatin Assembly Factor 1" (CAF-1) est responsable de la déposition initiale des molécules d'H3 et H4 derrière les fourches de réplication. Pour permettre sa fonction d'assemblage de chromatine, CAF-1 est localisée aux fourches de réplication en vertue de sa liaison à une protéine appelée Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Cependant, le mécanisme moléculaire par lequel CAF-1 exerce sa function demeure mal compris. Dans le deuxième chapitre de ma thèse, j'ai exploré comment CAF-1 se lie à PCNA d'une manière distincte des nombreux autres partenaires de PCNA. Grâce à nos collaborateurs, des études de crystallographie ont démontré que CAF-1 se lie à PCNA grâce à une interaction non-canonique entre le "PCNA Interaction Peptide" (PIP) de CAF-1 et une interaction de type cation-pi (π). Nous avons aussi montré qu'une substitution d'un seul acide aminé, unique au PIP de CAF-1, abolit son interaction avec PCNA et sa capacité d'assemblage de nuclésomes. Nous avons aussi montré que le PIP de CAF-1 est situé à l'extrémité C-terminale d'une très longue hélice alpha qui est conservée à travers l'évolution parmi de nombreux homologues de CAF-1. Nos études biophysiques ontmontré que cette longue hélice alpha forme des structures oligomériques de type "coiled-coil", ce qui suggère certains mécanismes pour dédier un anneau de PCNA à l'assemblage de chromatine et ce, en dépit des nombreux intéracteurs de PCNA présents aux fourches de réplication. Dans le troisième chapitre de ma thèse, nos collaborateurs et moi-même avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules parviennent à maintenir un équilibre délicat entre la synthèse d'ADN et la synthèse d'histones et ce, même en présence de lésions à l'ADN qui interfèrent avec la réplication. Chez Saccharomyces cerevisiae, nous avons montré que les kinases de réponse au dommage à l'ADN, Mec1/Tel1 et Rad53, inhibent la transcription des gènes d'histones en réponse aux liaisons à l'ADN qui interfèrent avec la réplication. Nous avons montré que la répression des gènes d'histones induite par le dommage à l'ADN est médiée par une phosphorylation extensive de Hpc2, l'une des sous-unités du complexe "Histone Gene Repressor" (HIR). Hpc2 contient un domaine qui se lie à l'histone H3. À partir de la structure d'Hpc2, nous avons généré des mutants qui, d'après la structure, sont incapables de se lier à l'histone H3. Nos résultats montrent que l'accumulation d'histones en excès provoquée par le dommage à l'ADN entraîne la phosphorylation d'Hpc2 and la liaison de l'excès d'histone H3 à Hpc2. Ces résultats suggèrent que la répression transcriptionnelle des gènes d'histones induite par le dommage à l'ADN est médiée, du moins en partie, par une simple rétroaction négative impliquant la liaison des histones en excès à la sous-unité Hpc2 du complexe HIR. / In human cells, roughly 2 meters of DNA is compacted into the cell nucleus by the formation of a nucleoprotein complex called chromatin. Chromatin is composed of DNA wrapped around an octamer of core histones to form so-called nucleosomes. Chromatin structure needs to be altered to access genetic information for processes like replication, repair and transcription. Duplication of chromatin during S phase is vital for cell proliferation and viability. Chromatin duplication requires segregation of parental histones, but also deposition of newly synthesized histones onto DNA. This process results in packaging all of the synthesized DNA with histones to form nucleosomes as soon as enough nascent DNA has emerged from the replication machinery. Moreover, as a result of intrinsic and extrinsic conditions, the replication machinery often encounters DNA lesions that impede the continuous synthesis of DNA. Under these conditions, nucleosome assembly and histone synthesis are tightly regulated to prevent the production of an excess of histone proteins and their deleterious consequences. Chromatin Assembly Factor-1 (CAF-1) performs the initial step in chromatin assembly by depositing newly synthesized histone H3-H4 molecules behind replication forks. In order to perform its chromatin assembly function, CAF-1 localizes to DNA replication forks by binding directly to a protein known as the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). However, the exact molecular mechanism by which this is achieved remains poorly understood. Through the second chapter of my thesis, I have explored how CAF-1 binds PCNA in a manner that is distinct from the numerous other binding partners of PCNA. With the help of our collaborators, crystallographic studies demonstrated that CAF-1 binds to PCNA by virtue of a non-canonical PCNA interaction peptide (PIP) and a cation-pi (π) interaction. We have also shown that a single amino acid substitution, unique to the PIP of CAF-1, disrupts its binding to PCNA and chromatin assembly activity. We found that the CAF-1 p150 PIP resides at the extreme C-terminus of a long alpha helix that is evolutionarily conserved among numerous homologues of CAF-1. Our biophysical studies showed that this long alpha-helix is capable of forming higher-order coiled coils, which suggests mechanisms to dedicate one PCNA ring for chromatin assembly despite the presence of multiple PCNA interactors at replication forks. In the third chapter of this thesis, our collaborators and I have addressed the crucial molecular mechanisms by which cells maintain a delicate balance between DNA and histone synthesis despite the presence of DNA lesions that interfere with replication. In Saccharomyces cerevisiae, we showed that the DNA damage response kinases Mec1/Tel1 and Rad53 inhibit histone gene transcription when DNA lesions block DNA replication. We also showed that this repression is mediated by phosphorylation of the Hpc2 subunit of the Histone Gene Repressor complex (HIR). Hpc2 contains a domain that directly binds to histone H3. Interestingly, structure-based mutants of Hpc2 predicted to be incapable of binding H3 are defective in DNA damage-induced transcriptional repression of histone genes in response to DNA damage during replication. Our results indicate that the accumulation of excess histones caused by DNA damage during S phase triggers extensive phosphorylation of Hpc2 and binding of excess H3 to Hpc2. This suggests that DNA damage-induced repression of histone genes is mediated, at least in part, by a simple negative feedback triggered by binding of excess histones to the Hpc2 subunit of the HIR complex.