Os materiais lignocelulósicos são os principais resíduos da atividade agroindustrial. Atualmente, é grande a procura por enzimas capazes de degradá-los, visando à produção de diversos compostos químicos, em especial combustíveis renováveis, como o etanol, com baixo impacto ambiental. A celulose é o polissacarídeo majoritário da parede celular das plantas e a macromolécula mais abundante produzida na Terra. A degradação enzimática da celulose é, portanto, de especial significado ambiental e comercial. A celulose é um polissacarídeo linear composto de unidades de glicose ligadas por ligações glicosídicas do tipo -(1,4). A hidrólise enzimática da celulose envolve pelo menos três classes de enzimas: endoglucanases, celobiohidrolases (exoglucanases) e -glucosidases. Apenas as duas primeiras enzimas agem diretamente sobre a celulose, depolimerizando as cadeias e liberando oligossacarídeos de diferentes tamanhos e celobiose. A celobiose é a unidade básica repetitiva da celulose e pode ser convertida em resíduos de glicose pelas -glucosidases. Este sistema enzimático funciona sinergisticamente, e as -glucosidases são responsáveis pelo passo terminal da sacarificação da celulose, liberando as endoglucanases e exoglucanases da inibição por celobiose. Entretanto, em sua grande maioria, as -glucosidases também são inibidas pelo produto da reação catalisada, o que vem despertando um interesse crescente por enzimas tolerantes à glicose. Resultados preliminares mostraram que, quando cultivado em meio líquido empregando avicel como fonte de carbono, o fungo termófilo Humicola insolens é um bom produtor de -glucosidases. Além disso, a atividade do extrato bruto micelial foi estimulada por glicose ou xilose. A análise eletroforética deste extrato bruto, em condições não desnaturantes, revelou ainda a presença de duas bandas de atividade ß-glucosidásica, sendo uma estimulada e outra inibida por glicose em concentração 100 mM. Este trabalho descreve a produção, purificação e caracterização bioquímica de duas -glucosidases miceliais de Humicola insolens. As melhores condições de cultivo para a produção de -glucosidase micelial foram 40°C, 120 rpm, em meio constituído de K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,05%, solução de traços de elementos (25 L para cada 50 mL de meio), extrato de levedura 0,8% e avicel 0,75%, em pH inicial 6,0. O tempo de cultivo para máxima produção foi de 4 dias. As duas -glucosidases miceliais, denominadas BGH I e BGH II, foram purificadas por um procedimento que envolveu precipitação com sulfato de amônio a 75%, seguida por dessalificação em Sephadex G-25, cromatografia de troca iônica em DEAE fractogel e filtração em gel de Sephacryl S-200. Após a purificação, BGH I atingiu uma atividade específica de 25 U/mg com um rendimento de 7,9% e fator de purificação 27,5 vezes. Já a forma BGH II apresentou atividade específica de 15,2 U/mg, com rendimento de 30% e fator de purificação 16,5 vezes. As enzimas apresentaram um conteúdo de carboidratos totais de 51 % (BGH I) e 21% p/p (BGH II). A forma BGH I apresentou massa molecular aparente, estimada por filtração em gel, de 282 kDa, enquanto para (BGH II) este valor foi de 94 kDa. A análise em SDS-PAGE de BGH II mostrou uma única banda protéica de 55 kDa, sugerindo que a forma nativa da enzima é um homodimero. Já para BGH I foram reveladas 3 bandas, com massa moleculares aparentes de 31 kDa, 52 kDa e 132 kDa, sugerindo uma estrutura tetramérica. Entretanto, considerando que se trata de uma enzima altamente glicosilada, estes resultados devem ser interpretados com cautela. Estudos de espectrometria de massas de BGH II demonstraram boa similaridade da sua seqüência de aminoácidos com aquela de uma -glucosidase de Humicola grisea var. thermoidea, com cerca de 22% de recobrimento. A temperatura ótima de reação foi de 60ºC para ambas as -glucosidases purificadas e os valores de pH ótimo foram 5,0 e 6,0 para BGH I e BGH II, respectivamente. Ambas as enzimas foram estáveis quando incubadas em água até 1 hora, a 50ºC; BGH I apresentou um tempo de meia-vida de 47 min a 60°C, enquanto BGH II apresentou um tempo de meia-vida de 40 min a 55°C. Quando incubadas em tampões de diferentes pH por 24 h, BGH I mostrou-se estável em uma faixa de 5-8 e BGH II em pH 6-8. A forma BGH I apresentou maior especificidade de substrato que BGH II, hidrolisando apenas p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo, celobiose e salicina, dentre todos os substratos testados. Já BGH II hidrolisou celobiose, lactose, p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosideo, p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-xilanopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo, o-nitrofenil-ß-Dgalactopiranosídeo e salicina. Nenhuma das duas enzimas hidrolisou substratos poliméricos (CMC e Avicel), além de maltose, trealose e sacarose. Estudos cinéticos mostraram que a forma BGH I hidrolisou p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo e celobiose com a mesma velocidade máxima (25 U/mg). Porém, a afinidade aparente da enzima foi cerca de 7 vezes maior para o substrato sintético. Já os melhores substratos para BGH II foram p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo (VM/KM = 323,3 U/mg.mM) e celobiose (VM/KM = 168,0 U/mg.mM). De maneira muito interessante, a atividade de BGH II foi ativada por glicose ou xilose até concentrações de 400 mM, com efeito estimulatório máximo de cerca de 2 vezes próximo a 100 mM. Em contraste, a atividade de BGH I foi inibida em 95% por glicose 50 mM. Concluindo, a grande eficiência catalítica para substratos naturais, sua boa estabilidade térmica, forte estimulação por glicose e xilose, e tolerância a elevadas concentrações destes monossacarídeos no meio reacional, qualificam a enzima BGH II para aplicação na hidrólise de resíduos celulósicos. / Lignocellulosic materials are the major residues from agroindustrial activities. Currently, there is a great interest in enzymes able to degrade such residues, aiming the production of several chemical products, particularly renewable fuels like ethanol, with low environmental impact. Cellulose is the main polysaccharidic component of the plant cell wall and the most abundant naturally occurring macromolecule on Earth. The enzymatic degradation of cellulose is therefore of great environmental and commercial significance. Cellulose is a linear polysaccharide composed of glucose units, linked by -(1,4)-glycosidic bonds. The enzymatic hydrolysis of cellulose involves at least three types of enzymes: endoglucanases, cellobiohydrolases (exoglucanases), and glucosidases. Only the first two enzymes act directly on cellulose, depolymerizing the cellulose chains and releasing different oligosaccharides and cellobiose. Cellobiose is the basic repetitive unit of cellulose and can be converted into glucose monomers by -glucosidases. This enzymatic system works synergistically, and -Glucosidases are responsible for the terminal step of cellulose saccharification, releasing endoglucanases and cellobiohydrolases from cellobiose inhibition. However, most -Glucosidases are also inhibited by their reaction product, leading to a growing interest in glucose tolerant enzymes. Preliminary results showed that, when grown in liquid medium supplemented with microcrystalline cellulose (avicel®) as carbon source, the thermophilic fungus Humicola insolens is a good producer of -glucosidases. Moreover, the activity of the mycelial crude extract was stimulated by glucose or xylose. The electrophoretic analysis of this crude extract in non-denaturing conditions also revealed the presence of two bands of ß-glucosidase activity, one stimulated and the other inhibited by 100 mM glucose. This study describes the production, purification and biochemical characterization of two mycelial -glucosidases from Humicola insolens. Best culture conditions to mycelial -glucosidase production were 40°C, 120 rpm, in liquid media containing 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4.7H2O, trace elements solution (25 L/50 mL medium), 0,8% yeast extract and 0,75% avicel, with initial pH adjusted to 6,0. The culture time for maximal production was 4 days. The experimental protocol for the simultaneous purification of both mycelial -glucosidases, named BGH I and BGH II, involved 75% amonium sulfate precipitation, followed by Sephadex G-25 desalting, DEAE-fractogel ion exchange chromatography and gel filtration in Sephacryl S-200. The form BGH I was purified 27.5 fold, reaching a specific activity of 25 U/mg with 7.9% yield. BGH II was purified 16.5 fold, with a yield of about 30% and the specific activity was 15.2 U/mg. The enzymes showed total carbohydrate content of 51% (BGH I) and 21% w/w (BGH II). The apparent molecular masses corresponded to 282 kDa (BGH I) and 94 kDa (BGH II), as estimated by gel filtration. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis analysis of BGH II showed a single polypeptide band of 55 kDa, suggesting that the native enzyme is a homodimer. In contrast, three protein bands were revealed for BGH I, corresponding to apparent molecular masses of 31 kDa, 52 kDa e 132 kDa, suggesting a tetrameric structure. However, considering its high level of glycosylation, the results must be considered cautiously. Mass spectrometry analysis of BGH II showed good amino acid sequence similarity with a -glucosidase from Humicola grisea var. thermoidea, with about 22% coverage

Os materiais lignocelulósicos são os principais resíduos da atividade agroindustrial. Atualmente, é grande a procura por enzimas capazes de degradá-los, visando à produção de diversos compostos químicos, em especial combustíveis renováveis, como o etanol, com baixo impacto ambiental. A celulose é o polissacarídeo majoritário da parede celular das plantas e a macromolécula mais abundante produzida na Terra. A degradação enzimática da celulose é, portanto, de especial significado ambiental e comercial. A celulose é um polissacarídeo linear composto de unidades de glicose ligadas por ligações glicosídicas do tipo -(1,4). A hidrólise enzimática da celulose envolve pelo menos três classes de enzimas: endoglucanases, celobiohidrolases (exoglucanases) e -glucosidases. Apenas as duas primeiras enzimas agem diretamente sobre a celulose, depolimerizando as cadeias e liberando oligossacarídeos de diferentes tamanhos e celobiose. A celobiose é a unidade básica repetitiva da celulose e pode ser convertida em resíduos de glicose pelas -glucosidases. Este sistema enzimático funciona sinergisticamente, e as -glucosidases são responsáveis pelo passo terminal da sacarificação da celulose, liberando as endoglucanases e exoglucanases da inibição por celobiose. Entretanto, em sua grande maioria, as -glucosidases também são inibidas pelo produto da reação catalisada, o que vem despertando um interesse crescente por enzimas tolerantes à glicose. Resultados preliminares mostraram que, quando cultivado em meio líquido empregando avicel como fonte de carbono, o fungo termófilo Humicola insolens é um bom produtor de -glucosidases. Além disso, a atividade do extrato bruto micelial foi estimulada por glicose ou xilose. A análise eletroforética deste extrato bruto, em condições não desnaturantes, revelou ainda a presença de duas bandas de atividade ß-glucosidásica, sendo uma estimulada e outra inibida por glicose em concentração 100 mM. Este trabalho descreve a produção, purificação e caracterização bioquímica de duas -glucosidases miceliais de Humicola insolens. As melhores condições de cultivo para a produção de -glucosidase micelial foram 40°C, 120 rpm, em meio constituído de K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,05%, solução de traços de elementos (25 L para cada 50 mL de meio), extrato de levedura 0,8% e avicel 0,75%, em pH inicial 6,0. O tempo de cultivo para máxima produção foi de 4 dias. As duas -glucosidases miceliais, denominadas BGH I e BGH II, foram purificadas por um procedimento que envolveu precipitação com sulfato de amônio a 75%, seguida por dessalificação em Sephadex G-25, cromatografia de troca iônica em DEAE fractogel e filtração em gel de Sephacryl S-200. Após a purificação, BGH I atingiu uma atividade específica de 25 U/mg com um rendimento de 7,9% e fator de purificação 27,5 vezes. Já a forma BGH II apresentou atividade específica de 15,2 U/mg, com rendimento de 30% e fator de purificação 16,5 vezes. As enzimas apresentaram um conteúdo de carboidratos totais de 51 % (BGH I) e 21% p/p (BGH II). A forma BGH I apresentou massa molecular aparente, estimada por filtração em gel, de 282 kDa, enquanto para (BGH II) este valor foi de 94 kDa. A análise em SDS-PAGE de BGH II mostrou uma única banda protéica de 55 kDa, sugerindo que a forma nativa da enzima é um homodimero. Já para BGH I foram reveladas 3 bandas, com massa moleculares aparentes de 31 kDa, 52 kDa e 132 kDa, sugerindo uma estrutura tetramérica. Entretanto, considerando que se trata de uma enzima altamente glicosilada, estes resultados devem ser interpretados com cautela. Estudos de espectrometria de massas de BGH II demonstraram boa similaridade da sua seqüência de aminoácidos com aquela de uma -glucosidase de Humicola grisea var. thermoidea, com cerca de 22% de recobrimento. A temperatura ótima de reação foi de 60ºC para ambas as -glucosidases purificadas e os valores de pH ótimo foram 5,0 e 6,0 para BGH I e BGH II, respectivamente. Ambas as enzimas foram estáveis quando incubadas em água até 1 hora, a 50ºC; BGH I apresentou um tempo de meia-vida de 47 min a 60°C, enquanto BGH II apresentou um tempo de meia-vida de 40 min a 55°C. Quando incubadas em tampões de diferentes pH por 24 h, BGH I mostrou-se estável em uma faixa de 5-8 e BGH II em pH 6-8. A forma BGH I apresentou maior especificidade de substrato que BGH II, hidrolisando apenas p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo, celobiose e salicina, dentre todos os substratos testados. Já BGH II hidrolisou celobiose, lactose, p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosideo, p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-xilanopiranosídeo, p-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo, o-nitrofenil-ß-Dgalactopiranosídeo e salicina. Nenhuma das duas enzimas hidrolisou substratos poliméricos (CMC e Avicel), além de maltose, trealose e sacarose. Estudos cinéticos mostraram que a forma BGH I hidrolisou p-nitrofenil-ß-D-glucopiranosídeo e celobiose com a mesma velocidade máxima (25 U/mg). Porém, a afinidade aparente da enzima foi cerca de 7 vezes maior para o substrato sintético. Já os melhores substratos para BGH II foram p-nitrofenil-ß-D-fucopiranosídeo (VM/KM = 323,3 U/mg.mM) e celobiose (VM/KM = 168,0 U/mg.mM). De maneira muito interessante, a atividade de BGH II foi ativada por glicose ou xilose até concentrações de 400 mM, com efeito estimulatório máximo de cerca de 2 vezes próximo a 100 mM. Em contraste, a atividade de BGH I foi inibida em 95% por glicose 50 mM. Concluindo, a grande eficiência catalítica para substratos naturais, sua boa estabilidade térmica, forte estimulação por glicose e xilose, e tolerância a elevadas concentrações destes monossacarídeos no meio reacional, qualificam a enzima BGH II para aplicação na hidrólise de resíduos celulósicos. / Lignocellulosic materials are the major residues from agroindustrial activities. Currently, there is a great interest in enzymes able to degrade such residues, aiming the production of several chemical products, particularly renewable fuels like ethanol, with low environmental impact. Cellulose is the main polysaccharidic component of the plant cell wall and the most abundant naturally occurring macromolecule on Earth. The enzymatic degradation of cellulose is therefore of great environmental and commercial significance. Cellulose is a linear polysaccharide composed of glucose units, linked by -(1,4)-glycosidic bonds. The enzymatic hydrolysis of cellulose involves at least three types of enzymes: endoglucanases, cellobiohydrolases (exoglucanases), and glucosidases. Only the first two enzymes act directly on cellulose, depolymerizing the cellulose chains and releasing different oligosaccharides and cellobiose. Cellobiose is the basic repetitive unit of cellulose and can be converted into glucose monomers by -glucosidases. This enzymatic system works synergistically, and -Glucosidases are responsible for the terminal step of cellulose saccharification, releasing endoglucanases and cellobiohydrolases from cellobiose inhibition. However, most -Glucosidases are also inhibited by their reaction product, leading to a growing interest in glucose tolerant enzymes. Preliminary results showed that, when grown in liquid medium supplemented with microcrystalline cellulose (avicel®) as carbon source, the thermophilic fungus Humicola insolens is a good producer of -glucosidases. Moreover, the activity of the mycelial crude extract was stimulated by glucose or xylose. The electrophoretic analysis of this crude extract in non-denaturing conditions also revealed the presence of two bands of ß-glucosidase activity, one stimulated and the other inhibited by 100 mM glucose. This study describes the production, purification and biochemical characterization of two mycelial -glucosidases from Humicola insolens. Best culture conditions to mycelial -glucosidase production were 40°C, 120 rpm, in liquid media containing 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4.7H2O, trace elements solution (25 L/50 mL medium), 0,8% yeast extract and 0,75% avicel, with initial pH adjusted to 6,0. The culture time for maximal production was 4 days. The experimental protocol for the simultaneous purification of both mycelial -glucosidases, named BGH I and BGH II, involved 75% amonium sulfate precipitation, followed by Sephadex G-25 desalting, DEAE-fractogel ion exchange chromatography and gel filtration in Sephacryl S-200. The form BGH I was purified 27.5 fold, reaching a specific activity of 25 U/mg with 7.9% yield. BGH II was purified 16.5 fold, with a yield of about 30% and the specific activity was 15.2 U/mg. The enzymes showed total carbohydrate content of 51% (BGH I) and 21% w/w (BGH II). The apparent molecular masses corresponded to 282 kDa (BGH I) and 94 kDa (BGH II), as estimated by gel filtration. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis analysis of BGH II showed a single polypeptide band of 55 kDa, suggesting that the native enzyme is a homodimer. In contrast, three protein bands were revealed for BGH I, corresponding to apparent molecular masses of 31 kDa, 52 kDa e 132 kDa, suggesting a tetrameric structure. However, considering its high level of glycosylation, the results must be considered cautiously. Mass spectrometry analysis of BGH II showed good amino acid sequence similarity with a -glucosidase from Humicola grisea var. thermoidea, with about 22% coverage

O fungo Humicola grisea var. thermoidea foi submetido a diferentes condições de cultivo com o intuito de determinarem-se as melhores condições para produção de conídios, crescimento e produção de metabólitos secundários com atividade biológica. Para tal foram desenvolvidos experimentos avaliando dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek, Jackson e Vogel em condições de agitação (120 rpm), e os tempos avaliados foram 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz enriquecido, em diferentes tempos de incubação, sendo escolhido o período de 60 e 90 dias como os mais promissores. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 40ºC. Dos cultivos em meio líquido foram obtidos extratos acetoetílicos e butanólicos dos filtrados das culturas e metanólicos dos micélios. Dos cultivos a partir do meio sólido foram obtidos extratos acetoetílicos. Os extratos foram avaliados pela técnica de bioautografia na concentração de 30 mg/mL (10 L), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). Os extratos acetoetílicos e metanólicos obtidos a partir dos cultivos em Czapek e Vogel, nos tempos 144, 168 e 192 horas se mostraram ativos contra as cepas K. rhizophila e S. aureus. Os extratos obtidos do meio sólido e o extrato acetoetílico (192 horas) obtido do meio de cultivo de Czapek foram avaliados pelo método de microdiluição em microplaca com o objetivo de determinarem-se os valores de CIM, utilizando como microrganismos indicadores K. rhizophila e S. aureus. O extrato mais promissor foi o extrato acetoetílico do cultivo em meio de arroz enriquecido, durante 90 dias, sendo os valores de concentração inibitória mínima de 350 g/mL e de 250 g/mL, contra S. aureus e K. rhizophila, respectivamente. Os extratos foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência, sendo a princípio considerados promissores os extratos em acetato de etila de Czapek e arroz enriquecido. O fungo foi cultivado em arroz (60 e 90 dias), devido ao maior rendimento, manejo mais simples, menores valores de concentração inibitória mínima quando comparados aos cultivos desenvolvidos nos meios fermentativos líquidos avaliados. Deste modo, foi promovida ampliação da escala de cultivo em meio sólido e os extratos obtidos foram submetidos a processos cromatográficos visando o isolamento de substâncias ativas. Foram isoladas seis substâncias, e elucidadas três: dimetil tereftalato, ácido p-hidroxifenilacético e uma lactama, a qual foi isolada pela primeira vez de fungos e havia sido isolada apenas da esponja marinha (Halichondria melanodocia) infestada por alga. Os resultados dos ensaios de microdiluição em microplaca de tais substâncias se mostraram bastante discretos. Entretanto, outros ensaios biológicos, dentre eles, antitumorais e antiparasitários serão realizados para as substâncias isoladas. / The fungos Humicola grisea var. thermoidea was submmited to different growth conditions, aiming to determine the best condition for the conidia production, mycelia growth and production of secondary metabolites bearing biological activities, as well. For that, it was evaluated both deferent fermentative media (Czapek, Jackson and Vogel) and incubation time (72, 96, 120, 144, 168 e 192 hours), under 120 RPM. The fungus was also cultivated in solid medium using enriched rice in different times of incubation in two batches of 60 and 90 days of fermentation. All fermentations were undertaken at 40ºC. From the fermetation in liquid media it was obtained the extracts in ethyl acetate and n- butanol, from the broth, respectively, and in methanol from the mycelium. From the solid media (rice) it was obtained the ethyl acetate extract. The obtained extracts were submitted to bioautography assay by applying 10 L of a solution containing 30 mg/mL of each extract against the following bacteria strains: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). The extracts em ethyl acetate and methanol obtained from from Czapek and Vogel media at 144, 168 e 192 hours displayed activity against K. rhizophila and S. aureus. The extracts obtained from the solid medium and the ethyl acetate extract from the Czapek nediun at 192 hours were evaluated using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in microplates, aiming to determine the MIC values for these extracts against both K. rhizophila and S. aureus. The most active extract (ethyl acetate) was the one obtained from solid media cultivated for 90 days, furnishing the MIC values of 350 g/mL and 250 g/mL against S. aureus and K. rhizophila, respectively. All the obtained extracts were submitted to HPLC chromatography and the best chromatographic profiles were displayed by both ethyl acetate extracts from Czapek and enriched rice media. The cultivation in rice media was simple and produced the highest yield of extract, as well as displayed the lowest CIM in comparison with the extracts obtained from the broth of liquid media. Therefore, the fungus was cultivated in a larger scale in rice aiming to obtain enough amount of ethyl acetate extract to allow the isolation of the major active compounds by chromatographic means. Thus, six compounds were isolated, from which three were identified so far: dimethyl tereftalate, p-hidroxyphenylacetic acid and the one lactam. The lactam was isolated for the firs time from a soil fungus, and it was previous isolated only from a marine sponge (Halichondria melanodocia) infested by algae. However, the obtained MIC values for these compounds were very high. Even though, other biological assays, such as: anticancer and antiparasitic, among other will be undertaken to evaluate the potential of the isolated compounds.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-06T12:00:41Z No. of bitstreams: 3 Dissertação - Lorraine Andrade Malaspina - 2014 - (1).pdf: 19847965 bytes, checksum: 80a80b846a7ec7bf574c1a4bbeb45756 (MD5) Dissertação - Lorraine Andrade Malaspina - 2014 - (2).pdf: 481787 bytes, checksum: 75b49000c4d8d2964d52487b43437104 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-06T12:06:22Z (GMT) No. of bitstreams: 3 Dissertação - Lorraine Andrade Malaspina - 2014 - (1).pdf: 19847965 bytes, checksum: 80a80b846a7ec7bf574c1a4bbeb45756 (MD5) Dissertação - Lorraine Andrade Malaspina - 2014 - (2).pdf: 481787 bytes, checksum: 75b49000c4d8d2964d52487b43437104 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T12:06:22Z (GMT). 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With the growing demand for renewable energy sources, its been proposed it's use to obtain energy, called biofuels. For such purpose, the main approach is the search of the degradation of biomass via enzymatic hydrolysis. In this context, the study of microorganisms capable of carrying out the degradation of biomass and the study of the enzymes involved in this process play a key role. Particularly, the thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea presents signi cant production of active lignocellulolytic enzymes at high temperature and has been considered a strong candidate for industrial applications. However, the scienti c literature still lacks of structural information on fungal enzymes involved in the hydrolysis of lignocellulose. In previous work, the cellulolytic enzyme cellobiohydrolase (CBH1.2) from Humicola grisea has been identi ed and cloned into Pichia pastoris as well as one of the endoxylanases (HXYN2) from this same organism. In this master's project, the enzymes CBH1.2 and HXYN2 were expressed using heterologous expression system obtaining satisfactory yield for in vitro assays. Puri - cation protocols were established via precipitation by ammonium sulfate and initial experiments of enzyme activity were performed via the reducing sugars method for both enzymes. XX Crystallization conditions were found for the enzyme CBH1.2r, where small needleshaped crystals were obtained in crystallization trials. In addition to this, the cloning of the enzyme CBH1.2 from Humicola grisea with the pHIL-D2 expression vector (for extracellular expression) was performed. This vector was used to transform GS115 and SMD1168 strains of the yeast P. pastoris both with the genotype his4-. Transformants that were able to secrete active protein were detected in both strains. / A obten c~ao da estrutura tridimensional de uma enzima pode ser utilizada como passo inicial em projetos de engenharia gen etica e engenharia enzim atica com intuito de optimiza c~ao da atividade catal tica e/ou a produ c~ao em escala industrial de enzimas alvo. Atualmente, a cristalogra a e o m etodo mais empregado para a determina c~ao de estruturas tridimensionais de macromol eculas. A biomassa vegetal, na forma de celulose, hemicelulose e lignina, apresenta grande potencial para aplica c~oes biotecnol ogicas. Com a crescente demanda por fontes renov aveis de energia, tem-se proposto sua utiliza c~ao para a obten c~ao de energia, os ditos biocombust veis. Para esse m, a principal abordagem que se tem procurado e a degrada c~ao da biomassa via hidr olise enzim atica. Neste contexto, o estudo de micro-organismos capazes de realizar a degrada c~ao da biomassa e o estudo das enzimas envolvidas no processo apresentam papel chave. Particularmente, o fungo term o lo Humicola grisea var. thermoidea apresenta produ c~ao signi cativa de enzimas lignocelulol ticas ativas a alta temperatura e tem sido considerado um forte candidato para aplica c~oes industriais. Contudo, a literatura cient ca ainda carece de informa c~oes estruturais sobre as enzimas do fungo envolvidas na hidr olise da lignocelulose. Em trabalhos anteriores, a enzima celulol tica celobiohidrolase (CBH1.2) de H. grisea foi identi cada e clonada em Pichia pastoris bem como uma das endoxilanases (HXYN2) deste mesmo organismo. Neste projeto de mestrado, foram expressadas as enzimas CBH1.2 e HXYN2 utilizando sistema heter ologo de express~ao, obtendo rendimento satisfat orio para ensaios in vitro. Foram estabelecidos protocolos de puri ca c~ao via precipita c~ao por sulfato de am^onio e realizados experimentos iniciais de atividade enzim atica via o m etodo dos a c ucares redutores para as duas enzimas. XVIII Foi encontrada condi c~ao de cristaliza c~ao para a enzima CBH1.2r onde foram obtidos pequenos cristais em forma de agulha nos ensaios de cristaliza c~ao. Al em deste, tamb em foi realizada a clonagem da enzima CBH1.2 de Humicola grisea no vetor de express~ao pHIL-D2 (para express~ao extracelular). Este vetor foi utilizado para transformar as linhagens SMD1168 e GS115 da levedura P. pastoris ambas com o gen otipo his4-. Foram detectados transformantes capazes de secretar a prote na ativa em ambas as linhagens.

O fungo Humicola grisea var. thermoidea foi submetido a diferentes condições de cultivo com o intuito de determinarem-se as melhores condições para produção de conídios, crescimento e produção de metabólitos secundários com atividade biológica. Para tal foram desenvolvidos experimentos avaliando dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek, Jackson e Vogel em condições de agitação (120 rpm), e os tempos avaliados foram 72, 96, 120, 144, 168 e 192 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz enriquecido, em diferentes tempos de incubação, sendo escolhido o período de 60 e 90 dias como os mais promissores. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 40ºC. Dos cultivos em meio líquido foram obtidos extratos acetoetílicos e butanólicos dos filtrados das culturas e metanólicos dos micélios. Dos cultivos a partir do meio sólido foram obtidos extratos acetoetílicos. Os extratos foram avaliados pela técnica de bioautografia na concentração de 30 mg/mL (10 L), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). Os extratos acetoetílicos e metanólicos obtidos a partir dos cultivos em Czapek e Vogel, nos tempos 144, 168 e 192 horas se mostraram ativos contra as cepas K. rhizophila e S. aureus. Os extratos obtidos do meio sólido e o extrato acetoetílico (192 horas) obtido do meio de cultivo de Czapek foram avaliados pelo método de microdiluição em microplaca com o objetivo de determinarem-se os valores de CIM, utilizando como microrganismos indicadores K. rhizophila e S. aureus. O extrato mais promissor foi o extrato acetoetílico do cultivo em meio de arroz enriquecido, durante 90 dias, sendo os valores de concentração inibitória mínima de 350 g/mL e de 250 g/mL, contra S. aureus e K. rhizophila, respectivamente. Os extratos foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência, sendo a princípio considerados promissores os extratos em acetato de etila de Czapek e arroz enriquecido. O fungo foi cultivado em arroz (60 e 90 dias), devido ao maior rendimento, manejo mais simples, menores valores de concentração inibitória mínima quando comparados aos cultivos desenvolvidos nos meios fermentativos líquidos avaliados. Deste modo, foi promovida ampliação da escala de cultivo em meio sólido e os extratos obtidos foram submetidos a processos cromatográficos visando o isolamento de substâncias ativas. Foram isoladas seis substâncias, e elucidadas três: dimetil tereftalato, ácido p-hidroxifenilacético e uma lactama, a qual foi isolada pela primeira vez de fungos e havia sido isolada apenas da esponja marinha (Halichondria melanodocia) infestada por alga. Os resultados dos ensaios de microdiluição em microplaca de tais substâncias se mostraram bastante discretos. Entretanto, outros ensaios biológicos, dentre eles, antitumorais e antiparasitários serão realizados para as substâncias isoladas. / The fungos Humicola grisea var. thermoidea was submmited to different growth conditions, aiming to determine the best condition for the conidia production, mycelia growth and production of secondary metabolites bearing biological activities, as well. For that, it was evaluated both deferent fermentative media (Czapek, Jackson and Vogel) and incubation time (72, 96, 120, 144, 168 e 192 hours), under 120 RPM. The fungus was also cultivated in solid medium using enriched rice in different times of incubation in two batches of 60 and 90 days of fermentation. All fermentations were undertaken at 40ºC. From the fermetation in liquid media it was obtained the extracts in ethyl acetate and n- butanol, from the broth, respectively, and in methanol from the mycelium. From the solid media (rice) it was obtained the ethyl acetate extract. The obtained extracts were submitted to bioautography assay by applying 10 L of a solution containing 30 mg/mL of each extract against the following bacteria strains: Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14885). The extracts em ethyl acetate and methanol obtained from from Czapek and Vogel media at 144, 168 e 192 hours displayed activity against K. rhizophila and S. aureus. The extracts obtained from the solid medium and the ethyl acetate extract from the Czapek nediun at 192 hours were evaluated using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in microplates, aiming to determine the MIC values for these extracts against both K. rhizophila and S. aureus. The most active extract (ethyl acetate) was the one obtained from solid media cultivated for 90 days, furnishing the MIC values of 350 g/mL and 250 g/mL against S. aureus and K. rhizophila, respectively. All the obtained extracts were submitted to HPLC chromatography and the best chromatographic profiles were displayed by both ethyl acetate extracts from Czapek and enriched rice media. The cultivation in rice media was simple and produced the highest yield of extract, as well as displayed the lowest CIM in comparison with the extracts obtained from the broth of liquid media. Therefore, the fungus was cultivated in a larger scale in rice aiming to obtain enough amount of ethyl acetate extract to allow the isolation of the major active compounds by chromatographic means. Thus, six compounds were isolated, from which three were identified so far: dimethyl tereftalate, p-hidroxyphenylacetic acid and the one lactam. The lactam was isolated for the firs time from a soil fungus, and it was previous isolated only from a marine sponge (Halichondria melanodocia) infested by algae. However, the obtained MIC values for these compounds were very high. Even though, other biological assays, such as: anticancer and antiparasitic, among other will be undertaken to evaluate the potential of the isolated compounds.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO FINAL.pdf: 1117246 bytes, checksum: 91bcbcfc247218ffb970c121596f7b0c (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / The vegetal biomass consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose is the most abundant polymer and xylan is the main component of hemicellulose. The conversion of cellulose and xylan to glucose and xylose can be realized by an enzymatic complex found in secretions of microorganisms such as fungi and bacteria. Enzymatic hydrolysis is an important step to the bioconversion of cellulosic and hemicellulosic fraction from lignocellulosic wastes. The thermophilic fungus Humicola grisea var thermoidea produces an efficient complex of cellulolytic enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidase) and xylanolytic (endoxylanase and β-xylosidase) with high thermostability when grown on different lignocellulosic substrates. The aim of this study was to analyze the kinetics of production of cellulases and xylanase by the fungus H. grisea cultivated on medium containing rice straw (RS), corncob (CC), crushed cane sugar bagasse (CSB) and wheat bran (WB) as carbon source and subsequently analyze the profile of proteins with cellulolytic and xylanolytic activity secreted by the fungus when grown in minimal medium, by liquid fermentation, containing the substrates at concentrations of 1, 2 and 3% and maintained at 42 ° C, 120 rpm for different times. The best results were obtained when the fungus was grown in 3% BCA and FT, the peaks of FPase (0.17 U / mL) and CMCase (3.54 U / mL) were observed after 192 h of growth with 3% BCA , peak avicelase (0,195 U / mL) after 48 h with 3% FT and peak xylanase (23.75 U / mL) after 216 h with 3% FT. The results showed that the best inducer of enzyme production with FPase and CMCase activity was the CSB and the best inducer of enzymes production with xylanase and avicelase activity was the WB. In profile analysis of proteins secreted by H. grisea by SDS-PAGE (216 h) and zymogram (144 h), no band was seen when the fungus was grown in the presence of glucose, suggesting catabolite repression. However, two very strong protein bands corresponding to HXYN2 (23 kDa) and CBH1.2 (47 kDa) were visualized in the gels containing CSB (2 to 3%) and WB (2 and 3%). These enzymes are the main xylanolytic and cellulolytic systems of the fungus, respectively. Were monitored by recombinant enzymes from H. grisea (in gels), an endoxylanase HXYN2r (23 kDa), an cellobiohydrolase CBH1.2r (47 kDa). The masses full profile of H. grisea can be seen in Figures 13, 14, 15, 16, 18 and 19. / A biomassa vegetal é constituída principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é o polímero mais abundante e a xilana o principal componente hemicelulósico. A conversão da celulose e da xilana à glicose e xilose pode ser realizada por um complexo enzimático encontrado nas secreções de microrganismos tais como fungos e bactérias. A hidrólise enzimática é um importante passo para a bioconversão da fração celulósica e hemicelulósica de resíduos lignocelulósicos. O fungo termofílico Humicola grisea var thermoidea produz um eficiente complexo de enzimas celulolíticas (endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases) e xilanolíticas (endoxilanases e β-xilosidase) com alta termoestabilidade quando cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos. O objetivo desse trabalho foi analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo fungo H. grisea cultivado em meio contendo palha de arroz (PA), sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e farelo de trigo (FT) como fonte de carbono e posteriormente analisar o perfil de proteínas com atividade celulolítica e xilanolítica secretadas pelo fungo quando cultivado em meio mínimo, por fermentação líquida, contendo os substratos nas concentrações de 1, 2 e 3%, e mantidos a 42 °C, 120 rpm por diferentes tempos. Os melhores resultados foram obtidos quando o fungo foi cultivado em 3% de BCA e FT, sendo que os picos de FPase (0.17 U/mL) e CMCase (3.54 U/mL) foram observados após 192 e 240 h respectivamente de crescimento com 3% de BCA, o pico de Avicelase (0.195 U/mL) após 48 h com 3% de FT e o pico de xilanase (23.75 U/mL) após 216 h com 3% de FT. Os resultados demonstraram que o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de FPAse e CMCase foi o BCA e o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de Avicelase e xilanase foi o FT. Na análise do perfil de proteínas secretadas pelo H. grisea por SDS-PAGE (216 h) e zimograma (144 h), nenhuma banda foi visualizada quando o fungo foi cultivado na presença de glicose, sugerindo repressão catabólica. Entretanto, duas bandas protéicas muito fortes, correspondentes à HXYN2 (23 kDa) e CBH1.2 (47 kDa) foram visualizadas nos géis contendo BCA (2 e 3%) e FT (2 e 3%); e representam as principais enzimas dos sistemas xilanolítico e celulolítico do fungo, respectivamente. Estas foram monitoradas pelas enzimas recombinantes do H. grisea (nos geis): uma endoxilanase HXYN2r (23 kDa) e uma celobiohidrolase CBH1.2r (47 kDa). As massas do perfil completo do H. grisea podem ser vistas nas Figuras 13-19.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

L’induction de la synthèse d’une acide férulique estérase (AFE) a été étudiée chez Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. L’activité la plus élevée a été détectée en présence de son de blé désamidonné ou de xylane d’avoine (0,22, 0,21 mU/mg protéine, respectivement). Des productions d’AFE en bioréacteur ont également été réalisées en utilisant 1% (p/v) de son de blé comme inducteur. Le niveau de production de l’AFE a été trois fois plus important en bioréacteur qu’en fiole d’Erlenmeyer. L’AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 et celle de Humicola sp., présente dans un mélange enzymatique commercial (DepolTM 740L), ont été partiellement purifiées et caractérisées. A l’issue de la purification, l’activité AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 a été trop faible pour pouvoir être utilisée ultérieurement en synthèse. Par contre, le potentiel de l’AFE de Humicola sp., concentrée par précipitation à l’acétone, pour la synthèse de différents esters phénoliques a été testé. Les meilleurs rendements de conversion ont été observés lors de l’absence de substitutions sur le cycle aromatique de l’acide phénolique ou en présence de groupements hydroxyles. Les synthèses en milieu non aqueux (M2B2) se sont montrées infructueuses en raison, peut-être, d’un effet néfaste du solvant sur l’enzyme / The induction of the ferulic acid esterase (FAE) synthesis was studied with Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. The highest activity was detected in the presence of either destarched wheat bran or oat spelt xylan (0,22, 0,21 mU/mg protein, respectively). FAE productions in bioreactor were also carried out using 1% (w/v) of wheat bran as inducer. The FAE production level was three times higher in bioreactor than in Erlenmeyer flask. FAE of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 and that of Humicola sp., present in an enzymatic commercial mixture (DepolTM 740L), were partially purified and characterised. At the end of the purification, FAE activity of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 was too weak to be used later in synthesis. However, the FAE potential of Humicola sp., concentrated by acetone precipitation, for the synthesis of various phenolic esters was tested. The best conversion yields were observed in the absence of substitution on the phenolic acid aromatic cycle or in the presence of hydroxyl groups. The synthesis in non-aqueous medium (M2B2) were unsuccessful maybe because of an harmful effect of the solvent on the enzyme

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Wagner Rodrigues de Carvalho.pdf: 2607795 bytes, checksum: 19e8481b5eb319af71b9e1f22666f1d9 (MD5) Previous issue date: 2008-06-30 / Xylanases have been used in the biobleaching of paper pulps, in bioconversion of plant biomass, for food and feed industries, among others. For successful selection of xylanases suitable for specific industrial applications it is important to characterize enzymes isolated from different sources. The thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea is described as a good producer of extracellular endoxylanases and the Hxyn2 gene from this fungus was isolated and expressed in yeast Pichia pastoris. The aim of this project was focused on the production, purification and biochemical characterization of the recombinant HXYN2 (HXYN2r) enzyme and application on enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates. The culture conditions of P. pastoris in flasks, using the 12.3 transformant and BMMY-U medium, were optimized and the best xylanolytic activity was 478.2 U/mL after 96 h, with a protein concentration of 100 mg/L, using 2.34% (w/v) of nitrogen sources (yeast extract plus urea 1.34:1.0% - w/v), 1% (v/v) of methanol, and OD600 of 10. The HXYN2r enzyme was purified by gel filtration chromatography with a yield of 6.4% and showed optimum pH and temperature values of 6.5 and 60ºC, respectively, maintaining 100% of initial activity after 4 h of incubation at pH 5.5, 6.5 and 7.5. The half-life time was 18 min at 60ºC and the enzyme was 100% stable after 3 h of incubation at 50ºC. Km and Vmax values were 7.9 mg/mL e 235.4 μmol/(mL.min), respectively. The HXYN2r enzyme were used on the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse (SCB), corn cob (CC) and foliar sample of sugarcane (FSC) alone or with the enzymes of xylanolytic and cellulolytic system produced by H. grisea fungus. For enzymatic hydrolysis experiments, the substrates were milled and pretreated with 0.25% (w/v) of H2SO4 by 30 min. On the enzymatic hydrolysis the best conversion yield of hemicellulosic fractions were obtained using PpHXYN2r supplemented with EHg: 42.8% to CC, 9.6% to SCB and, a mean of 20% to foliar samples. / As endoxilanases têm sido utilizadas no biobranqueamento da polpa de papel, na bioconversão da biomassa de plantas, nas indústrias alimentícias e de ração animal, entre outras. Para a seleção de endoxilanases que possam ser empregadas em processos industriais específicos é importante caracterizar enzimas isoladas de diferentes fontes. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um bom produtor de endoxilanases extracelulares e o gene que codifica uma das endoxilanases (HXYN2) deste fungo foi isolado e expresso na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho se concentrou na produção, purificação e caracterização bioquímica da endoxilanase recombinante HXYN2 e na sua aplicação na hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. As condições de cultivo da levedura P. pastoris em frascos, utilizando o transformante 12.3 e o meio BMMY-U foram otimizadas e obteve-se uma atividade xilanolítica de 478,2 U/mL após 96 h de cultivo, com uma concentração de 100 mg/L de proteínas, utilizando 2,34% (p/v) de fontes de nitrogênio (extrato de levedura e urea 1,34:1,0% - p/v), 1% (v/v) de metanol e DO600 de 10. A enzima HXYN2r foi purificada por cromatografia de filtração em gel com um rendimento de 6,4% e apresentou pH e temperatura ótimos de 6,5 e 60ºC, respectivamente, mantendo 100% da atividade inicial após 4 h de incubação nos pH s 5,5, 6,5 e 7,5. O tempo de meia-vida foi de 18 min a 60ºC e a enzima manteve 100% da atividade após 3 h de incubação a 50ºC. Os valores de Km e Vmáx foram 7,9 mg/mL e 235,4 μmol/(mL.min), respectivamente. A enzima HXYN2r foi aplicada na hidrólise enzimática de sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e palha de cana-de-açúcar (PCA) sozinha ou em conjunto com as enzimas do sistema xilanolítico e celulolítico produzidas pelo fungo H. grisea. Para os experimentos de hidrólise enzimática os substratos testados foram moídos e submetidos a uma etapa de pré-tratamento com 0,25% (p/v) de H2SO4 por 30 min. Nos ensaios de hidrólise enzimática as melhores taxas de conversão da fração hemicelulósica dos substratos foram obtidas utilizando-se a PpHXYN2r suplementado com o EHg: 42,8% para o SM; 9,6% para o BCA e, em média 20% para as amostras foliares.