156 p. / Inclui proposições / Submitted by Maria das Graças Ribeiro (gracar@ufba.br) on 2012-07-17T16:06:52Z No. of bitstreams: 1 Edgar Santos Reitor UFBA.pdf: 13022157 bytes, checksum: 079c45c41e63b6ab39abda3a79b6dcdc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T16:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Edgar Santos Reitor UFBA.pdf: 13022157 bytes, checksum: 079c45c41e63b6ab39abda3a79b6dcdc (MD5) Previous issue date: 1917 / Tese inaugural apresentada a Faculdade de Medicina da Bahia. O sistema endócrino é o conjunto de órgãos encarregados da hormonogênese isto é, aqueles que incumbe a elaboração e produção de hormônios. Eles são classificados como catalisadores, sendo altamente específicos com relação a sua função. Deste modo, o autor descreve sobre a interação dos hormônios na construção do equilíbrio geral das funções orgânicas do corpo.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-11-08T13:43:41Z No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-01-06T10:59:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T10:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Introdução: A globulina carreadora de tiroxina (TBG) é a principal proteína transportadora dos hormônios tireoidianos em humanos. Anormalidades hereditárias que comprometem a estrutura e função da proteína resultam em deficiência completa (TBG-CD) e parcial de TBG (TBG-PD). O gene que codifica a TBG é o SERPINA7 e está localizado no braço longo do cromossomo X (Xq22.2). Objetivos: Os objetivos desse estudo foram realizar análise molecular do gene SERPINA7 em uma família brasileira com TBG-PD, investigar o padrão de inativação da região do cromossomo X que compreende o gene, bem como realizar modelagem estrutural da proteína mutante e análise estrutural comparativa à família de proteínas serpinas, a fim de inferir efeitos funcionais da mutação identificada. Métodos: O DNA genômico foi extraído do caso índice, do seu pai, da sua irmã gêmea dizigótica e seus dois irmãos. Reação de polimerização em cadeia (PCR) foi utilizada para amplificação do gene SERPINA7 e os produtos foram submetidos a sequenciamento pelo método Sanger. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado no caso índice por meio da análise do padrão de metilação do gene que codifica o receptor androgênico (AR gene), que está localizado próximo do gene SERPINA7 (Xq11.2). Análises estruturais na família das serpinas foram feitas usando PFSTATS, que também foi usado para mapear posições equivalentes em todos homólogos humanos. A modelagem molecular foi realizada usando protocolo descrito por Feyfant e colaboradores. Resultados: Uma nova mutação missense no gene SERPINA7 (p.R35W) foi encontrada em heterozigose no caso índice e em hemizigose nos seus irmãos do sexo masculino. Eles apresentaram baixos níveis séricos de TBG compatíveis com TBG-PD. Esta mutação consistiu na substituição de um nucleotídeo (C>T) na posição 163 do éxon 1, que resultou na troca de uma arginina por um triptofano no códon 35 (p.R35W). O caso índice expressou uma razão de inativação do cromossomo X de 20:80. Na mutação, o carbono alfa do resíduo 35 encontrata-se a cerca de 17Å de distância do átomo mais próximo do T4, e este resíduo reside numa hélice, com a sua cadeia lateral de frente para o solvente. A Arg35 está também envolvida com interações eletrostáticas com os principais oxigênios das cadeias da Met264 e Asp261, e também do oxigênio do grupo carboxamida na Asn32 e ainda com duas moléculas de água. Os padrões de conservação e de correlação envolvendo este resíduo, pode ser visto que os resíduos mais frequentes nestas posições são as lisinas (26,7%), argininas (18,4%) e glutaminas (10,8%). Triptofanos, como na proteína mutante, são extremamente raros (0,1%) e não há significantes (p<10-10) correlações de emparelhamentos envolvendo resíduos nesta posição. Conclusão: O presente estudo relatou uma nova variante do gene SERPINA7 associada à TBG-PD em três irmãos: uma mulher e dois homens. O padrão de inativação do cromossomo X observado no caso índice aponta para um desvio do padrão de inativação, o que corrobora a variabilidade genótipo-fenótipo em mulheres com mutações heterozigóticas no gene SERPINA7, uma condição rara. A natureza hidrofóbica do triptofano poderia resultar em um fragmento apolar que estaria significativamente exposto ao solvente na proteína mutante podendo resultar em agregação da proteína e/ou enovelamento incorreto, e consequente defeito no transporte sérico de T4. Adicionalmente, esses achados sugerem que a TBG e seus homólogos dentro da família das serpinas poderiam ser igualmente afetados por mutações nesta posição rompendo a rede de interações com seus vizinhos na estrutura nativa, com provável impacto funcional. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background: Thyroxine-binding globulin (TBG) is the major human thyroid hormone transport protein. Inherited TBG abnormalities that implicated the protein’s structure and function result in complete (TBG-CD) and partial (TBG-PD) and TBG deficiency. The SERPINA7 gene encodes TBG and it is located on the long arm of the X chromosome (Xq22.2). Objectives: The purpose of this study was to perform the molecular analysis of the SERPINA7 gene in a Brazilian family with TBG-PD, investigate the X-chromosome inactivation pattern region comprising the gene as well as perform structural modeling of the mutant protein and comparative structural analysis of the serpin family of proteins, in order to infer functional effects of these mutations. Methods: Genomic DNA was extracted from the female proband, her father, her dizygotic twin sister and her two brothers. The samples were subjected to polymerase chain reaction (PCR) for SERPINA7 gene amplification and the products were sequenced by the Sanger method. The proband’s sample was evaluated by methylation analysis using the human androgen receptor (AR) gene, which is located next to the TBG gene (Xq11.2). Structural analysis of the serpin family was analyzed using PFSTATS and was also used to map equivalent positions in all human homologs. The molecular modeling was using the protocol described by Feyfant et al. Results: A novel missense mutation in the SERPINA7 gene (p.R35W) was found in heterozygosity in the proband and in hemizygosity in her brothers. They presented low serum TBG levels compatible with TBG-PD. This mutation consisted in a single nucleotide substitution (C>T) at position 163 of exon 1 which resulted in the replacement of an arginine by a tryptophan at codon 35. The proband expressed an Xchromosome inactivation ratio of 20:80. In this mutation, the alpha carbon of residue 35 is about 17Å away from the closest atom from T4 and this residue lies in a helix, with its side chain facing the solvent. Arg35 is also involved in electrostatic interactions with the main chain oxygens of Met264 and Asp261, and also the oxygen on the carboxamide group in Asn32, besides interacting with two waters molecules. The conservation and correlation patterns involving this residue, it can be seen that the most frequent residues in these positions are lysines (26.7%), arginines (18.4%) and glutamines (10.8%). Tryptophans are extremely rare (0.1%), and there is no significant (p<10-10) pairwise correlations involving residues in this position. Conclusion: This study reported a new variant of the SERPINA7 gene associated with TBG-PD in three siblings: one woman and two men. The X-chromosome inactivation pattern verified in the proband corroborated that deviations in the inactivation pattern account for genotype-phenotype variability in women with heterozygous mutations in the SERPINA7 gene, a rare condition. The hydrophobic nature of tryptophan would result in an apolar patch that would be significantly exposed to the solvent can result in protein aggregation and/or misfolding, and the consequent defect in the serum T4 transport. Additionally, these findings suggest that the TBG and its homologs in the serpin family could be similarly affected by mutations in this position which would disrupt the interaction network to its neighbors in the native structure, with probable functional impact.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-23T19:42:30Z No. of bitstreams: 1 Tese_doutorado_Rut_vf.pdf: 3441468 bytes, checksum: 7e04e48be4b0acf155d5d6421c3aee35 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T12:03:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_doutorado_Rut_vf.pdf: 3441468 bytes, checksum: 7e04e48be4b0acf155d5d6421c3aee35 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T12:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_doutorado_Rut_vf.pdf: 3441468 bytes, checksum: 7e04e48be4b0acf155d5d6421c3aee35 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os receptores do hormônio tireoideano (TRs) são proteínas constituídas pelos seguintes domínios: amino-terminal, domínio de ligação ao DNA (DBD) e o domínio de ligação ao ligante (LBD). A região que conecta o DBD ao LBD supostamente age como uma dobradiça. O TR se liga ao DNA como homodímeros ou heterodímeros tendo como parceiro o receptor do ácido 9-cis retinóico (RXR). Estes dímeros pré-formados se ligam aos elementos responsivos (TREs) independente da orientação das bases AGGTCA. O TR reconhece três diferentes TREs: repetições diretas (DR-4: AGGTCAN4AGGTCA); palíndromos (TREpal: AGGTCATGACCT) e palíndromos invertidos (F2: TGACCTN6AGGTCA). Desta forma, para que os receptores se liguem especificamente aos TREs em diferentes orientações, especula-se a necessidade que os DBDs girem em até 180 graus em relação aos LBDs. Para isto, a região que conecta o DBD ao LBD deve atuar como uma dobradiça permitindo tal movimento de rotação. Com o objetivo de investigar qual região corresponderia à dobradiça foram realizadas mutações em diferentes regiões do TRβ1, região T-box (aminoácidos 175 a 180) e alça que conecta as hélices 1 e 2 do LBD (aminoácidos 233 a 238), e do RXRα, região T-box (aminoácidos 201 a 209) e alça que conecta o final do DBD a primeira hélice do LBD (aminoácidos 225 a 232). Foram realizados ensaios de ligação proteína-DNA utilizando proteínas sintetizadas in vitro TR e RXR, nativo e mutantes, marcados ou não com 35S-metionina, e oligonucleotídeos sintéticos contendo os diferentes TREs: DR4, TREpal e F2. Para o estudo funcional foram realizados ensaios de co-transfecção em células U937 e COS-1 com vetores de expressão para o TR e/ou RXR, nativos e mutantes, e plasmídeos contendo cada um dos elementos responsivos (DR-4, F2, TREpal ou DR-1) associados ao gene repórter da luciferase. Embora as mutações na região T-box do TR tenham influenciado a capacidade do receptor em se ligar ao DNA, principalmente como homodímero, e tenha reduzido drasticamente a atividade transcricional em F2, nós sugerimos que essa não seja a região de dobradiça, e sim uma região importante para a ligação de homodímeros. As outras regiões estudadas no TR e/ou RXR não influenciaram a ligação dos receptores aos diferentes TREs e a ativação da transcrição em resposta ao T3, sugerindo que estas regiões não atuem como uma dobradiça nestes receptores. Como os resultados com a deleção da região T-box do TR sugeriram que há uma ligação preferencial aos diferentes TREs, mais especificamente de homodímeros em F2, nós analisamos se o aumento dos níveis intracelulares de RXR poderia exercer um efeito modulatório seletivo em cada elemento responsivo em resposta ao T3. Para verificar essa possibilidade, foram realizados experimentos de co-transfecção e gene repórter em células U937. A co-transfecção de RXR inibiu a resposta mediada por T3 em F2 e TREpal, mas não em DR-4. Nós analisamos se esse efeito ocorria pela ligação direta de heterodímeros ao DNA, pelo seqüestro de co-ativadores em solução ou pelo seqüestro de TR em solução. Nossos resultados demonstraram que dependendo do contexto do DNA, o RXR exerce um efeito modulatório sobre o mecanismo de ação do TR. Em F2, esse efeito aparentemente ocorre de forma indireta pelo seqüestro de TR em solução diminuindo a sua disponibilidade para se ligar como homodímeros nesse elemento responsivo. Por outro lado, em TREpal o efeito modulatório se daria tanto pela ligação direta de heterodímeros ao DNA, quanto indireta pelo seqüestro de TR em solução, ambos devido ao fato deste elemento responsivo ser o sítio preferencial para a ligação de monômeros. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Thyroid hormone receptors (TRs) are proteins comprised by modular domains: aminoterminal domain, DNA-binding domain (DBD) and ligand-binding domain (LBD). The region that connects the DBD to LBD is supposed act as a hinge. The TR binds to DNA, as homodimers or heterodimers, with the 9-cis retinoic acid receptor (RXR). These dimers pre-formed binding to responsive elements (TREs) independent of the bases AGGTCA orientation. TR recognizes three different TREs: direct repeat (DR-4: AGGTCAN4AGGTCA), palindromic (TREpal: AGGTCATGACCT) and inverted palindromic (F2: TGACCCN6AGGTCA). In such a way, for receptors binding specifically in TREs with different orientations, would be necessary that the DBDs must be rotated in respect to the LBDs. Thus, the region that connects the DBD to LBD should act as a hinge. With the aim of investigate which region correspond to the hinge it performed mutations in different regions of the TRβ1 T-box region (amino acids 175 to 180) and the loop that connects the LBD helixes 1 and 2 (amino acids 233 to 238), and of the RXRα T-box region (amino acids 201 to 209) and the loop that connects the end of DBD to the first helix of LBD (amino acids 225 to 232). Eletrophoretic Mobility Shift Assays were performed using translated in vitro proteins TR and RXR, wild type and mutants, labed or not with 35S-methionine, and synthetic oligonucleotides with the different TREs: DR4, F2 and TREpal. For functional study, U937 and COS-1 cells were co-transfected with TR and/or RXR, wild type and mutants, expression vectors and plasmids with each one of the TREs (DR4, F2 or TREpal) associated with a luciferase reporter gene. Even so, the mutations in the TR T-box had influenced the ability of the receptor to binding to DNA, and drastically decreased the transcriptional activity on F2, we suggested that this region not be the hinge, it seems important to the homodimers binding on DNA. The other regions studied in TR and/or RXR not influenced the receptor binding to different TREs and the transcription activation mediated by T3, suggesting that these regions did not act as a hinge in these receptors. As the results with the TR T-box deletion suggested that there is a preferential binding to different TREs, specifically homodimers on F2, we analyzed whether the increase of intracellular levels of RXR could be exert a selective modulator effect in each responsive element in response to T3. To verify this possibility, it performed co-transfections and gene reporter assays in U937 cells. The RXR co-transfection inhibited the response mediated by T3 on F2 and TREpal, but not on DR-4. We analyzed whether this effect occurs by direct binding of heterodimers to DNA, by coactivators sequester in solution or by TR sequester in solution. Our results demonstrated that RXR exerts a modulator effect upon TR action dependent of the DNA context. On F2, this effect apparently occurs in an indirect form by TR sequestration in solution decreasing its availability to binding as homodimers in this responsive element. On the other hand, on TREpal the modulator effect would be by direct binding of heterodimers to DNA, or indirect by TR sequestration in solution, both due as this responsive element to be the preferential site to monomers binding.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-22T11:57:17Z No. of bitstreams: 1 2008_MonalisaFerreiraAzevedo.pdf: 4827517 bytes, checksum: 1380b63cd3e2d970b2e1763d648bf568 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-22T11:57:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MonalisaFerreiraAzevedo.pdf: 4827517 bytes, checksum: 1380b63cd3e2d970b2e1763d648bf568 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-22T11:57:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MonalisaFerreiraAzevedo.pdf: 4827517 bytes, checksum: 1380b63cd3e2d970b2e1763d648bf568 (MD5) / As ações dos hormônios tireoidianos nos tecidos-alvo requerem diversas etapas, e mutações que interferem em algumas delas têm sido identificadas em humanos, nos últimos anos. O defeito melhor caracterizado envolve o gene do receptor do hormônio tireoidiano (TR ), e resulta num fenótipo clínico conhecido como Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireoidiano (SRHT). Nós descrevemos uma grande família brasileira portadora de uma nova mutação que afeta o gene do TR . Uma paciente de 14 anos de idade apresentou concentrações plasmáticas elevadas de T4 e T3 livres, associadas a TSH não-suprimido. O diagnóstico de SRHT foi estabelecido pela identificação da mutação I431V no gene do TR . Dezesseis parentes assintomáticos da probanda também são afetados pela mutação. Estudos funcionais mostram que a mutação I431V exerce efeito dominante negativo sobre o TR selvagem, basicamente, por prejudicar a liberação do correpressor SMRT, ligante-dependente. A presença desta mutação reduz a potência, mas não afeta a eficácia da ação do hormônio tireoidiano, o que está de acordo com a apresentação clínica de eumetabolismo dos indivíduos afetados. Por outro lado, uma descrição recente definiu que defeitos no metabolismo dos hormônios tireoidianos podem produzir um fenótipo bastante similar ao observado nos pacientes portadores de mutações no TR. A geração do hormônio tireoidiano ativo, ou a sua inativação, no local de ação, ocorre mediada pelas desiodases. A síntese dessas enzimas requer a incorporação do aminoácido selenocisteína, através da recodificação do códon de parada UGA, num processo único que cria a classe de proteínas denominadas selenoproteínas. Em humanos, já foram descritas pelo menos 25 diferentes selenoproteínas, embora a maioria delas ainda não tenha sido completamente caracterizada. Até os dias atuais, o mecanismo de síntese das selenoproteínas não foi totalmente esclarecido, no entanto, alguns fatores, como a proteína SBP2, estão definitivamente envolvidos. Nós descrevemos uma paciente de 11 anos de idade, que apresentou quadro de baixa estatura com idade óssea atrasada, déficit auditivo parcial, miopatia periférica progressiva, caracterizada por hipotonia e fraqueza, semi-ptose palpebral à esquerda, com estrabismo divergente homolateral, escoliose moderada, com lordose dorsal e desvio lateral da coluna, além de alterações nos níveis circulantes dos hormônios tireoidianos. Os níveis séricos de TSH da paciente eram discretamente elevados, com T4 e T3 reverso altos, enquanto os níveis de T3 estavam baixos, alterações hormonais estas sugestivas de um defeito no metabolismo dos hormônios tireoidianos. Adicionalmente, os níveis séricos de glutationa-peroxidase e de selênio total estavam reduzidos. Mutações no TR foram excluídas por seqüenciamento genético. Duas novas mutações do tipo nonsense afetando o gene SBP2 foram encontradas nessa paciente, configurando uma mutação em heterozigose composta. A investigação da família mostrou tratar-se de herança de padrão recessivo. Uma vez que a SBP2 é essencial para a síntese de selenoproteínas, esse defeito produziu um efeito generalizado sobre as diversas selenoproteínas, associado a um fenótipo que não havia sido descrito na literatura previamente. A descrição dessa nova síndrome abre uma nova perspectiva na compreensão do papel fisiológico das selenoproteínas, em seres humanos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / ABSTRACT Thyroid hormone actions on target tissues require several steps, and mutations interfering with some of them have been identified in humans, in the last years. The best characterized defect involves thyroid hormone receptor  (TR) gene, and results on a clinical phenotype known as Resistance to Thyroid Hormone (RTH). We describe a large Brazilian family harboring a novel mutation affecting TR gene. A 14-year-old girl was found to have elevated free T4 and free T3 plasma concentrations in coexistence with unsuppressed TSH. The diagnosis of RTH was verified by identification of a novel mutation (I431V) in the TRgene. Sixteen asymptomatic relatives of the proposita are also affected by the mutation. Functional studies showed that I431V mutant exerts dominant-negative effect on wild type TR, mainly by impairment of ligand-dependent release of corepressor SMRT. The presence of this mutation reduces potency, but does not affect efficacy of thyroid hormone action, in accordance with the clinical picture of eumetabolism of the affected individuals. Otherwise, a recent description has postulated that defects on thyroid hormone metabolism may produce a phenotype quite similar to that seen in patients harboring TR mutations. The generation of active thyroid hormone, or its inactivation, at the site of action, occurs mediated by deiodinases. The synthesis of these enzymes requires incorporation of the aminoacid selenocysteine, through recoding of the UGA stop codon, in a unique process that creates the class of proteins named selenoproteins. There have been described at least 25 different selenoproteins in humans, although the majority of them have not yet been fully characterized. Until nowadays, the mechanism of selenoproteins synthesis is not completely understood, but some factors such as SBP2 protein, are definitely involved. We describe an 11-year-old girl, who presented with short stature, delayed bone age, defective auditory function, progressive peripheral myopathy characterized by hypotonia and weakness, semi ptosis of the left eyelid with homolateral divergent strabism, moderate scoliosis with dorsal lordosis and lateral trunk deviation, accompanied by altered thyroid hormone levels. Patient’s serum TSH was slightly elevated, with elevated T4 and reverse T3, while T3 levels were low, all these hormonal alterations suggesting a thyroid hormone metabolism defect. Additionally, serum levels of glutathione peroxidase and total selenium were reduced. TR mutations were ruled out by genetic sequencing. Two novel nonsense mutations affecting the SBP2 gene were found in this patient, configuring a compound heterozygous mutation. Family investigation showed that inheritance is recessive. Because SBP2 is epistatic to selenoproteins synthesis, this defect produced a generalized effect on selenoproteins, with a phenotype that had not been described previously in the literature. The description of this new syndrome comprises a new perspective on the comprehension of the physiological roles of selenoproteins in humans.

Orientador: Adilson Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T11:42:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeLucca_PauloCezar_D.pdf: 7782446 bytes, checksum: 8dbda68a65cf0d9fd8525d58e18bebdd (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016 / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-11T13:19:41Z No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-16T21:04:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T21:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Introdução: A globulina carreadora de tiroxina (TBG) é a principal proteína transportadora dos hormônios tireoidianos em humanos. Anormalidades hereditárias que comprometem a estrutura e função da proteína resultam em deficiência completa (TBG-CD) e parcial de TBG (TBG-PD). O gene que codifica a TBG é o SERPINA7 e está localizado no braço longo do cromossomo X (Xq22.2). Objetivos: Os objetivos desse estudo foram realizar análise molecular do gene SERPINA7 em uma família brasileira com TBG-PD, investigar o padrão de inativação da região do cromossomo X que compreende o gene, bem como realizar modelagem estrutural da proteína mutante e análise estrutural comparativa à família de proteínas serpinas, a fim de inferir efeitos funcionais da mutação identificada. Métodos: O DNA genômico foi extraído do caso índice, do seu pai, da sua irmã gêmea dizigótica e seus dois irmãos. Reação de polimerização em cadeia (PCR) foi utilizada para amplificação do gene SERPINA7 e os produtos foram submetidos a sequenciamento pelo método Sanger. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado no caso índice por meio da análise do padrão de metilação do gene que codifica o receptor androgênico (AR gene), que está localizado próximo do gene SERPINA7 (Xq11.2). Análises estruturais na família das serpinas foram feitas usando PFSTATS, que também foi usado para mapear posições equivalentes em todos homólogos humanos. A modelagem molecular foi realizada usando protocolo descrito por Feyfant e colaboradores. Resultados: Uma nova mutação missense no gene SERPINA7 (p.R35W) foi encontrada em heterozigose no caso índice e em hemizigose nos seus irmãos do sexo masculino. Eles apresentaram baixos níveis séricos de TBG compatíveis com TBG-PD. Esta mutação consistiu na substituição de um nucleotídeo (C>T) na posição 163 do éxon 1, que resultou na troca de uma arginina por um triptofano no códon 35 (p.R35W). O caso índice expressou uma razão de inativação do cromossomo X de 20:80. Na mutação, o carbono alfa do resíduo 35 encontrata-se a cerca de 17Å de distância do átomo mais próximo do T4, e este resíduo reside numa hélice, com a sua cadeia lateral de frente para o solvente. A Arg35 está também envolvida com interações eletrostáticas com os principais oxigênios das cadeias da Met264 e Asp261, e também do oxigênio do grupo carboxamida na Asn32 e ainda com duas moléculas de água. Os padrões de conservação e de correlação envolvendo este resíduo, pode ser visto que os resíduos mais frequentes nestas posições são as lisinas (26,7%), argininas (18,4%) e glutaminas (10,8%). Triptofanos, como na proteína mutante, são extremamente raros (0,1%) e não há significantes (p<10-10) correlações de emparelhamentos envolvendo resíduos nesta posição. Conclusão: O presente estudo relatou uma nova variante do gene SERPINA7 associada à TBG-PD em três irmãos: uma mulher e dois homens. O padrão de inativação do cromossomo X observado no caso índice aponta para um desvio do padrão de inativação, o que corrobora a variabilidade genótipo-fenótipo em mulheres com mutações heterozigóticas no gene SERPINA7, uma condição rara. A natureza hidrofóbica do triptofano poderia resultar em um fragmento apolar que estaria significativamente exposto ao solvente na proteína mutante podendo resultar em agregação da proteína e/ou enovelamento incorreto, e consequente defeito no transporte sérico de T4. Adicionalmente, esses achados sugerem que a TBG e seus homólogos dentro da família das serpinas poderiam ser igualmente afetados por mutações nesta posição rompendo a rede de interações com seus vizinhos na estrutura nativa, com provável impacto funcional. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Thyroxine-binding globulin (TBG) is the major human thyroid hormone transport protein. Inherited TBG abnormalities that implicated the protein’s structure and function result in complete (TBG-CD) and partial (TBG-PD) and TBG deficiency. The SERPINA7 gene encodes TBG and it is located on the long arm of the X chromosome (Xq22.2). Objectives: The purpose of this study was to perform the molecular analysis of the SERPINA7 gene in a Brazilian family with TBG-PD, investigate the X-chromosome inactivation pattern region comprising the gene as well as perform structural modeling of the mutant protein and comparative structural analysis of the serpin family of proteins, in order to infer functional effects of these mutations. Methods: Genomic DNA was extracted from the female proband, her father, her dizygotic twin sister and her two brothers. The samples were subjected to polymerase chain reaction (PCR) for SERPINA7 gene amplification and the products were sequenced by the Sanger method. The proband’s sample was evaluated by methylation analysis using the human androgen receptor (AR) gene, which is located next to the TBG gene (Xq11.2). Structural analysis of the serpin family was analyzed using PFSTATS and was also used to map equivalent positions in all human homologs. The molecular modeling was using the protocol described by Feyfant et al. Results: A novel missense mutation in the SERPINA7 gene (p.R35W) was found in heterozygosity in the proband and in hemizygosity in her brothers. They presented low serum TBG levels compatible with TBG-PD. This mutation consisted in a single nucleotide substitution (C>T) at position 163 of exon 1 which resulted in the replacement of an arginine by a tryptophan at codon 35. The proband expressed an Xchromosome inactivation ratio of 20:80. In this mutation, the alpha carbon of residue 35 is about 17Å away from the closest atom from T4 and this residue lies in a helix, with its side chain facing the solvent. Arg35 is also involved in electrostatic interactions with the main chain oxygens of Met264 and Asp261, and also the oxygen on the carboxamide group in Asn32, besides interacting with two waters molecules. The conservation and correlation patterns involving this residue, it can be seen that the most frequent residues in these positions are lysines (26.7%), arginines (18.4%) and glutamines (10.8%). Tryptophans are extremely rare (0.1%), and there is no significant (p<10-10) pairwise correlations involving residues in this position. Conclusion: This study reported a new variant of the SERPINA7 gene associated with TBG-PD in three siblings: one woman and two men. The X-chromosome inactivation pattern verified in the proband corroborated that deviations in the inactivation pattern account for genotype-phenotype variability in women with heterozygous mutations in the SERPINA7 gene, a rare condition. The hydrophobic nature of tryptophan would result in an apolar patch that would be significantly exposed to the solvent can result in protein aggregation and/or misfolding, and the consequent defect in the serum T4 transport. Additionally, these findings suggest that the TBG and its homologs in the serpin family could be similarly affected by mutations in this position which would disrupt the interaction network to its neighbors in the native structure, with probable functional impact.

A amígdala medial (MeA) é uma área sexualmente dimórfica que modula atividades neuroendócrinas e comportamentais e onde hormônios desempenham um importante papel na plasticidade neuro-glial e sináptica. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a vimentina (VIM) são eficientes marcadores do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar e estudar pela densitometria óptica a imunorreatividade dos filamentos intermediários e marcadores astrocitários GFAP e VIM (GFAP-ir; VIM-ir) nos três subnúcleos da amígdala medial, ântero-dorsal (MeAD), póstero-dorsal (MePD) e pósteroventral (MePV), de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: o primeiro utilizou ratas Wistar nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 20) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária dos subnúcleos da MeA. No segundo experimento, utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. No terceiro experimento foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n=72), cujas idades foram: 1 dia pós-natal (PN1), 5, (PN5), 11 (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). Todos os animais foram fixados por perfusão transcardíaca e seus encéfalos foram removidos, pós-fixados e processados para técnica de imunoistoquímica do anticorpo não marcado. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas,sendo aplicados testes post-hoc Tukey-Kramer. Além disso, ratas em proestro apresentaram maior GFAP-ir do que nas outras fases do ciclo estral (diestro, estro e metaestro; P<0,02). GFAP-ir é maior no MePD do que no MePV ou no MeAD (P<0,02). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol adicionado ou não à progesterona provocaram aumento da GFAP-ir no MePD e no MePV (P<0,001), mas não no MeAD (P>0,3). Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em fêmeas. Ratos em desenvolvimento apresentam dimorfismo sexual nos subnúcleos da MeA investigados. VIM é substituída por GFAP ao longo do desenvolvimento pós-natal. Houve diferença entre os sexos na VIM-ir em PN1, sendo que machos apresentaram maior VIM-ir no MeAD (P=0,001) e no MePV, (P<0,0001); em PN5, no MePD, com fêmeas apresentando maior VIM-ir (P<0,0001); e, em PN21, em todos os três subnúcleos estudados, machos apresentaram maior VIM-ir (MeAD, P = 0,009; MePD, P<0,001; e, MePV, P=0,012). A comparação dos dados de GFAP-ir também apresentou diferenças significativas. A interação entre sexo e idade demonstrou que há dimorfismo sexual em PN1 (machos com maior GFAP-ir; P < 0,001) e em PN45 (fêmeas com maior GFAP-ir; P=0,033). Quanto à interação de sexo e subregiões da MeA, houve diferença estatística no MePV, onde machos apresentaram maior GFAP-ir (P<0,001). Já quanto à interação das idades e subregiões da MeA, houve diferenças entre as áreas estudadas em PN1 (MePV>MeAD e MePD; P<0,001), em PN5 (MePV>MeAD; P<0,003), e em PN45 (MePD>MeAD e MePV; P<0,001). Esses achados permitem concluir que o dimorfismo sexual da MeA está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades subregionais nesta estrutura.Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas nas subregiões estudadas da MeA, ao longo dodesenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso. / The medial amygdala (MeA) is a sexually dimorphic area that modulates neuroendocrinol and behavioral activities and where gonadal hormones play an important role in neuron-gial and synaptic plasticity. Intermediate filaments, like the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM) are efficient markers of astrocytic cytoskeleton and are modified by gonadal hormones. The present study aimed to measure and study the optic densitometry of immunoreactivity in intermediate filaments and astrocytic markers GFAP and VIM (GFAP-ir; VIM-ir) in the three subnuclei; anterodorsal (MeAD), posterodorsal (MePD) and posteroventral (MePV) of the medial amygdala, of male and female rats during postnatal development. Moreover, the GFAP-ir in the same regions of adult females were also studied, in physiological conditions (across the estrous cycle), and by ovariectomy followed by ovarian hormone treatment. Three experiments were performed: the first used adult virgin females across the different phases of estrous cycle, diestrus, proestrus, estrus and metaestrus (n=20) in order to reveal any ovarian hormone induced alterations to astrocytic morphology in the MeA subnuclei. The second experiment used ovariectomized adult virgin (OVX) females (n=18) that received hormonal substitution with estradiol benzoate alone or plus progesterone. The third experiment used male and female Wistar rats (n=72) at different stages of postnatal development; postnatal day 1 (PN1), PN5, PN11, PN21, PN31 and PN45. All the animals were fixed by transcardiac perfusion and had their brains removed, post-fixed and processed following the unlabeled antibody procedure. The data were compared by two-way ANOVA for repeated measures and by the post-hoc Tukey-Kramer and t tests. The results show that the structural characteristics of GFAP-ir astrocytes in the MeA subnuclei are similar to those of other areas of the brain. Also, females in proestrus phase show higher GFAP-ir than the other phases of estrous cycle (diestrus, estrus and metaestrus) (P<0.02). GFAP-ir is higher in the MePD than in either the MePV or MeAD (P<0.02). In ovariectomized females,injections of estradiol alone or combined with progesterone led to an increase in GFAP-ir in both the MePD and MePV (P<0.001), but not in the MeAD (P>0.3), when compared to the control group data. These findings suggest that astrocytic GFAP may be affected by physiologic levels of ovarian hormones as well as by hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to the neural plasticity related to local and integrated activities of these areas in the female rat brain. Developing rats showed sexual dimorphism in the investigated subnuclei of the MeA. VIM is apparently substituted by GFAP during postnatal development. In relation to VIM-ir, differences were found between the sexes: at PN1, males showed higher VIM-ir in the MeAD (P=0.001) and in the MePV (P<0.0001); at PN5, females showed higher VIM-ir in the MePD, (P<0.0001); and, at PN21, in all studied subnuclei, males showed higher VIM-ir in the (MeAD, P=0.009; MePD, P<0.001 and MePV, P=0.012). Significant differences were also found in relation to the GFAP-ir data. The interaction between sex and age showed that there is sexual dimorphism at PN1 (males with higher GFAP-ir; P<0.001) and at PN45 (females with higher GFAP-ir; P=0.033). The interaction between sex and the MeA subregions showed a significant difference in the MePV, where males showed higher GFAP-ir (P<0.001). With regard the interaction between age and the MeA subregions there were differences at PN1 (MePV>MeAD and MePD; P<0.001), at PN5 (MePV>MeAD; (P<0.003), and at PN45 (MePD>MeAD and MePV; P<0.001 in both sexes). These findings suggest the presence of sexual dimorphism in the MeA at early developmental phases of rat nervous system, exhibiting regional particularities in the MeA. Moreover, the morphological differences found in the astrocytes from the studied MeA subnuclei across the development are probably related to the neuron-glia interaction, in accordance with behavioral aspects and neuroendocrine adjustments pertinent to each sex, and each phase of differentiation of the nervous system.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-10T17:49:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-11-28T12:56:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Made available in DSpace on 2008-11-28T12:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Mutações inativadoras dos genes das gonadotrofinas são raras e representam oportunidade única para estudo dos efeitos do FSH e do LH, separadamente, in vivo. Anteriormente, descrevemos uma família brasileira, na qual dois irmãos, um homem e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de FSH devido à mutação Tyr76X, em homozigose, no gene FSHB. Recentemente identificamos outra família, na qual três irmãos, dois homens e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de LH. Na primeira parte do presente estudo (ESTUDO A), foi aplicado protocolo de estimulação hormonal nos pacientes com deficiência de FSH, com o objetivo de analisar os efeitos da estimulação gonadotrófica seletiva na resposta esteroidogênica gonadal em ambos os sexos. Na segunda parte (ESTUDO B), descrevemos as características clínicas e aspectos fisiopatológicos da deficiência seletiva de LH em ambos os sexos e realizamos a análise do gene da subunidade beta do LH (LHB) nos indivíduos afetados e seus familiares. No ESTUDO A, o protocolo consistiu inicialmente de análise da pulsatilidade do LH, obtida por meio de coletas noturnas seriadas de amostras de sangue para dosagem de LH. Em seguida, após supressão adrenal com dexametasona dois dias antes e durante o protocolo, foram realizadas medidas de esteróides sexuais gonadais no estado basal e após administração de hCG apenas, FSH apenas, ou FSH seguido de hCG (FSH+hCG). Foram analisadas as seguintes variáveis: número de pulsos de LH, média ± DP de suas amplitudes, média ± DP dos valores de LH ao longo da noite, e concentrações séricas de testosterona (T), estradiol (E2, SDHEA, 17hidroxiprogesterona (17OHP), androstenediona (AD) e inibina B (InB), antes e depois de cada estímulo. Foram obtidos os seguintes resultados, na mulher e no homem, respectivamente: a média ± DP do LH ao longo da noite foi 49,2 ± 5,7 mIU/ml e 9,1 ± 2,9 mIU/ml; foram detectados 8 pulsos em 8 horas e 9 pulsos em 9 horas, com amplitudes de 53,4 ± 6,5 mIU/ml e 11,7 ± 1,9 mIU/ml. Não houve resposta esteroidogênica gonadal na mulher a nenhum dos estímulos utilizados, enquanto no homem, houve aumento de T e AD após hCG (55,2% e 125%, respectivamente), após FSH (76,3% e 40%) e após FSH+hCG (68% e 140%), houve aumento da 17OHP apenas após FSH+hCG (238,8%) e aumento do E2 após hCG (>116,1%) e após FSH+hCG (111,8%). A InB aumentou 480% após FSH. No ESTUDO B, a deficiência de LH caracterizou-se, nos homens, por ausência do desenvolvimento puberal e azoospermia e na mulher, por amenorréia secundária e infertilidade. As concentrações de séricas de LH foram indetectáveis e as de FSH, elevadas. O seqüenciamento do gene LHB revelou a presença da mutação IVS2+1G>C em homozigose nos indivíduos afetados. O rastreamento da mutação por digestão enzimática revelou que seis familiares férteis eram heterozigotos para a nova mutação, enquanto a mutação não foi identificada em nenhum dos 100 indivíduos normais, no grupo controle. A análise por RT-PCR do RNAm extraído de leucócitos dos indivíduos afetados demonstrou que a mutação resultou na inclusão do íntron 2 e, consequentemente, mudança da fase de leitura do éxon 3 do LHB. O alinhamento das seqüências da suposta proteína aberrante e do LH-beta normal evidenciou a perda de estruturas essenciais para a dimerização das subunidades e conseqüentemente comprometimento provável de sua secreção. Os resultados do ESTUDO A sugeriram que o FSH pode exercer efeito regulatório sobre a produção de andrógenos pelas células de Leydig normais, provavelmente agindo de forma parácrina, mediada por sua ação nas células de Sertoli. No ESTUDO B, a mutação identificada no gene LHB (IVS2+1G>C) resultou no fenótipo de deficiência seletiva de LH nos homozigotos, corroborando os efeitos fisiológicos principais do LH sobre a produção androgênica e fertilidade no sexo masculino e sobre a capacidade ovulatória e fertilidade, no sexo feminino. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Inactivating mutations of gonadotropins genes are rare and represent a unique oportunity to study FSH and LH effects, separately, in vivo. We previously described a Brazilian family including two siblings, a man and a woman, with selective FSH deficiency due to a mutation (Tyr76X) in FSHB gene. Recently, we identified another family including three siblings, two men and a woman, with selective LH deficiency. In the first part of this study (STUDY A), we performed a hormonal stimulation protocol in the FSH-deficient patients, in order to analyse the effects of selective gonadotropin stimulation on gonadal steroidogenic response in both sexes. In the second part (STUDY B), we described the clinical characteristics and physiopathologic features of selective LH deficiency in both sexes and performed the analysis of the LHB gene in the affected patients and their relatives. In STUDY A, the protocol started with overnight serial LH sampling for the analysis of LH pulsatility. After adrenal suppression with oral dexametasone given two days before and during the protocol, gonadal steroids levels were assessed at baseline and after hCG, FSH or FSH +hCG administration. The following variables were analysed: LH pulse number, mean ± SD LH amplitude, mean ± SD overnight LH level and baseline and stimulated serum levels of testosterone (T), estradiol (E2), dehidroepiandrosterone sulphate (SDHEA), 17hydroxi-progesterone (17OHP), androstenedione (AD) and inhibin B. The following results were obtained, for the woman and the man, respectively: the mean overnight LH levels were 49.2 ± 5.7 mIU/mL and 9.1 ± 2.9 mIU/mL; there were 8 pulses/8h and 9 pulses/9h, with mean amplitudes of 53.4 ± 6.5mIU/mL and 11.7 ± 1.9mIU/mL. There was no steroid response to rFSH, hCG or FSH+hCG in the woman. In the man, there was an increase in T and AD after hCG (55.2% and 125%, respectively), after FSH (76.3% and 40%) and after FSH+hCG (68% and 140%); an increase in 17OHP was observed only after FSH+hCG (238.8%); estradiol increased after hCG (>116%) and after FSH+hCG (111.8%), and inhibin B increased by 480% after FSH. In STUDY B, LH deficiency was charactized by absent pubertal development and azoospermia in the men, and by secondary amenorrhea and infertility in the woman. LH levels were undetectable, whereas FSH was elevated. LHB gene sequencing revealed a mutation (IVS2+1G>C) in homozygous state in the affected subjects. Mutation screening by enzymatic digestion revealed that six fertile family members were heterozygotes for the new mutation, whereas the mutation was not found in any of the 100 normal subjects in the control group. RT-PCR analysis of the LHB mRNA extracted from leucocytes of the affected subjects demonstrated that the mutation resulted in the inclusion of intron 2 and, consequently, in an exon 3 frameshift. Sequence alignments of the supposed aberrant protein and wild-type LHB showed that the aberrant protein would lack structures essential for subunit dimerization, which would probably compromise its secretion. The results from STUDY A suggested that FSH may exert a regulatory role in androgen production by Leydig cells, probably acting in a paracrine way, mediated by its action on Sertoli cells. The LHB mutation identified in STUDY B (IVS2+1G>C) resulted in the phenotype of selective LH deficiency in homozygotes, reinforcing the main physiologic effects of LH on androgen production and fertility in men, and on ovulatory capacity and fertility in women.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-09-17T17:16:05Z No. of bitstreams: 1 2008gustavobarcelosbarra.pdf: 2961773 bytes, checksum: bcd541adabac4e8060abc98e7870b0e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-19T17:16:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008gustavobarcelosbarra.pdf: 2961773 bytes, checksum: bcd541adabac4e8060abc98e7870b0e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-19T17:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008gustavobarcelosbarra.pdf: 2961773 bytes, checksum: bcd541adabac4e8060abc98e7870b0e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os hormônios tireoideanos (HTs) são necessários para a diferenciação, crescimento e metabolismo de diversos tecidos de mamíferos. Seus efeitos são mediados pelos receptores do hormônio tireoideano (TRs), que pertencem à superfamília dos receptores nucleares. Os TRs são fatores de transcrição que se ligam ao DNA nos promotores dos genes alvos, em regiões denominadas de elementos responsivos ao TR (TRE). Para modular a atividade transcricional (repressão ou ativação) TR se interage com correpressores e co-ativadores, na ausência e na presença de T3, respectivamente. Para melhor se entender a relação entre estrutura e função do TR, investigamos o papel da isoleucina 280 na interação deste com o correpressor SMRT e com os coativadores SRC1 e GRIP. Para isso utilizamos TRs mutantes onde a isoleucina 280 foi substituída por uma arginina (I280R), metionina (I280M), ou lisina (I280K). A atividade transcricional destes mutantes foi avaliada nos elementos responsivos positivos (DR4, F2, e TREpal) por ensaio de gene repórter luciferase e a interação com os correguladores pelo ensaio de interação proteína-proteína em solução (GST “pull down”). Além disso, utilizamos o mutante F451X, descrito na síndrome de resistência ao HT, pois esse receptor se interage avidamente aos correpressores. Nossos resultados demonstraram que os mutantes I280K e I280R foram transcricionalmente inativos em DR4, F2 e TREpal. Por outro lado, quando comparado ao TR1 selvagem, a mutação I280M não modificou a atividade transcricional em DR4, F2 e TREpal. Adicionalmente, a diferença observada nas capacidades transcricionais de I280M, I280R, e I280K em DR4, F2 e TREpal correlacionou-se com a capacidade de se interagir com os coativadores, pois, apenas o mutante I280M foi capaz de se ligar ao GRIP e ao SRC1 de forma semelhante ao TR selvagem. Além disso, I280M, I280K e I280R apresentaram uma diminuição na capacidade de se interagir o correpressor SMRT e a introdução da mutação I280R no F451X aboliu a alta capacidade de ligação deste mutante ao correpressores. Para completa compreensão das diferenças entre I280M, I280R, e I280K testamos a capacidade de ligação ao T3 pelo ensaio de ligação ao T3-I125. Observamos que a mutação I280M reduz discretamente a afinidade do T3 ao TR1, enquanto que as mutações I280R e I280K abole a ligação do T3 ao TR1. Assim, I280R e I280K além de impedir a ligação os correpressores impedem também à ligação ao hormônio, o que não ocorre com o I280M. Por outro lado, I280M, I280R e I280K se heterodimerizaram com RXR de forma semelhante ao TR selvagem. Diante dessas observações, para melhor compreensão do mecanismo molecular envolvido na repressão mediada por T3, avaliamos a atividade transcricional dos mutantes I280R, I280M, I280K, F451X e I280R/F451X sobre alguns promotores regulados negativamente como: Colagenase-1, Hormônio liberador de tirotropina (TRH) e Superóxido dismutase 1 (SOD-1). A soma dos nossos achados demonstra que, de forma geral, nesses promotores, na ausência de T3, TR estimula a transcrição e que essa ativação é de alguma forma dependente da interação com os correpressores. Por outro lado, a repressão da transcrição mediada por T3, depende da manutenção da superfície de interação com os coativadores. Em conclusão, as diferenças nos resultados observados em nossos mutantes parece ser secundária às diferenças existentes entre as cadeias laterais dos aminoácidos isoleucina, arginina, lisina e metionina (Isoleucina e metionina possuem cadeia lateral hidrofóbica, arginina e lisina possuem cadeias laterais polares e carregadas positivamente). O resíduo I280 está localizado na superfície de ligação ao correpressor, não faz contato direto com o co-ativador, em outros receptores nucleares seu correspondente é sempre de resíduos hidrofóbicos (isoleucina, Leucina, Valina, Metionina) e aparentemente tem a função de interagir com aminoácidos da face interna da H12. Dessa forma, as cadeias laterais carregadas positivamente pelos aminoácidos lisina e arginina poderiam impedir a sustentação da H12 em sua posição correta o que, conseqüentemente, impedir a formação da superfície de ligação aos co-ativadores e também diminuir a afinidade pelo ligante. Além disso, nos promotores regulados negativamente, na ausência de T3, a ativação da transcrição por TR depende da manutenção da superfície de interação com correpressores, enquanto que a repressão da transcrição mediada por T3 exige a preservação da interface de interação do TR com os coativadores. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Thyroid hormones (THs) are necessary for differentiation, growth and metabolism of various mammals tissues. Its effects are mediated by thyroid hormone receptors (TRs) that belong to the nuclear receptors superfamily. The TRs are transcription factors that bind to DNA in the promoters of target genes, in regions called the TR-responsive elements (TRE). To modulate transcriptional activity (repression or activation) TR interacts with correpressores and co-activators, in the absence and presence of T3, respectively. To better to understand the relationship between structure and function of TR, we investigated the role of isoleucine 280 in the TR interaction with the correpressor SMRT and the coactivators SRC1 and GRIP. TRs mutants where the isoleucine 280 has been replaced by an arginine (I280R), methionine (I280M) or lysine (I280K) were created. The transcriptional activity of these mutants were assessed in positive responsive elements (DR4, F2, and TREpal) by luciferase reporter gene assay, and the interaction with the correguladores were assessed by GST pull down assays. Furthermore, we use the mutant F451X, described in the syndrome of resistance to TH, because this receptor interacts eagerly to correpressores. Our results showed that the mutants I280K and I280R were transcriptionally inactive in DR4, F2 and TREpal. Furthermore, when compared TR1 wild type, the mutation I280M not changed the transcriptional activity in DR4, F2 and TREpal. Additionally, the difference observed in the transcriptional capacity of I280M, I280R and I280K in DR4, F2 and TREpal correlated with the ability to interact with coactivators, therefore only the mutant I280M was able to connect to GRIP and the SRC1 in a manner similar to the TR wild type. Moreover, I280M, I280K and I280R showed a decrease in the ability to interact correpressor SMRT and the introduction of the mutation I280R in F451X abolished the high binding capacity of this mutant to corepressors. To complete understanding of the differences between I280M, I280R and I280K we tested the ability to bind to T3. We observed that the mutation I280M slightly reduces the affinity to T3, while the mutations I280R and I280K abolishing the bind to T3. So I280R and I280K addition to prevent the TR binding to corepressors, also prevent the binding to the hormone, which is not the case with the I280M. Moreover, I280M, I280R and I280K heterodimerization with RXR was similar to the TR wild type. Given these observations, for the better understanding of the molecular mechanism involved in the repression mediated by T3, we assessed the transcriptional activity of the mutant I280R, I280M, I280K, F451X and I280R/F451X in some promoters negatively regulated by T3 as: Collagenase-1, thyrotropin releasing hormone (TRH) and Superoxide dismutase-1 (SOD-1). The sum of our findings show that, in general, these promoters, in the absence of T3, TR stimulates transcription activation and this is somehow dependent on the interaction with correpressores. Moreover, the transcription repression mediated by T3, depends on the maintenance of the coactivator interaction surface. In conclusion, differences in the results seen in our mutants appears to be secondary to differences between the amino acids side chains isoleucine, arginine, lysine and methionine (Isoleucine and methionine have hydrophobic side chains, arginine and lysine have polar and positively charded side chains). The residue I280 is located on the corepressor binding surface, it makes direct contact with the corepressors, in other nuclear receptors its correspondent is always hydrophobic (isoleucine, Leucine, Valine, Methionine), and apparently has the task of interacting with amino acids from the inner surface of H12. Thus, positively charded side chain amino acids lysine and arginine might prevent support of H12 in its correct position, which, therefore, prevent the formation of coactivator binding surface and also decrease the affinity for the ligand. Moreover, the negatively regulated promoters, in the absence of T3, and the TR transcription activation depends on the maintenance of the corepressor interaction surface, while the T3 mediated transcription repression requires the maintenance of the coactivators interaction surface.

A amígdala medial (MeA) é uma área sexualmente dimórfica que modula atividades neuroendócrinas e comportamentais e onde hormônios desempenham um importante papel na plasticidade neuro-glial e sináptica. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a vimentina (VIM) são eficientes marcadores do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar e estudar pela densitometria óptica a imunorreatividade dos filamentos intermediários e marcadores astrocitários GFAP e VIM (GFAP-ir; VIM-ir) nos três subnúcleos da amígdala medial, ântero-dorsal (MeAD), póstero-dorsal (MePD) e pósteroventral (MePV), de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: o primeiro utilizou ratas Wistar nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 20) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária dos subnúcleos da MeA. No segundo experimento, utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. No terceiro experimento foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n=72), cujas idades foram: 1 dia pós-natal (PN1), 5, (PN5), 11 (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). Todos os animais foram fixados por perfusão transcardíaca e seus encéfalos foram removidos, pós-fixados e processados para técnica de imunoistoquímica do anticorpo não marcado. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas,sendo aplicados testes post-hoc Tukey-Kramer. Além disso, ratas em proestro apresentaram maior GFAP-ir do que nas outras fases do ciclo estral (diestro, estro e metaestro; P<0,02). GFAP-ir é maior no MePD do que no MePV ou no MeAD (P<0,02). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol adicionado ou não à progesterona provocaram aumento da GFAP-ir no MePD e no MePV (P<0,001), mas não no MeAD (P>0,3). Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em fêmeas. Ratos em desenvolvimento apresentam dimorfismo sexual nos subnúcleos da MeA investigados. VIM é substituída por GFAP ao longo do desenvolvimento pós-natal. Houve diferença entre os sexos na VIM-ir em PN1, sendo que machos apresentaram maior VIM-ir no MeAD (P=0,001) e no MePV, (P<0,0001); em PN5, no MePD, com fêmeas apresentando maior VIM-ir (P<0,0001); e, em PN21, em todos os três subnúcleos estudados, machos apresentaram maior VIM-ir (MeAD, P = 0,009; MePD, P<0,001; e, MePV, P=0,012). A comparação dos dados de GFAP-ir também apresentou diferenças significativas. A interação entre sexo e idade demonstrou que há dimorfismo sexual em PN1 (machos com maior GFAP-ir; P < 0,001) e em PN45 (fêmeas com maior GFAP-ir; P=0,033). Quanto à interação de sexo e subregiões da MeA, houve diferença estatística no MePV, onde machos apresentaram maior GFAP-ir (P<0,001). Já quanto à interação das idades e subregiões da MeA, houve diferenças entre as áreas estudadas em PN1 (MePV>MeAD e MePD; P<0,001), em PN5 (MePV>MeAD; P<0,003), e em PN45 (MePD>MeAD e MePV; P<0,001). Esses achados permitem concluir que o dimorfismo sexual da MeA está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades subregionais nesta estrutura.Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas nas subregiões estudadas da MeA, ao longo dodesenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso. / The medial amygdala (MeA) is a sexually dimorphic area that modulates neuroendocrinol and behavioral activities and where gonadal hormones play an important role in neuron-gial and synaptic plasticity. Intermediate filaments, like the glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM) are efficient markers of astrocytic cytoskeleton and are modified by gonadal hormones. The present study aimed to measure and study the optic densitometry of immunoreactivity in intermediate filaments and astrocytic markers GFAP and VIM (GFAP-ir; VIM-ir) in the three subnuclei; anterodorsal (MeAD), posterodorsal (MePD) and posteroventral (MePV) of the medial amygdala, of male and female rats during postnatal development. Moreover, the GFAP-ir in the same regions of adult females were also studied, in physiological conditions (across the estrous cycle), and by ovariectomy followed by ovarian hormone treatment. Three experiments were performed: the first used adult virgin females across the different phases of estrous cycle, diestrus, proestrus, estrus and metaestrus (n=20) in order to reveal any ovarian hormone induced alterations to astrocytic morphology in the MeA subnuclei. The second experiment used ovariectomized adult virgin (OVX) females (n=18) that received hormonal substitution with estradiol benzoate alone or plus progesterone. The third experiment used male and female Wistar rats (n=72) at different stages of postnatal development; postnatal day 1 (PN1), PN5, PN11, PN21, PN31 and PN45. All the animals were fixed by transcardiac perfusion and had their brains removed, post-fixed and processed following the unlabeled antibody procedure. The data were compared by two-way ANOVA for repeated measures and by the post-hoc Tukey-Kramer and t tests. The results show that the structural characteristics of GFAP-ir astrocytes in the MeA subnuclei are similar to those of other areas of the brain. Also, females in proestrus phase show higher GFAP-ir than the other phases of estrous cycle (diestrus, estrus and metaestrus) (P<0.02). GFAP-ir is higher in the MePD than in either the MePV or MeAD (P<0.02). In ovariectomized females,injections of estradiol alone or combined with progesterone led to an increase in GFAP-ir in both the MePD and MePV (P<0.001), but not in the MeAD (P>0.3), when compared to the control group data. These findings suggest that astrocytic GFAP may be affected by physiologic levels of ovarian hormones as well as by hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to the neural plasticity related to local and integrated activities of these areas in the female rat brain. Developing rats showed sexual dimorphism in the investigated subnuclei of the MeA. VIM is apparently substituted by GFAP during postnatal development. In relation to VIM-ir, differences were found between the sexes: at PN1, males showed higher VIM-ir in the MeAD (P=0.001) and in the MePV (P<0.0001); at PN5, females showed higher VIM-ir in the MePD, (P<0.0001); and, at PN21, in all studied subnuclei, males showed higher VIM-ir in the (MeAD, P=0.009; MePD, P<0.001 and MePV, P=0.012). Significant differences were also found in relation to the GFAP-ir data. The interaction between sex and age showed that there is sexual dimorphism at PN1 (males with higher GFAP-ir; P<0.001) and at PN45 (females with higher GFAP-ir; P=0.033). The interaction between sex and the MeA subregions showed a significant difference in the MePV, where males showed higher GFAP-ir (P<0.001). With regard the interaction between age and the MeA subregions there were differences at PN1 (MePV>MeAD and MePD; P<0.001), at PN5 (MePV>MeAD; (P<0.003), and at PN45 (MePD>MeAD and MePV; P<0.001 in both sexes). These findings suggest the presence of sexual dimorphism in the MeA at early developmental phases of rat nervous system, exhibiting regional particularities in the MeA. Moreover, the morphological differences found in the astrocytes from the studied MeA subnuclei across the development are probably related to the neuron-glia interaction, in accordance with behavioral aspects and neuroendocrine adjustments pertinent to each sex, and each phase of differentiation of the nervous system.