Les primates représentent un modèle animal idéal pour étudier la stéroïdogénèse puisqu'ils sécrètent, comme les humains, de grandes quantités de dehydroepiandrosterone (DHEA) et de DHEA-sulfate (DHEA-S). La transformation de DHEA et de DHEA-S en androgènes et estrogènes actifs dans les tissus périphériques cibles dépend du niveau de l'expression des diverses enzymes stéroïdogéniques dans chaque type de cellules. Afin de mieux comprendre la formation et l'inactivation périphériques des androgènes et des estrogènes chez le singe, nous avons isolé chez le singe Macaca fascicularis, les orthologues des enzymes humaines par PCR, en utilisant des oligonucléotides dégénérés. Nous avons étudié d'une façon quantitative, la distribution de l'ARN messager des enzymes principales de biosynthèse et de métabolisme pour les stéroïdes chez le singe de cynomolgus, avec la méthode de PCR en temps réel. Finalement, nous avons caractérisé l'activité enzymatique des enzymes clés chez le singe de cynomolgus, soit la 311-HSD, la 1713-HSD du type 12 et les membres de la famille d'AKR 1C (la 3a-HSD, le type 5 1713- HSD et la 20a-HSD). Notre étude montre qu'il existe une forme unique de 3P-HSD chez le Macaca fascicularis, tandis que chez l'humain 2 isoformes sont présents de façon spécifique au tissu. La quantification des niveaux d'expression de l'ARNm a montré que l'enzyme est fortement présent dans les tissus stéroïdogénique classiques et plusieurs tissus périphériques. Aussi, les résultats suggèrent qu'une défecience en 313-11SD, en plus de l'hyperplasie congénitale surrénalienne, des maladies secondaires liées à une insuffisance de métabolisme stéroïde dans les tissus périphériques tels que la peau, les glandes mammaires, la prostate, et le cerveau. Un fragment de la région codante cADN de la 17(3-HSD du type 12 a été isolé par RT-PCR dans l'ARNm de foie de Macaca fascicularis. En utilisant les cellules HEK-293 qui expriment la 1713-HSD type 12 de Macaca fascicularis par transfection stable, nous avons montré que l'enzyme catalyse efficacement et sélectivement la transformation d'El en E2. En plus, l'ARNm de la 17[3-HSD12 de Macaca fascicularis est exprimé de façon ubiquiste, avec les niveaux les plus élevés trouvés dans le cervelet, le rate, et la surrénale. Ces résultats suggèrent fortement que cette enzyme est impliqué dans la biosynthèse de l'estradiol à la suite de l'étape de la transformation de 4-androstène-3,17-dione en estrone par l'aromatase. En utilisant des amorces spécifiques, nous avons isolé les fragments d'ADN complémentaire encodant les membres de famille d'aldo-keto réductases (AKR1C) chez le singe Macaca fascicularis, soit la 3a-HSD, le type 5 17S-HSD et la 20a-HSD. L'identité de chaque clone a été déterminée par la caractérisation de l'activité de l'enzyme exprimée par transfection stable dans les cellules HEK-293. La comparaison des caractéristiques enzymatiques de la famille AKR1C de Macaca fascicularis avec celles des orthologues d'humain et de souris montre différentes spécificités de substrat entre les espèces. La quantification des niveaux d'expression l'ARNm de la famille AKR1C de Macaca fascicularis montre que 1) la 3a-HSD est spécifique pour le foie, 2) le type 5 170-HSD est principalement trouvé dans le rein et le foie, et 3) 20a-HSD est très fortement exprimée dans le rein, l'estomac et le foie. L'expression des enzymes est en accord avec les fonctions de ces enzymes. / Human and some other primates are unique in having adrenals that secrete large amounts of dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfated derivative DHEA-sulfate (DHEA-S). The transformation of DHEA and DHEA-S into active androgens and /or estrogens in peripheral target tissues depends on the expression of the various steroidogenic and metabolizing enzymes in each cell type. Since monkeys produce high levels of circulating DHEA and DHEA-S like humans, they represent an ideal animal model for studying steroidogenesis in humans. To gain more knowledge about the peripheral formation and inactivation of androgens and estrogens in the monkey, we isolated the cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) orthologs of human enzymes by PCR-based cloning using degenerate oligonucleotides. Each clone was verified by automated dideoxynucleotide DNA sequencing. We also examined quantitatively the distribution of mRNAs of key steroidogenic and steroid metabolizing enzymes in the Macaca fascicularis using RealTime PCR. Furthermore, we characterized the enzymatic activity of the key enzymes, namely 313-HSD, type 12 1713-11SD and the members of the AKR IC family, namely 3a-HSD, type 5 1711-HSD and 20a-HSD. A unique isoform of Macaca fascicularis 315-HSD has been isolated by RT-PCR. Phylogenetic analysis suggests that Macaca fascicularis 313-HSD is the ortholog of human type 2 313-HSD. In addition, this enzyme shows a similar affinity to both 3H-Preg and 3H-DHEA. The quantification of mRNA expression levels showed that the enzyme is widely presented in classic steroidogenic tissues and several peripheral tissues. Thus the results suggest that deficiencies in 313-HSD enzyme would cause, in addition to congenital adrenal hyperplasia, secondary diseases related to a deficiency of steroid metabolism in the peripheral tissues such as skin, mammary glands, prostate, and brain. A fragment of the encoding region of type 12 1713-HSD cDNA was isolated by RT-PCR in Macaca fascicularis liver mRNA. Using HEK-293 cells which stably express Macaca fascicularis type 12 1715-HSD, we found that the enzyme catalyzes efficiently and selectively the transformation of El into E2. In addition, Macaca fascicularis 1713- HSDI2 mRNA is broadly expressed in all tissues examined, with the highest levels found in the cerebellum, spleen, and adrenal. These results strongly suggested that this enzyme act as a partner of aromatase in the formation of active estrogen in various tissues. Using isoform-specific primers, the cDNA fragments of Macaca fascicularis AKRIC family members, namely 3a-HSD, type 5 170-HSD and 20a-HSD, have been isolated. The identity of each clone was determined by substrate specificities using HEK-293 cells stably expressing the enzymes. Comparison of the enzymatic characteristics of Macaca fascicularis AKRIC family with human and mouse orthologs shows different substrate specificities between species. Quantification of mRNA expression levels of Macaca fascicularis AKRIC family shows that 1) the 3a-HSD is liver specific, 2) the type 5 170- IISD is mainly found in the kidney and liver, and 3) 20a-HSD is very highly expressed in the kidney, stomach and liver. Such tissue-specific expression patterns are in agreement with the metabolism function of the enzymes.

Chez l'humain, la formation des hormones stéroïdiennes dans les tissus périphériques via le précurseur déhydroépiandrostérone (DHEA) circulant joue un rôle majeur dans le maintien du fonctionnement adéquat des tissus androgéno- et estrogéno-sensibles. Comme les primates ont le pouvoir de sécréter une grande quantité de DHEA via les glandes surrénales, le singe représente ainsi un meilleur modèle animal pour étudier la stéroïdogénèse que le rat ou la souris. Chez ces derniers, l'enzyme 17α-hydroxylase, 17,20-lyase (CYP17) est absente dans les glandes surrénales, lesquelles sont donc incapables de produire et de sécréter la DHEA et la 4-androstène-3,17-dione (4-dione) dans la circulation, comme le font humain et les primates. Dans le présent projet, nous étudions deux enzymes chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui possèdent le potentiel de métaboliser les androgènes, mais les preuves de leur implication réelle sont encore manquantes. La première est la rétinol déshydrogénase de type 12 (RDH12) qui transforme le rétinal en rétinol, les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire suggèrent qu'elle possède la capacité de convertir la dihydrotestostérone (DHT) en 5α-androstane-3p, 17β-diol (3β-diol). La deuxième enzyme est la 17β-hydroxysteroide dehydrogenase (17β-HSD) type 11, qui possède la capacité de catalyser la transformation du 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α-diol) en androstérone (ADT). Pour déterminer les activités catalysées par la RDH12, nous avons préparé des transfectants stables qui expriment l'enzyme en utilisant les cellules transformées de rein embryonnaire d'humain (HEK-293). Nous avons trouvé que Macaca fascicularis RDH12 (mfRDH12) catalyse efficacement et sélectivement la transformation de 5α-androstane-3,17-dione (5α-dione) en epiandrostérone (Epi-ADT) et DHT en 3β-diol, respectivement. L'enzyme est exprimée spécifiquement dans la peau, la glande mammaire et le cerveau. Le niveau d'expression le plus élevé est dans la peau où elle est exprimée spécifiquement dans la glande sébacée. En utilisant l'androgène synthétique R1881 pour déterminer s'il est capable de stimuler l'expression de la RDH12 comme celle de la rétinol déshydrogénase de type 11 (RDH11), une enzyme paralogue de la RDH12, nous avons trouvé que ce produit ne stimule pas l'expression de la RDH12, par contre, il est un inhibiteur puissant de l'activité 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase. Pour déterminer le rôle potentiel de la 17β-HSD type 11 dans le métabolisme des androgènes, nous avons quantifié le niveau d'expression de l'enzyme, déterminé la localisation de l'enzyme dans plusieurs tissus en utilisant le PCR en temps réel et l'hybridation in situ, et examiné s'il y a association avec les tissus androgéno-sensibles.

La 3-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase de type 3 humaine (3α-HSD3) a un rôle essentiel dans l’inactivation de la 5α-dihydrotestostérone (5α-DHT). Par une combinaison de la mutagenèse, de la cinétique et de la cristallographie par rayon-X, nous démontrons que la mutation de la Valine54 à la Leucine54 dans la 3α-HSD3 réduit sa capacité d’inactivation de la 5α-DHT et améliore une activité 20-alpha hydroxystéroïde déshydrogénase. Par ailleurs, la structure cristalline de la 3α-HSD3 en complexe avec la 5α-androstane-3,17-dione/épi-androstérone (A-dione/epi-ADT) a été obtenue par la co-cristallisation, avec la 5α-DHT, ce qui implique que la 5α-DHT a des modes de liaison alternative avec la 3α-HSD3. La suppression de l’expression de la 3α-HSD3 par des ARNsi ne fait pas seulement qu’augmenter la concentration de la 5α-DHT dans les cellules MCF7, mais elle diminue aussi la prolifération cellulaire des cellules MCF7 en présence de 5α-DHT. Le récepteur des estrogènes de type alpha (ERα) contrôle le développement sexuel et les fonctions reproduction. Nous avons mis en place une méthode de purification du fragment de l’ERα incluant son domaine de liaison à l’ADN et de son domaine de liaison au ligand (DBD-LBD). La cristallogenèse préliminaire de l’ERα DBD-LBD en complexe avec les éléments de réponse à l’estrogène a été effectuée. Par ailleurs, nous avons rapporté une méthode de purification simple et efficace pour le domaine de liaison au ligand de l’ERα. / Human 3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase type 3 (3α-HSD3) has an essential role in the inactivation of androgen 5α-dihydrotestosterone (5α-DHT). By a combination of mutagenesis, kinetics and X-ray crystallography, we demonstrate that the mutation of Valine54 to Leucine54 in 3α-HSD3 reduces its 5α-DHT inactivation ability and enhances a 20-alpha hydroxysteroid dehydrogenase activity. Furthermore, the crystal structure of 3α-HSD3 in complex with 5α-androstane-3,17-dione/epi-androsterone (A-dione/epi-ADT) is obtained by co-crystallization with 5α-DHT, which implies that 5α-DHT has the alternative binding mode within 3α-HSD3. Suppression of 3α-HSD3 expression by specific siRNA not only increases 5α-DHT concentration in MCF7 cells, but also decreases MCF7 cell proliferation in the presence of 5α-DHT. Estrogen receptor alpha (ERα) controls sexual development and reproductive functions. We establish a purification protocol of ERα fragment including its DNA binding domain and ligand binding domain (DBD-LBD). Preliminary crystallogenesis of ERα DBD-LBD in complex with estrogen response elements is carried out. Additionally, we report a simple and efficient purification method for ERα LBD.

Le cancer de l’ovaire est l’une des cinq causes les plus fréquentes de décès par cancer chez les femmes dans le monde développé. Environ 90% des cancers de l’ovaire proviennent de l’épithélium que l’on nomme cancer de l’ovaire épithélial (EOC). Le EOC est un cancer hormono-dépendant et les stéroïdes sexuels jouent un rôle crucial en favoriant la prolifération et de la survie des cellules. Les 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) jouent un rôle important pour le contrôle de la concentration intracellulaire de tous les stéroïdes sexuels actifs. Le mécanisme qui reculent le fonctionnent et l’expression des 17β-HSDs dans le EOC sont très peu compris. L’inhibition de certains 17β-HSDs pourrait être un traitement de l’EOC et ette approche thérapeutique doit être étudiée. Les résultats de notre étude ont démontré que les 17β- HSD types 1, 5 et 7 sont tous exprimés dans les cellules OOC-3, mais que la type 1 est la plus abondante. L’expression des 17β-HSD types 1 et 7 dans les tumeurs ovariennes épithéliales que dans les ovaires normaux (type 1, 2.2 fois; type 7, 1.9 fois). Mais l’expression de la 17β-HSD 5 est significativement plus faible dans les tumeurs, suite au développement de l’EOC (-5.217 fois). De plus, la prolifération cellulaire a diminué à la suite du knockdown la 17β-HSD type 1 ou type 7 par des siRNAs spécifiques dans les cellules OVCAR-3, mais, le knockdown de la type 5 a un effet contraire. Nous suggérons que la 17β-HSD 5 peut être impliquée dans une signalisation d’hormones stéroïdiennes pour le développement du cancer de l’ovaire épithélial. Les 17β-HSD 1 et 7 pourraient être des biomarqueurs importants pour l’EOC diagnostiqué tôt et ils peuvent également être de nouvelles cibles pour le traitement de l’EOC. / Ovarian cancer is one of the top five commonest causes of female cancer death in the developed world. About 90% of ovarian cancer have epithelial origins. Epithelial ovarian cancer (EOC) is a hormone-dependent cancer, in which the sex steroids play a crucial role in maintaining the cell proliferation and survival. The 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSDs) are important in the control of intracellular concentration of all active sex steroids. The function and expression of 17β-HSDs in EOC is not fully understood. Whether or not 17β-HSDs could be a therapeutic approach for the EOC treatment needs to be studied. Our results showed that 17β-HSD types 1, 5 and 7 are all expressed in EOC cells OVCAR-3 and type 1 is the highest one. The expression of 17β-HSD types 1 and 7 is higher in epithelial ovarian tumor tissues than in normal ovaries (type1, 2.2-fold; type7, 1.9-fold), but the expression of 17β-HSD type 5 is significantly lower in the tumor, following the EOC development (-5.2-fold). We found that cell proliferation was decreased after 17β-HSD type 1 or 7 knockdown by specific siRNAs in OVCAR-3 cells. While knocking down type 5 has the opposite effect. We suggest that 17β- HSD type 5 may be involved in steroid hormone signaling in EOC development. Moreover, 17β-HSD types 1 and 7 could be important biomarkers for early diagnosed EOC and novel targets for EOC treatment.

La famille des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) est responsable de l'inter-conversion entre les stéroïdes estrogéniques ou androgéniques peu actifs (cétone) et très actifs (alcool). Plus précisément, les iso formes 1, 7 et 12 catalysent principalement la réduction de l'estrone (El) en estradiol (E2) soit l'hormone la plus estrogénique. Les estrogènes et les androgènes actifs sont impliqués dans le développement de plusieurs maladies hormono-dépendantes, tel que le cancer du sein et le cancer de la prostate, respectivement. Puisque les 17β-HSDs contrôlent la synthèse des estrogènes et des androgènes actifs en catalysant la dernière étape de leur biosynthèse, l'inhibition de ces enzymes constitue une approche intéressante d'un point de vue thérapeutique, puisqu'elle permettrait de réduire la concentration des hormones actives dans la circulation et par conséquent, pourrait empêcher la prolifération des cellules cancéreuses sensibles aux estrogènes et androgènes. Dans le but d'améliorer l'activité des inhibiteurs de la 17β-HSD1, trois nouvelles familles (époxydes, lactones et furanes) de dérivés de l'estradiol en positions 16 et 17 Ont été préparées. Des expériences d'amarrage moléculaire (docking) ont été réalisées en utilisant comme point de départ la structure tridimensionnelle de l'inhibiteur EM-1745, un hybride estradiol/adenosine complexé avec la 17β-HSD1. Parmi les nombreux composés synthétisés, les composés furaniques se sont révélés les meilleurs inhibiteurs. Les réactions de méthathèse de Grubbs et d'hydrogénation catalytique sont des étapes clefs dans la synthèse de ces composés. Dans le but d'obtenir des inhibiteurs de la 17β-HSD12, deux séries de 17a-amidodésoxyestradiol ayant deux niveaux de diversité moléculaire ont été préparées à l'aide de la chimie en solution. La première série a été obtenue à l'aide de la chimie en parallèle alors que les composés de la deuxième série ont été obtenus par réaction de carbonylation directe en utilisant les micro-ondes. La chimie en parallèle en solution ou sur support solide a été choisie comme une méthode rapide pour préparer plusieurs produits, accélérant ainsi la découverte de nouveaux agents thérapeutiques. Finalement, le "linker triazene" a été adapté à la chimie des stéroïdes afin d'obtenir des librairies de dérivés stéroïdiens déshydroxylés (sans OH) en position 3, ces produits étant connus pour avoir une bonne affinité avec la 17β-HSD12.

Les 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSD) sont un groupe de 15 enzymes connues avant tout pour leur rôle dans le métabolisme des hormones sexuelles. La 17β-HSD1 est responsable de la toute dernière étape dans la fabrication des estrogènes actifs. Cela en fait une cible intéressante pour traiter l’endométriose et le cancer du sein qui sont stimulées par ces hormones. Le dérivé stéroïdien PBRM, conçu dans notre laboratoire, est l’une des rares molécules ayant démontré une inhibition forte et spécifique de la 17β-HSD1. Lors des présents travaux, l’effet de l’inhibiteur s’est avéré irréversible, sélectif et durable tout en présentant un profil intéressant chez la souris. Durant ce processus, plusieurs composés n’ayant pas les qualités requises ont été mis de côté. Parmi eux, l’un s’est avéré être un activateur de la 17β-HSD12, une enzyme essentielle dans l’élongation des acides gras. Il s’agit là du premier activateur rapporté pour la famille des 17β-HSD. / 17β-Hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSD) are a group of 15 enzymes known firstly for their involvement in sexual hornomes metabolism. 17β-HSD1 is responsible of the last step in the biosynthesis of potent estrogens. It is thus an interesting target to treat diseases stimulated by those hormones such as endometriosis and breast cancer. PBRM, a steroidal inhibitor developed in our laboratory, is one of the few molecules that shown a strong and specific inhibition of 17β-HSD1. The present works showed that the inhibitory effect is irreversible, selective and long-lasting while showing an interesting profil in mice. During that process, many other compounds were tested but didn’t have the required qualities. Among them, one seemed to stimulate the activity of 17β-HSD12, an essential enzyme for fatty acids elongation also involved in estrogen metabolism. It is the first reported activator for a member of 17β-HSD family.

À cause de leur implication dans la biosynthèse des estrogènes et des androgènes, les enzymes de la famille des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17β-HSDs) types 1, 3 et 5 sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement des cancers estrogéno-dépendants et androgéno-dépendants. Malgré l’existence d’inhibiteurs de la 17β-HSD1, il n’y a pas encore de traitement du cancer du sein basé sur leur utilisation. Le CC-156 est un inhibiteur connu de la 17β-HSD1; cependant, à cause de son noyau stéroïdien, ce composé de type estrane stimule la prolifération des cellules cancéreuses sensibles aux estrogènes, limitant ainsi son utilisation thérapeutique. Afin de développer des inhibiteurs non estrogéniques de la 17β-HSD1, nous avons synthétisé trois mimiques non stéroïdiennes du CC-156 à partir du bromhydrate du tétrahydro-isoquinolinol. Bien que ces composés inhibent peu la 17β-HSD1, ils sont non estrogéniques. Nous avons aussi développé une voie de synthèse pour préparer deux chimiothèques possédant chacune 75 mimiques de l’estradiol. Ces derniers, plus flexibles que les dérivés précédents, ont été conçus et synthétisés comme potentiels inhibiteurs de la stéroïde sulfatase ou pour agir comme modulateurs sélectifs du récepteur des estrogènes. L’inhibition de la 17β-HSD3 ou de la 17β-HSD5 permettrait de diminuer le taux des androgènes circulants et tumorals. En partant de l’androstérone (ADT), nous avons préparé une nouvelle famille d’inhibiteurs de la 17β-HSD3: des 3-spiromorpholinone-ADT et des 3-spirocarbamate-ADT ayant divers groupements hydrophobes sur leur cycle E supplémentaire. Afin de poser un premier jalon pour la synthèse d’inhibiteurs hybrides des 17β-HSD3 et 17β-HSD5, une spiromorpholinone ou un spirocarbamate a été ajouté en position C-3 d’une 17-spiro-δ-lactone. Brièvement, trente-deux 3-spiromorpholinone-ADT, cinq 3-spirocarbamate-ADT, trois 17-monospiro-δ-lactone-ADT et deux 3,17-dispiroandrostane-ADT ont été synthétisés. Quatre spiromorpholinones non stéroïdiennes ont aussi été synthétisées afin d’étudier le rôle du noyau androstane sur l’efficacité des inhibiteurs de la 17β-HSD3. Tous les produits finaux et les intermédiaires ont été caractérisés par spectrométries de RMN 1H, RMN 13C, IR et SM. Le potentiel inhibiteur de tous ces composés sur la 17β-HSD3 et leur androgénicité ont été mesurés. L’analyse des relations structure-activité a permis d’obtenir deux inhibiteurs efficaces et non androgéniques de la 17β-HSD3.

Les 17p-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17p-HSDs) sont responsables de la formation des estrogènes et des androgènes. Plus précisément, les isoformes 1, 7 et 12 catalysent la réduction de l'estrone (E|) en estradiol (E2) soit l'estrogène le plus puissant, tandis que l'isoforme 3 permet la formation de la testostérone (T) à partir de l'androstène-3,17-dione (A4-dione). Ces hormones stéroïdiennes sont impliquées dans le développement de maladies sensibles aux estrogènes et aux androgènes comme les cancers du sein et de la prostate respectivement. L'inhibition de ces enzymes permettrait de réduire le niveau d'hormones actives dans la circulation et par conséquent, de diminuer le développement de tumeurs. L'étude de divers modèles de lignées de cancer du sein a permis d'identifier la lignée T-47D comme la plus intéressante pour faire l'évaluation de l'activité inhibitrice et estrogénique des inhibiteurs de la 17P-HSD type 1. Nous avons pu identifier plusieurs molécules efficaces pour bloquer la transformation de Ei en E2 ainsi que pour diminuer la prolifération cellulaire des lignées de cancer du sein. Une étude de criblage d'inhibiteurs de la 17(3-HSD type 12 a également permis d'identifier un composé inhibant efficacement l'activité de cette enzyme. Dans le cas de la formation des androgènes, nous avons d'abord déterminé que le A4-dione, le précurseur de T, n'était pas androgénique par lui-même, supportant l'hypothèse que l'utilisation d'inhibiteurs de la 17P-HSD type 3 permettra de réduire efficacement les niveaux de T dans la circulation. L'évaluation de plusieurs inhibiteurs de la 17P-HSD type 3 a permis d'identifier certains composés qui sont efficaces pour inhiber la transformation de A4-dione en T dans des cellules intactes HEK-293 avec des valeurs de IC50 en dessous du micromolaire. Les cellules intactes HEK-293 transfectées s'avèrent le meilleur modèle pour évaluer la transformation de A4-dione en T par la 17P-HSD type 3.

La 17β-HSD1 catalyse l’activation de l’oestrogène le plus actif, l’estradiol, ainsi que la désactivation de la dihydrotestosterone, l’androgène le plus puissant. Cette enzyme est considé ré e comme une cible prometteuse pour le traitement des maladies dépendantes des oestrogènes. Malgré des décennies de recherches, aucun inhibiteur ciblant la 17β-HSD1 n’a encore atteint le stade clinique. De plus, le mécanisme de l’inhibition du substrat de la 17β-HSD1, qui peut être utilisé pour faciliter la conception d’inhibiteur, n’est toujours pas bien dé montré de maniè re structurelle. Ici, nous avons Co-cristallisé trois inhibiteurs de différence, à savoir l’EM- 139, le 2-MeO-CC-156 et le PBRM, avec la 17β-HSD1 et avons résolu ces structures cristallines. L’inhibiteur ré versible EM-139 s’est révélé moins stable dans le site de liaison aux stéroïdes, avec seulement la fraction du noyau stéroïdien de l’inhibiteur présentant une densité d’électron définissable. La fraction volumineuse de 7α-alkyle de l’inhibiteur, qui limite son activité anti-oestrogénique, n’est pas dé finie dans la densité électronique, peut compromettre l’effet inhibiteur de l’inhibiteur sur l’enzyme. Quant à l’inhibiteur réversible, le 2-MeO-CC-156, il interagit de maniè re similaire que le CC-156 avec l’enzyme. Cependant, avec la présence du groupe 2-MeO, le pouvoir inhibiteur de la 17β-HSD1 est nettement infé rieur à celui du CC-156. L’analyse du complexe ternaire PBRM avec la 17β-HSD1 montre clairement la formation d’une liaison covalente entre l’His221 et la chaîne laté rale bromoethyl de l’inhibiteur, donnant un aperç u des interactions molé culaires bé né fiques qui favorisent la liaison et l’avè nement de N-alkylation ulté rieur dans le site catalytique de l’enzyme. En outre, le groupe bromoethyl en position C-3 du PBRM justifie son profil non oestrogénique, ralentit son mé tabolisme et assure son action spé cifique de la 17β-HSD1 par la formation d’une liaison covalente avec Nε du ré sidu His221. Nous avons aussi Co-cristallisé la 17β-HSD1 avec l’oestrone ainsi qu’avec l’analogue de l’oestrone et du cofacteur NADP+, la structure a révélé un mode de liaison inversé de l’oestrone dans l’enzyme, jamais trouvé dans les complexes d’estradiol. L’analyse structurale a démontré que His221 est le résidu clé responsable de la réorganisation et de la stabilisation de l’oestrone liée de manière inversée, conduisant à la formation d’un complexe sans issue. Ainsi, sur la base du mécanisme d’inhibition du substrat et de l’analyse computationnelle, une novelle entité chimique (SX7) est proposé e qui peut inhiber la 17β-HSD1 et former un complexe sans issue. De plus, avec un grand nombre d’échantillons cliniques, nous avons dé montré la modulation et la corrélation d’expression significative de plusieurs enzymes clés de conversion des sté roïdes, supportant les 17β-HSD1 et 17β-HSD7 ré ductrices comme cibles prometteuses et la nouvelle thé rapie combiné e ciblant les 11β-HSD2 et 17β- HSD7 / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) catalyzes the activation of the most potent estrogen estradiol as well as the deactivation of the most active androgen dihydrotestosterone, and is considered as a promising target for the treatment of estrogen-dependent diseases such as endometriosis, breast cancer, endometrial cancer and ovarian cancer. Despite decades of research, no inhibitor targeting 17β-HSD1 has yet reached the stage of clinical trials. Moreover, the structure-biological function of the substrate inhibition of 17β-HSD1, which can be used to facilitate the inhibitor design, is still not well demonstrated. Here we co-crystallized three different inhibitors, namely EM-139, 2-MeO-CC-156 and PBRM, with 17β-HSD1 and solved the structures of these complexes. The reversible inhibitor EM-139 showed high mobility in the steroid binding site with only its steroid core moiety could be defined in the electron density. The bulky 7α-alkyl moiety of the inhibitor, which guarantees its anti-estrogenic activity but unable to be defined in the electron density, may compromise the inhibitory effect of the inhibitor on the enzyme. As for the reversible inhibitor 2-MeO-CC-156, it interacts similarly to CC-156 with the enzyme. However, in the presence of the 2- MeO group, it shows much less inhibitory potency to 17β-HSD1 as compared to the CC-156. The analysis of the PBRM ternary complex with 17β-HSD1 clearly shows an unambiguous continuity of electron density from the side chain of His221 to the bound PBRM, demonstrating the formation of a covalent bond between the Nε of His221 and the C-31 (BrCH2) of the inhibitor. This result provides insight into beneficial molecular interactions that favor the binding and subsequent N-alkylation event in the enzyme catalytic site. Also, the bromoethyl group at position C-3 of the PBRM warrants its non-estrogenic profile, slows down its metabolism, and secures the specific action of 17β-HSD1 through the formation of a covalent bond with Nε of residue His221. Meanwhile, we co-crystallized 17β-HSD1 with estrone as well as with estrone and cofactor analog NADP+, revealed a reversely orientated binding mode of estrone in the enzyme, never found in reported estradiol complexes. Structural analysis demonstrated that His221 is the key residue responsible for the reorganization and stabilization of the reversely bound estrone, leading to the formation of a dead-end complex. Thus, based on the substrate inhibition mechanism and computational analysis, a chemical entity (SX7) is proposed that may inhibit 17β-HSD1 and form a dead-end complex. Furthermore, with large number clinical samples, we demonstrated the significant expression modulation and expression correlation of several key steroidconverting enzymes, supporting the reductive 17β-HSD1 and 17β-HSD7 as promising targets and the new combined therapy targeting 11β-HSD2 and 17β-HSD7.

La famille des enzymes 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) humaines est responsable de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Les enzymes réductrices de cette famille, c'est-à-dire la 17β-HSDl, la 17β-HSD5 et la 17β-HSD7, sont impliquées dans la dernière étape de la synthèse des estrogènes actifs, jouant ainsi des rôles importants dans plusieurs cancers reliés au système endocrinien. Les autres facteurs qui permettent la progression ou la deletion de gènes sont les molécules de stéroïdes en action avec les récepteurs stéroïdiens nucléaires. Dans cette thèse, je présente la structure cristalline de la 17β-HSD1 avec plusieurs stéroïdes, incluant A-diol, 3β-diol, DHT et E₁, les deux premiers étant reconnus pour avoir une plus faible affinité pour l'enzyme. De plus, des études de cristallographie, de modélisation par ordinateur aussi bien que des études de biologie cellulaire ont démontré la propriété inhérente de translation des stéroïdes sexuels. Cette étude est d'un intérêt particulier puisqu'elle ouvre de nouvelles portes pour l'exploration d'une thérapie hormonale adjuvante. Je présente, de plus, des études d'inhibition aussi bien que le design et la prédiction de nouveaux inhibiteurs en utilisant la cristallographie, les essais enzymatiques et la modélisation de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD5. Finalement, je présente une étude préliminaire structure-fonction de la 17β-HSD7. Une revue sur plusieurs sujets touchant la cristallogenèse et l'activité de la 17β-HSD est aussi rapportée dans l'annexe.