Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Acidentes ofídicos são considerados um problema de saúde pública global, dada sua alta ocorrência de mortes, onde alguns casos resultam em sequelas irreparáveis, deixando o indivíduo desabilitado por toda a vida. Somente no Brasil, em média 20 mil mortes ao ano são registradas. Desta forma, alguns pesquisadores têm buscado estudar a estrutura-função de componentes dos venenos de serpentes peçonhentas à fim de desenvolver alternativas terapêuticas para esse problema de grande interesse médico. Um dos componentes que tem recebido atenção nas últimas décadas é a BthTX-I, uma proteína PLA2s-homóloga não catalítica, devido seu efeitos farmacológico notadamente miotóxico. Embora diversas técnicas tenham sido empregadas na compreensão do mecanismo de ação dessas proteínas, o conhecimento nessa área permanece controverso, tornando-se necessário a continuidade de estudos. O estudo estrutural e computacional de proteínas constitui uma alternativa viável para identificar as várias conformações de uma dada proteína, bem como seu comportamento dinâmico. Sendo assim, o presente trabalho buscou aplicar métodos computacionais, como simulação de MD, análise de Modos Normais (NM) e Dinâmica Molecular excitada por Modos Normais (MDeNM) à BthTX-I em pH ácido ou básico e nativa ou em complexo com o α-tocoferol – molécula tida como ativadora alostérica – na descrição do seu espaço conformacional, buscando compreender os aspectos estruturais do seu mecanismo de ação. Além disso, foram empregadas té... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ophidian accidents constitute a global public health problem due its high mortality, with some cases leading to permanent sequels. In Brazil, around 20 thousand deaths are registered. Therefore, researchers have been studying the snake venom composition in order to develop therapeutic alternatives to this medical problem. Some components from snake venom are highlighted in the past decades, as BthTX-I, a non-catalytic PLA2s-homologous protein, due its many pharmacological effects, notably myotoxic. Although many techniques have been employed to better understand the molecular mechanism of action for these proteins, this knowledge remains controversial, emphasizing the need to progress this field. The structural and computational study of proteins is a valuable tool to access the various conformations of a given protein, as well its dynamical behavior. Thus, the present work applied computational methods as MD, Normal Modes (NM) analysis and Molecular Dynamics with excited Normal Modes (MDeNM) to BthTX-I in acidic or basic pH and unbound or bound to α-tocopherol – a molecule identified as an allosteric activator – in order to describe the conformational space of this protein and determine the structural aspects of its mechanism of action. Further, biophysical experiments as Dynamic Light Scattering (DLS) were employed in order to comprehend the oligomeric form of BthTX-I with or without α-tocopherol. MD simulations showed that dimeric form of BthTX-I is stable when in neutral/... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:21:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monete_gomes_ioc_dout_2014.pdf: 17494099 bytes, checksum: f62cd38280e24c9b275f4d31899e443a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Protozoários são organismos unicelulares que causam várias doenças que atingem tanto humanos como animais. Essas doenças causam ônus econômicos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Atualmente, não existem vacinas comercialmente disponíveis e não há tratamento eficaz para tais doenças. Isso se deve ao fato dos fármacos disponíveis apresentarem muitos efeitos colaterais e estarem propensos ao desenvolvimento de resistência. A maioria desses fármacos foi descoberta através da seleção de um grande número de compostos contra parasitas íntegros. Porém, nos últimos anos, uma nova abordagem vem ganhando espaço sob o termo de \201Cdesenho racional de fármacos\201D. Este termo representa a busca por compostos contra alvos moleculares específicos, visando diferença bioquímicas e fisiológicas entre o parasita e o hospedeiro. A era pós-genômica gerou uma grande quantidade de informações que vem permitindo a identificação de novos alvos. Neste contexto, a partir de dados dos proteomas de 23 protozoários dos gêneros Entamoeba, Giardia, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Cryptosporidium, Plasmodium, Toxoplasma, Babesia e Theileria, realizamos buscas para a identificação de enzimas isofuncionais não-homólogas (NISE) que possam ser futuramente priorizadas como alvos terapêuticos. Em nossa metodologia utilizamos a ferramenta AnEnPi localmente para buscar nas sequencias proteicas por enzimas funcionalmente análogas. Utilizando os dados provindos do KEGG, primeiro houve uma etapa de clusterização das estruturas primárias de todas as enzimas anotadas com o mesmo EC (Enzyme comission). Para isso utilizou-se uma pontuação (score) de similaridade no BLASTP de 120, como parâmetros de corte Encontramos 812 Ecs com mais de um cluster e 1778 com um único cluster. Após isso, foi realizado um passo de inferência funcional na qual um novo BLASTP foi feito e assumido como ponto de corte o e-value de 10-20. Nesse BLASTP foram comparadas todas as proteínas preditas nos protozoários contra todos os clusters. Desses dados identificamos, inicialmente, 54 potenciais NISEs, e a partir destes fizemos as validações no SUPERFAMILY manualmente. Confirmamos 24 ECs com casos de NISE como potenciais alvos para estudos futuros de validação deste e proposição de fármacos. Além disso, buscamos em 3 bancos de dados principais de alvos terapêuticos, TDTARGETS, TTD e PDTD pelos ECs identificados como possíveis alvos, e encontramos a ocorrência de algumas dessas enzimas já sendo estudadas como alvos. Além disso, selecionamos alguns casos de NISE de acordo com critérios estabelecidos por nós para modelagem comparativa através da ferramenta MODELLER, para a visualização da diferença em suas estruturas 3D. A maioria dos modelos obtidos, de acordo com os resultados dos programas de validação PROCHECK e ERRAT, precisaram ser refinados. Utilizamos a minimização de energia para tal tarefa através do portal KoBaMIN. Todas as enzimas modeladas tiveram diferenças ou na topologia geral, ou nos cofatores e coenzimas utilizados para sua atividade catalítica / Protozoa are unicellular organisms that cause several diseases affecting both humans and animals. These diseases cause economic burden mainly in subtropical and tropical regions. Currently there are no commercially available vaccines and there is no effective treatment for such diseases. This is because the available drugs present many side effects and are prone to development of resistance. Most of these drugs were discovered through the selection of a large number of compounds against entire parasites. However, in recent years, a new approach has been gaining ground within the term "rational drug design". This term represents the search for compounds against specific molecular targets, aiming biochemical and physiological differences between the parasite and the host. The post-genomic era has generated a large amount of information which has been enabling identification of new targets. In this context, from the proteomes data of 23 protozoa from genera Entamoeba, Giardia, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Crytptosporidium, Plasmodium, Toxoplasma, Babesia and Theileria, we perform searches to identify non-homologous isofunctional enzymes (NISE) that may be in future prioritized as therapeutical targets. In our methodology we use the tool AnEnPi locally to search in protein sequences for functionally analogous enzymes. Using the data from the KEGG, there was a first clustering step of all the enzymes primary structures annotated with the same EC (Enzyme Comission). For this we used a score similarity in BLASTP of 120 as cut-off. We found 812 EC with more than one cluster and 1778 with a single cluster. After this, we performed a functional inference step in which a new BLASTP was done and assumed as a cutoff the e-value of 10-20. On this BLASTP all protozoa predicted proteins were compared against all clusters. From these data we identify, initially, 54 potential NISEs, and from these we did the validation on SUPERFAMILY database manually. We confirmed 24 ECs with NISE cases as potential targets for future validation studies and proposition of drugs. In addition, we searched in 3 major databases of therapeutical targets, TDRTARGETS, TTD and PDTD for the ECs identified as possible targets, and we found the occurrence of some of these enzymes already have been studied as targets. Also we selected some cases of NISEs according to criteria settled by us to comparative modeling by MODELLER tool, for visualization of the difference in their 3D structures. Most models obtained, in accordance with the validation results from softwares PROCHECK and ERRAT, needed to be refined. We use minimizing energy for such task through the KoBaMIN portal. All enzymes modeled had differences or in the overall topology, or in the cofactors and the coenzymes used.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) são um dos maiores constituintes protéicos do veneno botrópico e um dos responsáveis pela necrose muscular, consequência esta não eficazmente neutralizada pela administração do soro antiofídico. Estas proteínas são tóxicas através do rompimento ou perturbação da membrana celular em um mecanismo catalítico dependente de cálcio e outro independente, sendo este último não totalmente elucidado. Usualmente, estas toxinas são obtidas diretamente do veneno das serpentes, sendo sua purificação um desafio pela co-existência de diferentes isoformas. O objetivo desta tese foi compreender o mecanismo miotóxico independente de cálcio através de estudos estruturais e propor nova metodologia que trate de dados cristalográficos de toxinas provenientes de amostras impuras, chamada SEQUENCE SLIDER. Para tanto, cristalografia e outras técnicas biofísicas, como espalhamento de raios X a baixo ângulo, serão utilizados para estudar três miotoxinas ofídicas em estado nativo e complexado com produtos naturais e inibidores. Nós propusemos medidas locais e globais para caracterizar e relacionar a estrutura dessas toxinas a função. Com o SEQUENCE SLIDER, pudemos elucidar as estruturas de toxinas inéditas cuja sequência era parcialmente conhecida. Esta nova metodologia proposta consiste em avaliar diferentes cadeias laterais contra o coeficiente de correlação em espaço real calculado a partir dos dados cristalográficos. Em paralelo, desenvolvemos o SEQUENCE SLIDER no âmbito do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de mattos Fontes / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops representam cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Um componentes presente em venenos de serpentes são as fosfolipases A2 (PLA2s), que podem apresentar diversas atividades biológicas. Diversos estudos com PLA2s e PLA2s-homólogas de venenos de serpentes buscam melhor compreender o mecanismo da ação miotóxica, sugerindo diferentes sítios de ação. Neste trabalho, são apresentados estudos com PLA2s-homólogas do veneno de Bothrops moojeni, conhecida popularmente como caiçaca. A miotoxina II (MjTX-II) foi estudada na forma nativa, complexada com ácidos graxos e os inibidores ácido rosmarínico e suramina, enquanto a miotoxina I (MjTX-I) foi estudada em complexo com o ligante suramina. Para a obtenção dos dados, foram utilizadas diferentes técnicas biofísicas como espalhamento dinâmico de luz, calorimetria por titulação isotérmica e cristalografia de raios X. Estes estudos foram complementados com estudos funcionais por técnicas miográficas e estudos computacionais por dinâmica molecular realizados por outros membros do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural. As estruturas cristalográficas da MjTX-II nativa e complexada com ácidos graxos revelaram particularidades para esta toxina, como a independência da ligação de ácidos graxos na estrutura para a sua ativação - alinhamento dos resíduos importantes para a atividade miotóxica. A estrutura da MjTX-II com o ácido rosmarínico revelou que o ligante interage com uma das regiões rela... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops genus represents approximately 90% of the ophidian accidents that occur in Brazil. One of the compounds of the venom is the phospholipases A2 (PLA2s), which are proteins with a wide range of biological activities. Several studies with PLA2s and PLA2-homologues from snake venom were performed to better understanding the myotoxic mechanism, suggesting different activity sites. This work presents studies with PLA2s-homologues isolated from Bothrops moojeni, known in Brazil as caiçaca. The myotoxin II (MjTX-II) was studied in native, complexes to fatty acids, rosmarinic acid and suramin inhibitors. Myotoxin I (MjTX-I) was studied complexed to suramin. X-ray crystallography, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry were used to characterize the protein and complexes. Furthermore, functional studies by myographic techniques and computational studies using molecular dynamics were performed by other members of the Laboratory. Crystallographic structures of MjTX-II in native form and complexes to fatty acids reveals particularities for these toxin, such as the independence of the fatty acids binding for myotoxic residues alignment. The structure of MjTX-II complexed to rosmarinic acid showed that this ligand interact to a of regions related to myotoxic activity of toxin, which probably explaining its inbitory action demonstrated by myographic techniques and is according to previous proposed mechanism. Crystallographic data of the MjTX-II/suramin complex s... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor