De part ses propriétés physico-chimiques, le fer est un cofacteur de choix pour de nombreuses enzymes, impliquées dans de multiples processus biologiques, comme la photosynthèse ou la respiration. Cependant, sa capacité à gagner/perdre des électrons le rend très réactif, et potentiellement toxique. Son homéostasie doit donc être finement régulée. Chez A. thaliana, le gène de ferritine AtFER1 est régulé transcriptionnellement par le fer, et son expression est régulée par le rythme circadien. Au début de ce travail, aucun facteur de transcription impliqué dans cette régulation n'était identifié. Des cribles simple hybride en levure ont été réalisés, permettant l'identification de deux facteurs de transcription régulant le gène AtFER1: AtPHR1 et AtPIF7.PHR1 (Phosphate starvation Response1) et son homologue PHL1 (PHr1 Like 1) sont des facteurs de transcription impliqués dans la réponse à la carence en phosphate. Ils régulent directement le gène AtFER1, en se fixant sur l'élément 2 du promoteur d'AtFER1. Cette régulation ne fait pas intervenir l'IDRS et est indépendante du statut en fer des plantes. Par ailleurs, l'homéostasie du fer est affectée dans le double mutant phr1 phl1. Ces résultats montrent l'existence d'un lien moléculaire direct entre les homéostasies du fer et du phosphate.PIF7 (Phytochrome Interacting Factor 7) est un facteur de transcription de type bHLH impliqué dans la régulation circadienne des gènes DREB. Il se fixe probablement sur la G-box présente dans l'élément 5 du promoteur d'AtFer1. Dans un mutant perte de fonction pour le gène PIF7, l'amplitude des oscillations de l'expression du gène AtFer1 en cycles jour/nuit est augmentée. Un résultat similaire est obtenu lorsque l'élément 5 est muté dans des lignées trasngéniques exprimant le gène rapporteur LUC sous le contrôle du promoteur d'AtFer1. Ces résultats montrent que PIF7 est un répresseur de l'expression d'AtFer1. / Due to its redox properties, iron is a major cofactor for numerous proteins involved in many biological processes such as photosynthesis or respiration. Nevertheless, its ability to easily gain or lose electrons makes it highly reactive with oxygen and potentially toxic. Iron homeostasis has to be tightly regulated. In A. thaliana, AtFER1 ferritin gene is regulated at the transcriptional level by iron, and its expression is regulated by the circadian clock. Before this work, no transcription factor involved AtFer1 regulation has been identified. A yeast one hybrid was performed and allowed us to identify PHR1 and PIF7 as transcription factors involved in AtFER1 regulation. PHR1 (Phosphate starvation Response1) and its homolog PHL1 (PHr1 Like 1) are transcription factors involved in phosphate starvation response. They directly regulate AtFER1 expression and bind to the element 2 present in AtFER1 promoter. This regulation does not involve the IDRS sequence and is independent of iron status of plants. Moreover, iron homeostasis is affected in phr1phl1 double mutant. These results highlight a direct molecular link between iron and phosphate homeostasis.PIF7 (Phytochrome Interacting Factor 7) is a bHLH transcription factor involved in the circadian regulation of DREB genes. PIF7 probably interacts with the G-box found in element 5 in AtFER1 promoter region. In a pif7 knock-out mutant, amplitude of AtFer1 oscillations during light dark cycles are increased. Such a result was also obtained with transgenic lines expressing LUC reporter gene under the control of AtFER1 promoter region harboring a mutation in element 5. These results show that PIF7 is a repressor of AtFer1 expression.

La rétine contient une horloge endogène régulant différentes fonctions rythmiques et participe à la synchronisation de l'horloge centrale du SCN au temps géophysique. Cette synchronisation met en jeu les bâtonnets, les cônes et les cellules à melanopsine. Contrairement au SCN, le rôle des photorécepteurs dans la réponse à la lumière de l'horloge rétinienne est controversé. Nos travaux et ceux d'autres équipes soutiennent un rôle de la melanopsine alors que 2 études récentes suggèrent que seule la neuropsine est impliquée. Mon projet vise à disséquer le rôle des différents photorécepteurs par des approches in vitro/ex vivo chez des souris sauvages, Per2Luc et/ou déficientes en photorécepteurs. Des lumières monochromatiques ciblant différents photorécepteurs ont été appliquées à des explants rétiniens en culture de souris Per2Luc ou déficientes en melanopsine, cônes MW ou bâtonnets. Nos résultats montrent un rôle des bâtonnets dans le décalage de phase de l'horloge rétinienne par la lumière dans le spectre visible et une contribution additionnelle des cônes SW et/ou de la neuropsine dans l'UV. L'horloge rétinienne étant composée de plusieurs horloges et afin de déterminer leur réponse à la lumière, l'induction photique des gènes Per1-Per2 et C-Fos a été analysée dans les couches rétiniennes isolées chez des souris sauvages et déficientes en photorécepteurs. Chez les souris sans melanopsine ou cônes MW, l'induction de Per1-Per2 est abolie dans toutes les couches, suggérant un rôle de ces photorécepteurs. En résumé, nos résultats indiquent un rôle différentiel des photorécepteurs en fonction de la réponse mesurée (décalage de phase de PER2::Luc et induction des gènes de l'horloge par la lumière) / The mammalian retina contains an endogenous pacemaker regulating retinal physiology and participate to the sybchronization of the temporal phase of the central clock of the SCN to environmental time. This entrainment process involves rods, cones and melanopsin-containing retinal ganglion cells. In contrast with the SCN, the role of these photoreceptors in the light response of the retinal clock is still controversial. While recent studies suggest that none of them is involved in light response of the retinal clock, others support a role for melanopsin. My project aims to dissect the role of these different photoreceptors in wild-type, Per2Luc and/or photoreceptor-deficient mice using in vitro/ex vivo approaches. Monochromatic lights targeting different photoreceptors were applied to retinal explants of Per2Luc or melanopsin-, MW cones- or rods-deficient mice. Our results demonstrate that rods are required for the light-induced phase shift of the retinal clock in the visible spectrum and suggest an additional contribution of SW cones and/or neuropsin in the UV. As the retinal clock is composed of several clocks and in order to determine their response to light, the photic induction of Per1-Per2 and C-Fos genes was analyzed in isolated retinal layers from wild-type and photoreceptor-deficient mice. In mice without melanopsin or MW cones, Per1-Per2 induction by light is abolished in all layers, suggesting a role for these photoreceptors. In summary, our results propose a differential contribution of the retinal photoreceptors as a function of the response recorded (phase shift of PER2::Luc or induction of clock genes by light)

Le travail présenté dans cette thèse consiste en la création et l'étude des propriétés d'un nouveau modèle computationnel de l'horloge circadienne végétale et de certains processus physiologiques qui en dépendent.L'horloge circadienne est un rythme endogène d'une période d'environ 24 heures que possèdent la plupart des êtres vivants. Il est généré au niveau moléculaire par des boucles de rétroaction transcriptionnelles, traductionnelles et/ou post-traductionnelles. L'horloge permet aux organismes de s'a- dapter à leur environnement. L'horloge des plantes se distingue par un nombre important de composants (gènes et protéines) dont la majorité sont régulés par la lumière.Dans un premier temps, un nouveau modèle computationnel qui combine une structure complexe et hautement interconnectée avec un nombre réduit d'équations et de paramètres est construit. Ce modèle reproduit correctement les profils d'expression des gènes de l'horloge du type sauvage ainsi que les altérations provoquées par une perte de fonction de chacun de ces gènes. Plusieurs extensions modélisant des processus physiologiques dépendant de l'horloge, à savoir la croissance de l'hypocotyle et la régulation de la floraison, sont également testées.Ensuite, la réponse particulièrement complexe de l'horloge végétale à la lumière est explorée en détail afin de déterminer l'utilité de multiples récepteurs lumineux. Pour ce faire, l'entraînement de l'oscillateur par des cycles jour-nuit de durée différente de 24 heures est mesuré et les différents comportements observés (entraînement périodique, quasipériodicité, chaos) sont caractérisés. Les simulations suggèrent que les multiples senseurs lumineux permettent d'allier une grande flexibilité et une résistance aux effets des fluctuations rapides de luminosité, améliorant ainsi l'adaptation des plantes à l'environnement.Enfin, plusieurs hypothèses permettant de rendre compte des différences observées entre l'horloge des racines et celle des feuilles sont explorées, et différents mécanismes de synchronisation entre ces deux oscillateurs sont testés. / The circadian clock is an endogenous timekeeper with a period of around 24 hours, found in most living beings, which helps organisms adapt to their environment by anticipating daily and seasonal variations. It originates at the molecular level, from transcriptional-translational feedback loops between a small number of genes.In this thesis, a computational model of the plant circadian oscillator is built based on current knowledge of the underlying genetic network. This network is highly complex and interconnected, but the new model needs only a small number of equations and parameters to accurately predict the expression profiles of the main clock genes in various light conditions, as well as the defects associated with a loss of function in those genes. Clock-regulated processes such as hypocotyl growth and flowering are also reproduced with good accuracy. One of the particularities of the plant clock is a large number of light-sensitive components. A study of the role of those multiple light sensors on the entrainment properties of the clock is presented. It uses the newly built model to subject the clock to a very large range of conditions and generate theoretical light-insensitive mutants. The combination of an intricate oscillator and a multiplicity of light sensors makes the plant clock highly flexible, able to adapt to a wide range of conditions but resistant to the disrupting effects of random fluctuations.Preliminary steps towards a more realistic depiction of the plant clock as multiple interacting oscillators are taken. These include modeling a heterogeneous population by changing parameter values, modifying the model to account for known differences between the clocks of the roots and shoots, and testing possible synchronizing mechanisms between those two organs. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les microalgues du phytoplancton sont exposées à des variations fréquentes et rapides de la qualité et de l'intensité spectrale en milieu marin. On peut donc supposer qu'il existe des mécanismes de photoperception spécifiques aux microalgues, différents de ceux identifiés chez les organismes terrestres. L'importance de l'horloge circadienne dans la transmission de l'information lumineuse et notamment la photopériode a largement été caractérisée chez plusieurs organismes modèles terrestres. Le principal objectif de ma thèse était d'étudier les régulations des gènes de l'horloge en réponse à la lumière, chez la microalgue Ostreococcus tauri. Le développement récent des techniques de génomique fonctionnelle chez cette microalgue eucaryote l'a promue comme un nouvel organisme modèle pour l'étude de mécanismes complexes tels que horloge circadienne. Mon étude s'est focalisée sur la caractérisation d'une voie de signalisation de type système à deux composants susceptible de transmettre le signal lumineux vers l'oscillateur central de l'horloge. J'ai étudié les régulations des principaux acteurs de l'horloge d'Ostreococcus par la lumière, et en particulier celles du gène TOC1. J'ai aussi caractérisé la protéine LOV-HK, un nouveau type de photorécepteur à la lumière bleue chez les eucaryotes, dont l'activité est requise pour le bon fonctionnement de l'horloge d'Ostreococcus. L'importance des régulations transcriptionnelles de TOC1 et de LOV-HK, ainsi que leurs fonctions dans l'oscillateur central ont été abordées par l'utilisation d'un promoteur inductible. Enfin, j'ai montré que LOV-HK et plus globalement l'horloge régulent la croissance cellulaire et la biomasse, démontrant leur rôle central dans le contrôle de la physiologie d'Ostreococcus tauri. / Light quality and intensity change frequently in the water column. Therefore marine microalgae are exposed to large changes in light spectrum. Photoperception mechanisms in microalgae are expected to differ from those of land plants since the marine environment has unique properties of light transmission. The focus of my PhD project concerns two mains topics, circadian clock regulation and photoperception in the microalga Ostreococcus tauri. In recent years, O. tauri has emerged as a promising model organism using functional genomics approaches to study complex processes such as the circadian clock regulations. My study was focused on the involvement of a two components system in light transmission to the circadian clock of Ostreococcus. I have studied the molecular mechanisms underlying the regulation of the core clock component TOC1. I have also characterized a novel eukaryotic blue light photoreceptor called LOV-HK, which regulates circadian clock function in Ostreococcus. Using an inducible promoter system to modulate the levels of TOC1 and LOV-HK, I have analyzed the importance of their transcriptional regulations in the clock. Finally, I have shown that LOV-HK and more generally the circadian clock, regulates cell growth and biomass in Ostreococcus tauri.

Bâti sur des données ayant identifié le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus (NSC), composante centrale de l'horloge circadienne des mammifères, comme une structure à fortes potentialités de plasticité structurale, ce travail de thèse a visé à déterminer si la synchronisation photique de l’horloge pouvait mettre en jeu une telle plasticité. Par une analyse ultrastructurale, nous démontrons que le cycle jour/nuit s’accompagne de remaniements neurono-gliaux du NSC affectant différentiellement les neurones à VIP, principales cibles d'intégration des messages rétiniens, et les neurones à vasopressine. Ces remaniements seraient bien liés à la synchronisation photique de l’horloge dans la mesure où, dans le NSC, l’expression rythmique de la GFAP, une protéine du cytosquelette des astrocytes, est abolie sous obscurité constante, tandis que les fluctuations journalières des glucocorticoïdes circulants, connues pour moduler la synchronisation photique, sont apparues être impliquées dans la régulation rythmique de cette plasticité. Grâce au développement d’une méthode d’analyse quantitative en imagerie confocale, nous montrons une augmentation diurne de la densité d’innervation synaptique, glutamatergique et non glutamatergique, sélective des neurones à VIP. Des données en microscopie électronique indiquent que ce remodelage synaptique n’implique pas les synapses GABAergiques, au moins au niveau dendritique des neurones à VIP. Ce travail a permis d’identifier formellement la composante centrale de l’horloge circadienne, le NSC, comme une structure capable d’adapter, de manière rapide et réversible, son architecture gliale et synaptique aux exigences fonctionnelles. / This thesis work was based on data identifying the suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus (SCN), the central component of the mammalian circadian clock, as a structure with a high potential for structural plasticity. It was aimed at determining whether the photic synchronization of the clock may involve such a plasticity.Using an exhaustive ultrastructural analysis, we showed that the SCN underwent day/night rearrangements of its neuronal-glial network, which affected differentially the VIP (vasoactive intestinal peptide)-synthesizing neurons, the main targets for retinal signals, and the vasopressin-synthesizing neurons. The rearrangements appeared to be linked with photic synchronization as the rhythmic expression of GFAP, an astrocytic cytosqueletal protein, was abolished in SCN under constant darkness. Moreover we found the daily fluctuations of circulating glucocorticoids, known as modulators of photic synchronization of the clock, to be involved in the rhythmic regulation of SCN structural plasticity.Thanks to the development of a quantitative analysis method in confocal imaging, we showed a selective increase at daytime in the glutamatergic and non-glutamatergic synapses made on the VIP neurons. Complementary electron-microscopic data indicated that the synaptic remodeling did not involve GABAergic synapses, at least at the dendritic level of VIP neurons.This work permitted to formally identify the central component of the circadian clock, the SCN, as a structure able to adapt, rapidly and reversibly, its glial and synaptic architecture to functional needs.

La pulsatililité des sécrétions hormonales est cruciale dans le système endocrine, puisqu'elle confère aux hormones : leur rôle et leur efficacité d'action. Dans ce cadre, l'objectif de ma thèse a été d'étudier l'implication de l'horloge circadienne, qui contrôle les rythmes journaliers de nombreux aspects de la physiologie et du comportement, dans ces pulsatilités endocrines. Dans un premier temps, nous avons étudié deux fonctions impliquant une activité neuroendocrine pulsatile - la croissance et la reproduction -, chez les souris Cry1-/-Cry2-/-, dépourvues d'horloge circadienne fonctionnelle. Les principaux résultats indiquent, premièrement, que l'horloge circadienne interfère avec la pulsatilité ultradienne de GH, et deuxièmement, que l'horloge circadienne est nécessaire au maintien des cycles infradiens liés à la reproduction. Cette étude montre, d'une part, que l'horloge circadienne joue un rôle dans les mécanismes responsables des pulsatilités hormonales, et d'autre part, qu'elle peut contrôler des rythmes non-circadiens. Dans un second temps, afin de comprendre à quel niveau l'horloge agit pour réguler les pulsatilités endocrines, nous nous sommes intéressés à l'hypophyse, une glande majeure du système endocrine, qui présente différents types de pulsatilités, circadiennes et non circadiennes. L'hypophyse exprime les principaux gènes et protéines horloges avec un rythme journalier. Et, bien que les différentes cellules endocrines qui la composent, aient un fonctionnement rythmique différent, leurs horloges sont en phase. Enfin, l'horloge hypophysaire semble intégrer différents signaux : la lumière et la nourriture. Cette caractérisation sert de base pour de nouvelles études visant à comprendre si l'horloge hypophysaire pourrait aussi coordonner l'activité des cellules endocrines au sein de la glande et ainsi favoriser l'émergence d'une pulsatilité globale.

Legionella pneumophila est un pathogène opportuniste avec un cycle de vie intracellulaire obligatoire, ils arrivent à se répliquer dans leurs cellules hôtes comme des protozoaires, en exploitant les protéines et les voies de signalisation de l’organisme infecté pour échapper à sa réponse immunitaire. L. pneumophila est décrite comme un organisme sans oscillations circadiennes, pourtant elle possède des gènes homologues aux gènes circadiennes kaiBC de cyanobactéries. En appliquant un système d’infections in vitro et in vivo ainsi qu’une approche de génomique comparative et fonctionnelle sur l’ organisme modèle Legionella pneumophila mon projet a pour objectif de caractériser le rôle des gènes kaiBC de L. pneumophila. Les protéines KaiABC de cyanobactéries encodent un oscillateur circadien permettant la coordination et l’optimisation temporelle de divers processus biologiques ainsi que l’adaptation aux fluctuations quotidiennes (comme la production d’oxygène via la photosynthèse pendant le jour et la fixation d’azote dans l’obscurité). Notre étude montre que kaiC, kaiB, avec le lpp1114 (codant pour une protéine à plusieurs domaines), l’ensemble constitue une unité transcriptionnelle sous la commande du facteur sigma RpoS. Les souches mutantes de l'opéron kai affichent une haute sensibilité sous conditions de stress par le paraquat ou le sel en comparaison avec la souche sauvage. En effect, nos données provenant d’une expérience utilisant des systèmes de double hybride suggèrent que les proteines KaiC et KaiB de L. pneumophila n’interagissent pas comme ceux de cyanobactéries. Cependant, une version étendue de L. pneumophila KaiB contenant des résidus de C-terminal de T. elongatus est capable d’interagir avec KaiC. Nous démontrons aussi que la structure cristalline de KaiB de L. pneumophila révèle un pliage pareil a ceux de thiorédoxine (protéine d'oxydoréduction) mais manque les résidus de l'extrémité C-terminale important pour l'interaction avec KaiC. En revanche, L. pneumophila KaiC conserve l'activité d'autophosphorylation, mais KaiB ne declénche pas la phosphorylation de KaiC comme chez les cyanobacteries. L'analyse phylogénétique des protéines de Kai indique qu'elles ont été transférés à L. pneumophila et ont évolué de Synechosystis KaiC2B2 et pas du copie circadienne KaiB1C1. Il semble que les protéines Kai de L. pneumophila améliorent son adaptation à des conditions stressantes et aux changements environnementaux. / Legionella pneumophila is an opportunistic pathogen with an intracellular life cycle that uses aquatic protozoa as replication niche and protection from harsh environments. Although L. pneumophila is not known to have a circadian clock, it encodes homologues of the KaiBC proteins of Cyanobacteria that regulate circadian gene expression. By using a wide range of in vitro, in vivo and in silico approaches I characterized the KaiB and KaiC proteins of L. pneumophila The proteins KaiABC of cyanobacteria coordinate a circadian oscillator that regulates many physiological functions in the cells according to the day and the night time induce by the rotation of the Earth (e.g. they do photosynthesis during the day and nitrogen fixation during the night). We show that L. pneumophila kaiB, kaiC and the downstream gene lpp1114, are transcribed as a unit under the control of the stress sigma factor RpoS. Mutant analyses revealed that the kai operon-encoded proteins increase fitness of L. pneumophila in competitive environments, and confer higher resistance to oxidative and sodium stress. Indeed, KaiC and KaiB of L. pneumophila do not interact as evidenced by yeast and bacterial two- hybrid analyses. Fusion of the C-terminal residues of cyanobacterial KaiB to Legionella KaiB restores their interaction. The crystal structure of L. pneumophila KaiB suggests that it is an oxidoreductase-like protein with a typical thioredoxin fold. In contrast, KaiC of L. pneumophila conserved autophosphorylation activity, but KaiB does not trigger the dephosphorylation of KaiC like in Cyanobacteria. The phylogenetic analysis indicates that L. pneumophila KaiBC resemble Synechosystis KaiC2B2 and not the circadian KaiB1C1 copy. Thus, the L. pneumophila Kai proteins do not encode a circadian clock, but enhance stress resistance and adaption to changes in the environments.

La rotation de la Terre oblige les organismes vivants à s’adapter aux modifications cycliques de l’environnement, et tout particulièrement aux changements de lumière et de température. Des unicellulaires à l’Homme, la plupart des espèces ont développé des horloges circadiennes, qui leur permettent d’anticiper les transitions jour-nuit. La lumière constitue le signal majeur pour la synchronisation de l’horloge. En cycles jour-nuit, les drosophiles présentent un profil d’activité locomotrice bimodal, avec un premier pic autour de l’aube et le deuxième au crépuscule. Chez cet insecte, la perception de la lumière est assurée à la fois par un système complexe, constitué des yeux composés, des ocelles et de l’eyelet d’Hofbauer-Buchner. Ces organes contiennent des photorécepteurs (PRs) exprimant six protéines photosensibles différentes, les rhodopsines (Rh1 à Rh6). Une septième rhodopsine (Rh7) a été décrite dans quelques neurones de l’horloge cérébrale. La lumière est également perçue directement dans la plupart des neurones d’horloge grâce à une protéine photosensible, le cryptochrome (Cry). Les différentes études du rôle de la lumière sur l’entraînement de l’horloge ont essentiellement porté sur la voie cry-dépendante, en utilisant de courts flashs lumineux pour recaler l’horloge cérébrale. Notre étude s’est intéressée à l’entraînement de l’horloge via les rhodopsines. Quels types de photorécepteur sont impliqués ? Après l’activation de la cascade de phototransduction et la libération de l’histamine par les photorécepteurs, quels neurones, exprimant les récepteurs à l’histamine Ort et Hiscl1, participent à l’entraînement de l’horloge circadienne ? Une première partie présente l’étude de l’implication des 6 rhodopsines dans l’entraînement circadien. Tout d’abord, nous avons mis en évidence la fonction de photorécepteurs spécifiques (exprimant Rh1 ou Rh6) dans la voie NorpA-dépendante (Saint-Charles et al. J Comp Neurol 2016). Nous avons ensuite généré des lignées de drosophiles n’exprimant aucune ou qu’une seule rhodopsine. Sans rhodopsine ni Cry les mouches sont incapables de se synchroniser sur les cycles jour-nuit, quelle que soit l’intensité lumineuse. En lumière faible, l’input pour l’entraînement vient principalement des photorécepteurs exprimant Rh1 et Rh6. En forte lumière, chacune des 6 rhodopsines des différents photorécepteurs est capable d’entrainer l’horloge, Rh1, Rh5 et Rh6 étant les plus efficaces ( Alejevski et al., in prep). Une deuxième partie présente la caractérisation des voies neuronales connectant directement ou indirectement les PRs à l’horloge cérébrale. L’horloge circadienne de mouches mutantes, à la fois pour le cryptochrome et les 2 récepteurs à l’histamine, est « aveugle » alors que les mutantes pour Cry mais possédant l’un ou l’autre récepteur à l’histamine sont capables de se synchroniser sur les cycles de lumière. La ré-expression chez les mutants de Ort ou Hiscl1 dans les neurones d’horloge ne restaure pas l’entraînement, suggérant ainsi l’absence de connexions directes entre les PRs histaminergiques et les neurones d’horloge. Nos expériences de sauvetage comportemental mettent en évidence des connexions fonctionnelles entre certains interneurones Ort des lobes optiques et les neurones d’horloge. En revanche et de façon inattendue, nous n’observons d’entraînement circadien que lorsque nous ré-exprimons Hiscl1 dans les seuls PRs Rh6. Nos résultats révèlent que les photorécepteurs interviennent dans l’entraînement à la fois comme photorécepteurs et comme interneurones, cibles d’input histaminergique, rappelant ainsi le double rôle des cellules ganglionnaires de la rétine exprimant la mélanopsine chez les mammifères (Alejevski et al. Nat Commun, in revision). / The rotation of the earth forces living organisms to adapt to its cyclic environment, in particular light and temperature changes. From unicellular organisms to humans, almost all species have evolved circadian clocks, which allow them to anticipate day-night transitions and use light as the most powerful synchronizing cue. In light-dark cycles, D. melanogaster flies display a bimodal locomotor activity with peaks around dawn and dusk. To perceive light, Drosophila has evolved a complex visual system, composed of compound eyes, ocelli and Hofbauer-Buchner eyelet. These organs contain photoreceptors (PRs) expressing six different light receptors named rhodopsins (Rh1 to Rh6). In addition, one rhodopsin (Rh7) is found in some of the clock neurons in the brain. Most of the clock cells also express another type of light receptor, Cryptochrome (Cry). Most studies about clock entrainment by light have focused on the Cry-dependent light input, which allows short light pulses to reset the brain clock. The present thesis focuses on the entrainment of the brain clock through rhodopsins. In photoreceptors, rhodopsins capture photons and activate a transduction cascade, where a key player is the phospholipase C (PLC) encoded by norpA. Mutants deficient for Cry and NorpA do not synchronize at low light intensity but still entrain with high light, indicating that an unknown NorpA-independent pathway is also used by the clock. Light induces a depolarization of the PRs, which release histamine as a neurotransmitter, but their role in circadian entrainment is unknown. Which type of rhodopsine-expressing photoreceptors are implicated? After the phototransduction cascade activation and the release of histamine from the photoreceptors, which downstream neurons expressing the histamine-gated chloride channels Ort and Hiscl1 (whose function has been studied in the visual behavior) are involved in the circadian entrainment? The first part of the thesis was to study the function of the 6 PR rhodopsins in circadian entrainment. I first contributed to studying the function of the specific photoreceptors in the NorpA-dependent pathway (Saint-Charles et al. J Comp Neurol 2016). Then, we generated genotypes having either none or only one of the six PR rhodopsins. Mutants with no Cry and none of the 6 PR rhodopsins could not synchronize with light-dark (LD) cycles (low light or high light). In low light, Rh1 and Rh6 were the main light input for entrainment. In high-light, each one of the 6 PR rhodopsins can provide entrainment, with Rh1, Rh5 and Rh6 being the most efficient (Alejevski et al., in prep).The second part of the work was to identify the neuronal pathways that connect the PRs to the brain circadian clock. Flies deficient for Cry and the two histamine receptors are circadianly blind, whereas Cry mutants having either Ort or Hiscl1 are able to entrain. Thus, each one of the two receptors supports circadian entrainment. Rescuing Ort or Hiscl1 in the clock cells could not restore entrainment, indicating that there is no direct histaminergic connection between PRs and clock neurons. Our rescue experiments revealed several pathways in otic lobes that rely on Ort-expressing interneurons to entrain the clock. In contrast and unexpectedly, we observed that the expression of Hiscl1 in PRs but not in interneurons was involved in circadian entrainment. In fact, only Hiscl1 expression in Rh6 PRs mediates entrainment. Our work thus reveals Rh6-expressing PRs as both photoreceptors and histamine-receiving interneurons in the rhodopsin-dependent entrainment pathway, which recalls the role of melanopsin-expressing retinal ganglion cells in the mammalian retina (Alejevski et al. Nat Commun, in revision).

Cette thèse est dédiée au développement d’un modèle mathématique multi-échelle pour la régulation du cycle cellulaire par l’horloge circadienne. Ceci est motivé par le fait que plusieurs études ont montré un lien direct entre certains cancers et un dysfonctionnement du mécanisme de l’horloge circadienne. Le but est de comprendre l’effet des rythmes circadiens et leur perturbation sur la prolifération d’une population de cellules / This thesis is dedicated to the development of a multiscale mathematical model that describes the regulation of the cell cycle by the circadian clock. What motivated this work is the fact that several tumorigenic diseases are linked to circadian rhythms disruption. We would like to understand the effect of circadian rhythms on the proliferation of a cell population and hence give plausible explanation for diseases that arise form circadian clock disruption. The mammalian cell cycle and the circadian clock are two molecular processes that operate in a rhythmic manner and exquisite precision. On one hand, the cell cycle is driven by the rhythmic activity of cyclin dependent kinases which dictate the time a cell must engage mitosis and the time it must divide giving birth to two daughter cells. On the other hand, the circadian clock is a system of transcriptional and translational feedback-loops that generates sustained oscillations of different mRNAs and proteins with a period of approximately 24 h. It turns out that several components of the circadian clock regulates various cyclin-dependent kinases at different stages of the cell cycle. This makes the circadian clock a key player of the temporal organization of the cell cycle and makes these two biological processes act as two tightly coupled oscillators. Our modeling approach consists of using a molecular-structured partial differential equation that describes the proliferation of a cell population. Proliferation depends on the coupled cell cycle-circadian clock molecular state of cells. Due to the large number of molecular components involved in the cell cycle-circadian clock system, the problem becomes of high-dimensionality and specific numerical techniques are needed to solve the equation

L’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC) a indiqué que le travail posté qui provoquait une disruption circadienne était probablement cancérogène chez l’Homme. Ainsi, une perturbation expérimentale sévère du système circadien accélère-t elle la progression tumorale et pourrait favoriser la cancérogénèse. Durant ma thèse, j’ai démontré que la disruption circadienne résultant d’une mutation ou d’une mise au silence des gènes de l’horloge Per ou Cry accélérait la cancérogénèse hépatique induite par la diéthylnitrosamine, en favorisant l’instabilité génomique, la prolifération cellulaire, et l’inflammation. J’ai montré que l’alimentation programmée ou la dexaméthasone modifiaient la régulation circadienne de ces trois caractéristiques du cancer, suggérant ainsi qu’une intervention thérapeutique ciblant le système circadien pourrait prévenir la cancérogénèse. J’ai ainsi mis en évidence le contrôle circadien de trois mécanismes moléculaires de la cancérogenèse précoce et proposé deux interventions ciblant l’horloge circadienne dans un but de prévention de la cancérogenèse. / The International Agency for Research on Cancer (IARC) concluded that “shift-work that involves circadian disruption is probably carcinogenic to humans”. Severe disruption alteration accelerated tumor progression and enhanced carcinogenesis. During my PhD, I demonstrated that circadian disruption resulting from mutation of Per and Cry clock genes accelerated liver carcinogenesis induced by diethylnitrosamine through promoting genomic instability, cellular proliferation, and inflammation. I showed that meal timing or dexamethasone altered circadian regulation of these three characteristics of cancer, suggesting a therapeutic intervention targeting the circadian system could prevent carcinogenesis. I have thus demonstrated the circadian control of three molecular mechanisms of early carcinogenesis and proposed two interventions targeting the circadian clock for liver carcinogenesis prevention.