Dans cette thèse, je présente une étude (1) du rôle de la 17β-HSD5 dans la modulation des taux d'hormones et dans la prolifération, et l'impact de l'expression de la 17β-HSD5 sur d’autres protéines de BC cellules; (2) une étude comparative sur trois enzymes (17β-HSD1, 17β-HSD7 et 3α-HSD3) avec la provision de DHEA et ses substrats directes soit l’E1 ou la DHT. Les principaux résultats obtenus dans cette étude sont les suivants: (1) en utilisant l'ARN d’interférence de la 17β-HSD5, des immunodosages enzymatiques et des tests de prolifération de cellules démontrent que l'expression de la 17β-HSD5 est positivement corrélée à un niveau de T et de DHT dans les BCC, mais négativement corrélée pour l’E2 et la prolifération des cellules de BC (2) les analyses quantitatives de PCR en temps réel et de Western blot ont démontré que l’inhibition de l’expression de la 17β-HSD5 régule à la hausse l'expression de l'aromatase dans les cellules MCF-7. (3) L’analyse d’ELISA de la prostaglandine E2 a vérifié que l'expression accrue de l'aromatase a été modulée par des niveaux élevés de PGE2 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (4) Le test de cicatrisation a montré que l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5 favorise l’augmentation de la migration cellulaire. (5) L'expression du gène 17β-HSD5 dans des échantillons cliniques, à partir de l'analyse de base de données ONCOMINE, a montré que sa plus faible expression a été corrélée avec le statut de l’HER-2 et de la métastase de la tumeur. (6) Les données protéomiques révèlent également que des protéines impliquées dans les voies métaboliques sont fortement exprimées dans les cellules MCF-7 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (7) L’étude n'a démontré aucune différence dans la fonction biologique de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD7 lorsqu'elles sont cultivées avec différentes stéroïdes: tel que les niveaux de stéroides, la prolifération cellulaire et les protéines régulées. (8) Toutefois, la supplémentation du milieu de culture se révèle avoir un impact marqué sur l'étude de la 3α-HSD3. (9). Nous avons proposé que l'utilisation de la DHEA comme source d'hormone puisse entraîner une meilleure imitation des conditions physiologiques post-ménopausales en culture cellulaire selon l’intracrinologie. / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 5 (17β-HSD5) mainly synthesizes the activate androgen testosterone (T) from △4-androstenedione (4-dione), then 4-dione and T aromatazion to estrone (E1) and estradiol (E2) by the action of aromatase. 17β-HSD1 and 7 catalyze the formation of E2 from E1 and inactivate androgen dihydrotestosterone (DHT). In this thesis, I present the study of (1) the roles of 17β-HSD5 in the modulation of hormone levels and in the proliferation. and the proteomic study of the impact of the 17β-HSD5 knock down in BCC; (2) a comparative study of three enzymes (17β-HSD1，7 and 3α-HSD3) with the provision of DHEA and the direct substrates, E1 or DHT. The main results obtained in this study are as follow: (1) Using RNA interference of 17β-HSD5, enzyme immunoassays, and cell proliferation assays demonstrate that 17β-HSD5 expression is positively correlated with T and DHT levels in BCC, but negatively correlated with E2 levels, and BCC proliferation. (2) Quantitative real-time PCR analyzes and western blot showed that 17β-HSD5 knockdown up-regulates aromatase expression in MCF-7 cells. (3) Prostaglandin E2 ELISA assay verified that aromatase expression increase was modulated by elevated PGE2 levels after 17β-HSD5 knockdown. (4) Wound healing assay showed that with the knockdown of 17β-HSD5 expression, cell migration increased. (5)17β-HSD5 gene expression in clinical samples from ONCOMINE analysis showed its lower expression was correlated with HER-2 status and tumor metastasis. (6) The proteomic data also reveal that proteins involved in metabolic pathways are highly expressed in 17β-HSD5 knockdown MCF-7 cells. (7) Cell biology study showed no difference in biological function for 17β-HSD1 and 17β-HSD7 when cultured with different steroids cell proliferation and estradiol levels decreased, whereas DHT accumulated; cyclin D1, PCNA, and pS2 were down-regulated after knocking down these two enzymes. (8) The culture medium supplementation was found to have a marked impact on the study of 3α-HSD3. (9) We first proposed that using DHEA as hormone source may result in better mimicking of the physiological conditions of post-menopausal in cell culture according intracrinology.

L'influence de l'estradiol, de la dihydrotestostérone et de la corticostérone sur l'expression génétique de l'enzyme Il β-hydroxystéroïde déshydrogénase de types 1 et 2 a été évaluée par l'analyse semi-quantitative de résultats d'hybridation in situ des ARN messagers correspondants. Le rein, le foie, les glandes surrénales, les glandes préputiales, les glandes clitoridiennes, la prostate, les glandes mammaires, l'utérus et le vagin ont été les tissus à l' étude. Des souris mâles et femelles ayant d'abord subi une gonadectomie ou une adrénalectomie (l'ablation des organes principalement producteurs des hormones stéroïdiennes en question) ont ensuite reçu le remplacement hormonal correspondant à la chirurgie de chaque sujet. Les résultats ont démontré une régulation de la Il phydroxystéroïde déshydrogénases de types 1 et 2 par ces stéroïdes hormonaux, mais de façon différente, selon le tissu et selon le sexe. La localisation des enzymes a aussi été identifiée au niveau cellulaire. Aussi, la distribution de la Il β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 présente un dimorphisme sexuel au niveau du rein.

L' étiologie du cancer de l'endomètre est méconnue. Pourtant, la LH et les prostaglandines activent via- leurs récepteurs spécifiques exprimés dans le cancer de l'endomètre, un second messager commun, soit l'AMPc impliquée dans la prolifération et l'invasion du cancer de l'endomètre. Les gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 sont surexprimés dans le cancer de l'endomètre et leur expression est connue pour répondre à la voie de l'AMPc via une stimulation par la LH et les prostaglandines. Les facteurs de transcription NUR 77 et C/EBPβ sont impliqués dans différents cancers et sont activés par la voie AMPc/PK.A, d'où notre hypothèse qu' ils pourraient activer la transcription des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 dans le cancer de l'endomètre. L'objectif de l 'étude est de déterminer si les facteurs NUR77 et C/EBPβ sont présents dans des lignées cellulaires du cancer de l'endomètre et s' ils pourraient être impliqués dans l'expression des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 dans ces cellules. J' ai pu démontrer la présence des deux facteurs dans différentes lignées cellulaires du cancer de l'endomètre. Cependant, mes résultats de transfections transitoires démontrent que NUR 77 et C/EBPβ activent faiblement les trois promoteurs à l'étude d'où l'intérêt de chercher d'autres collaborateurs impliqués dans l'expression des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 ou encore d' autres gènes régulés cibles par NUR77 et C/EBPβ dans le cancer de l'endomètre.

L’estrogène le plus actif, soit l’œstradiol (E2), stimule la prolifération des cellules du cancer du sein, alors que la dihydrotestostérone (DHT), qui est l’androgène le plus actif, prévient la croissance des cellules du cancer du sein hormonodépendant dans certaines concentrations et conditions physiologiques. Il a été rapporté que la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 7 (17β-HSD7) détient deux activités enzymatiques. La première activité est la réduction de l’E1 en E2 et la seconde activité est l’inactivation de la DHT en 3β-diol qui pourrait permettre de jouer un rôle dans la cancérogenèse des cellules tumorales du cancer du sein hormonodépendants. À ce jour, très peu d’informations sont disponibles à propos des activités catalytiques de cette protéine et aucune structure tridimensionnelle n’est disponible pour mieux comprendre l’implication et les mécanismes enzymatiques de la 17β-HSD7 dans la stéroïdogenèse. Dans cette étude, nous avons développé un protocole permettant l’expression et la purification de la 17β-HSD7 active et stable à partir d’un système bactérien. Nous avons aussi déterminé les paramètres de cinétique enzymatique à l’état stationnaire et nous avons obtenu des conditions de cristallisation qui ont permis d’obtenir des cristaux préliminaires. Les résultats de cinétique enzymatique ont démontré que la 17β-HSD7 réduit l’E1 en E2 et la DHT en 3β-diol à des vitesses de conversion et des spécificités de même ordre. De plus, nous avons confirmé que l’inhibition de la 17β-HSD7 avait un impact aussi important dans la diminution de la vitesse de conversion de l’E1 en E2 que l’inhibition de la 17β-HSD1 dans des lignées cellulaires de tumeurs du sein hormonodépendant. Aussi, la 17β-HSD7 est beaucoup plus spécifique pour la réduction de la DHT que la 17β-HSD1 a une activité réductrice de la DHT. Ces résultats mettent en évidence le rôle de la 17β-HSD7 dans la carcinogenèse du cancer du sein. / The most potent estrogen, estradiol (E2), stimulates proliferation, while the dihydrotestosterone (DHT) prevents it in estrogen dependent breast cancer cells. It brought reported that 17ß-HSD7 has two major reduction activities which can reduce E1 to E2 and inactivate the DHT to 3ß-diol. To this day, the detailed kinetic parameters and crystalline structure of the 17ß-HSD7 are unknown and theses knowledge allow a better understand of is implication in steroidogenesis. In this study, a purification protocol was developed to obtain pure 17ß-HSD7 in bacterial system to determine the steady state kinetic parameters of the 17ß-HSD7, and also its crystallization condition. Firstly, we were able to express and purify the 17ß-HSD7 in E. coli at purity over 95%. Secondly, the results of enzymatic kinetics demonstrated that the 17ß-HSD7 reduced both steroids at similar rates. Finally, the crystallization conditions were determined to growth some preliminary crystals of the 17ß-HSD7. Furthermore, we were able to confirm that the inhibition of the 17ß-HSD7 had a higher impact in to decrease the conversion of E1 in E2 than the inhibition of the 17ß-HSD1 in breast cancer cell lines. At the same time the 17ß-HSD7 demonstrates an effect on DHT reduction much more important than the 17ß-HSD1. These results highlight the role of the 17ß-HSD7 in the carcinogenesis of the breast cancer.

II a été proposé qu'une partie des effets bénéfiques des agonistes des récepteurs nucléaires activés par les proliférateurs des peroxisomes gamma (PPARy) sur le remodelage du tissu adipeux et la sensibilité à l'insuline serait attribuable à une réduction des niveaux de glucocorticoïdes (GC), via une diminution de l'expression de la 11 P-hydroxystéroïde déshydrogénase type 1 (IIB-HSDl) dans le tissu adipeux. Cette enzyme permet l'activation des GC principalement au niveau du foie et du tissu adipeux et serait possiblement impliquée dans la pathogenèse de l'obésité. Une première série d'études a permis d'évaluer la contribution des GC (circulants/tissulaires) dans les mécanismes d'action de l'agoniste de PPARy rosiglitazone au niveau du remodelage du tissu adipeux et du profil métabolique chez des rats nourris avec une diète standard. Le maintien des effets bénéfiques de la rosiglitazone sur la morphologie et le profil lipidique du tissu adipeux intra-abdominal (rétropéritonéal) a résulté: (1) en un effet additif de l'agonisme PPARy et de la surrénalectomie sur la triglycéridémie et la sensibilité à l'insuline; (2) en la prévention des effets délétères de l'hypercorticostéronémie, tels la stéatose hépatique, l'hyperlipidémie et l’hyperinsulinémie. L'absence d'effet additif d'un traitement combiné (rosiglitazone/inhibiteur de la llB-HSDl) a montré que la contribution des GC dans les mécanismes d'action de la rosiglitazone au niveau des paramètres étudiés est minime et que les effets de l'agoniste englobent largement les effets bénéfiques associés à une diminution de l'action des GC dans le tissu adipeux. Une deuxième série d'études a visé à établir l'implication de la llB -HSDl dans le métabolisme lipidique chez des rats nourris avec une diète obésogène. L'inhibition pharmacologique de la llB -HSDl a induit: (1) une augmentation des processus oxydatifs et une diminution de la stéatose et de la sécrétion hépatique de VLDL; (2) un effet tissu-spécifique sur le métabolisme lipidique des dépôts adipeux intra-abdominaux, en améliorant tout particulièrement le profil délétère du tissu adipeux mésentérique; (3) une redistribution de la captation des lipides circulants vers les tissus oxydatifs et un accroissement de leur capacité oxydative. Ainsi, la llB -HSDl représente une cible thérapeutique attrayante pour le traitement des désordres reliés à l'obésité. / It has been suggested that part of the beneficial effects of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARy) agonists on adipose tissue remodelling and insulin sensitivity would be attributable to a reduction in glucocorticoid (GC) levels, through a decrease in IIB-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (IIB-HSDl) in adipose tissue. This enzyme is implicated in GC activation principally in liver and adipose tissue, and may be involved in the pathogenesis of obesity. A first set of studies allowed the evaluation of the contribution of GC (plasma and tissue) in the mechanisms of action of the PPARy agonist rosiglitazone at the level of adipose tissue remodelling and the metabolic profile in rats fed a standard diet. The results suggest that maintenance of the beneficial effects of rosiglitazone on intraabdominal (retroperitoneal) adipose tissue morphology and the lipid profile resulted in: (1) an additive effect of PPARy agonism and adrenalectomy on triglyceridemia and insulin sensitivity, and (2) the prevention of the deleterious effects induced by hypercorticosteronemia, such as hepatic steatosis, hyperlipidemia and hyperinsulinemia. The lack of additive effect of the combined treatment (rosiglitazone/ IIB-HSDl inhibitor) allowed us to conclude that the contribution of GC in the mechanisms of action of rosiglitazone at the level of the parameters studied is minimal, and that the beneficial effects of PPARy agonism largely include those associated with a decrease in GC action in adipose tissue. A second set of studies aimed at establishing the role of IIB-HSDl in lipid metabolism in rats fed an obesity-promoting diet. Pharmacologic inhibition of IIB-HSDl induced: (1) an increase in oxidative processes and a decrease in hepatic steatosis and VLDL secretion; (2) a tissue-specific effect on intra-abdominal adipose depot lipid metabolism, including a robust improvement in the metabolic handling of lipids in mesenteric adipose tissue; (3) lipid partitioning towards oxidative tissues and an increase in their oxidative capacity. IIB-HSDl therefore constitutes an attractive therapeutic target for the treatment of obesity-related disorders.

Le projet de recherche présenté dans cette thèse visait à caractériser la fonction de l'enzyme 17ß-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 12 (17ß-HSD12), qui catalyse la synthèse d'estradiol, par opposition à son homologue la 17ß-HSD3, impliquée dans la production testiculaire de testosterone. Dans un premier temps, nous avons observé que le processus de différenciation adipocytaire était associé avec une augmentation drastique de l'activité 17ß-HSD estrogénique, elle-même concomitante avec une élévation des niveaux d'expression de l'enzyme 17ß-HSD12, lui suggérant donc une fonction estrogénique importante, du moins au niveau des cellules adipeuses humaines. Parallèlement, nous avons pu confirmer l'importance de l'acide aminé 234 au niveau de l'activité et de la spécificité estrogénique via la caractérisation des enzymes 17ß-HSD12 de singe et de rat, toutes deux tributaires d'une phenylalanine à cette position critique, par opposition aux orthologues de C.elegans et de souris, qui eux possèdent un acide aminé en position 234 moins encombrant, permettant à la 17ß-HSD12 de convertir à la fois les androgènes et les estrogènes chez ces deux espèces. Enfin, par la génération d'un modèle de souris déficiente en 17ß-HSD12, nous avons conclu que la 17ß-HSD12 possédait une fonction physiologique supplémentaire, différente de son activité estrogénique. En effet, malgré le fait que nous envisagions un phénotype qui aurait dû refléter une déficience estrogénique, du moins au niveau de certains tissus, aucun homozygote portant la deletion n'a vu le jour, l'absence de 17ß-HSD12 fonctionnelle causant une létalité complète au niveau embryonnaire. Il est fort probable que cet arrêt du développement embryonnaire soit attribuable à la fonction d'élongation des acides gras ayant précédemment été reconnue à la 17ß-HSD12. L'ensemble de ces résultats porte à croire que la 17ß-HSD12 serait une enzyme bifonctionnelle, exerçant une action importante au niveau de la production des acides gras à longues chaînes, mais démontrant également une implication dans la production de molécules stéroïdiennes actives, tout dépendant du contexte cellulaire.

La 17β-HSD1 catalyse l’activation de l’oestrogène le plus actif, l’estradiol, ainsi que la désactivation de la dihydrotestosterone, l’androgène le plus puissant. Cette enzyme est considé ré e comme une cible prometteuse pour le traitement des maladies dépendantes des oestrogènes. Malgré des décennies de recherches, aucun inhibiteur ciblant la 17β-HSD1 n’a encore atteint le stade clinique. De plus, le mécanisme de l’inhibition du substrat de la 17β-HSD1, qui peut être utilisé pour faciliter la conception d’inhibiteur, n’est toujours pas bien dé montré de maniè re structurelle. Ici, nous avons Co-cristallisé trois inhibiteurs de différence, à savoir l’EM- 139, le 2-MeO-CC-156 et le PBRM, avec la 17β-HSD1 et avons résolu ces structures cristallines. L’inhibiteur ré versible EM-139 s’est révélé moins stable dans le site de liaison aux stéroïdes, avec seulement la fraction du noyau stéroïdien de l’inhibiteur présentant une densité d’électron définissable. La fraction volumineuse de 7α-alkyle de l’inhibiteur, qui limite son activité anti-oestrogénique, n’est pas dé finie dans la densité électronique, peut compromettre l’effet inhibiteur de l’inhibiteur sur l’enzyme. Quant à l’inhibiteur réversible, le 2-MeO-CC-156, il interagit de maniè re similaire que le CC-156 avec l’enzyme. Cependant, avec la présence du groupe 2-MeO, le pouvoir inhibiteur de la 17β-HSD1 est nettement infé rieur à celui du CC-156. L’analyse du complexe ternaire PBRM avec la 17β-HSD1 montre clairement la formation d’une liaison covalente entre l’His221 et la chaîne laté rale bromoethyl de l’inhibiteur, donnant un aperç u des interactions molé culaires bé né fiques qui favorisent la liaison et l’avè nement de N-alkylation ulté rieur dans le site catalytique de l’enzyme. En outre, le groupe bromoethyl en position C-3 du PBRM justifie son profil non oestrogénique, ralentit son mé tabolisme et assure son action spé cifique de la 17β-HSD1 par la formation d’une liaison covalente avec Nε du ré sidu His221. Nous avons aussi Co-cristallisé la 17β-HSD1 avec l’oestrone ainsi qu’avec l’analogue de l’oestrone et du cofacteur NADP+, la structure a révélé un mode de liaison inversé de l’oestrone dans l’enzyme, jamais trouvé dans les complexes d’estradiol. L’analyse structurale a démontré que His221 est le résidu clé responsable de la réorganisation et de la stabilisation de l’oestrone liée de manière inversée, conduisant à la formation d’un complexe sans issue. Ainsi, sur la base du mécanisme d’inhibition du substrat et de l’analyse computationnelle, une novelle entité chimique (SX7) est proposé e qui peut inhiber la 17β-HSD1 et former un complexe sans issue. De plus, avec un grand nombre d’échantillons cliniques, nous avons dé montré la modulation et la corrélation d’expression significative de plusieurs enzymes clés de conversion des sté roïdes, supportant les 17β-HSD1 et 17β-HSD7 ré ductrices comme cibles prometteuses et la nouvelle thé rapie combiné e ciblant les 11β-HSD2 et 17β- HSD7 / Human 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1) catalyzes the activation of the most potent estrogen estradiol as well as the deactivation of the most active androgen dihydrotestosterone, and is considered as a promising target for the treatment of estrogen-dependent diseases such as endometriosis, breast cancer, endometrial cancer and ovarian cancer. Despite decades of research, no inhibitor targeting 17β-HSD1 has yet reached the stage of clinical trials. Moreover, the structure-biological function of the substrate inhibition of 17β-HSD1, which can be used to facilitate the inhibitor design, is still not well demonstrated. Here we co-crystallized three different inhibitors, namely EM-139, 2-MeO-CC-156 and PBRM, with 17β-HSD1 and solved the structures of these complexes. The reversible inhibitor EM-139 showed high mobility in the steroid binding site with only its steroid core moiety could be defined in the electron density. The bulky 7α-alkyl moiety of the inhibitor, which guarantees its anti-estrogenic activity but unable to be defined in the electron density, may compromise the inhibitory effect of the inhibitor on the enzyme. As for the reversible inhibitor 2-MeO-CC-156, it interacts similarly to CC-156 with the enzyme. However, in the presence of the 2- MeO group, it shows much less inhibitory potency to 17β-HSD1 as compared to the CC-156. The analysis of the PBRM ternary complex with 17β-HSD1 clearly shows an unambiguous continuity of electron density from the side chain of His221 to the bound PBRM, demonstrating the formation of a covalent bond between the Nε of His221 and the C-31 (BrCH2) of the inhibitor. This result provides insight into beneficial molecular interactions that favor the binding and subsequent N-alkylation event in the enzyme catalytic site. Also, the bromoethyl group at position C-3 of the PBRM warrants its non-estrogenic profile, slows down its metabolism, and secures the specific action of 17β-HSD1 through the formation of a covalent bond with Nε of residue His221. Meanwhile, we co-crystallized 17β-HSD1 with estrone as well as with estrone and cofactor analog NADP+, revealed a reversely orientated binding mode of estrone in the enzyme, never found in reported estradiol complexes. Structural analysis demonstrated that His221 is the key residue responsible for the reorganization and stabilization of the reversely bound estrone, leading to the formation of a dead-end complex. Thus, based on the substrate inhibition mechanism and computational analysis, a chemical entity (SX7) is proposed that may inhibit 17β-HSD1 and form a dead-end complex. Furthermore, with large number clinical samples, we demonstrated the significant expression modulation and expression correlation of several key steroidconverting enzymes, supporting the reductive 17β-HSD1 and 17β-HSD7 as promising targets and the new combined therapy targeting 11β-HSD2 and 17β-HSD7.

Les enzymes stéroïdiennes 17P-hydroxystéroïdes déshydrogénases types 1 (17P-HSD1) et 5 (17P-HSD5) catalysent la formation de l'estradiol et l'inactivation du dihydrotestostérone (DHT). L'estradiol stimule la croissance des cellules cancéreuses du sein (CCS) tandis que le DHT, à des concentrations physiologiques, exerce un effet antiprolifératif sur elles. Dans cette thèse, je présente les travaux réalisés dans le double but d'évaluer l'effet des deux enzymes sur les niveaux des hormones et la prolifération des CCS et d'évaluer l'impact de l'expression de la 17P-HSD1 sur celle des gènes et protéines exprimés dans ces CCS. Les principaux résultats que j'ai obtenus suite à ces travaux sont les suivants : (1) l'utilisation de petits ARN interférents (siRNA) et d'un inhibiteur stéroïdien a permit de démontrer que l'expression et l'activité de la 17P-HSD1 sont inversement corrélées à la concentration de DHT des CCS mais positivement corrélées à leur niveau d'estradiol et à leur prolifération. Ainsi, la 17P-HSD1 stimule la croissance des CCS au moyen d'une double action sur les niveaux de ces deux hormones. (2) La 17P-HSD5 tend à augmenter le niveau d'estradiol dans la lignée de CCS humain MCF7 et contribue significativement à l'augmentation de sa croissance cellulaire. (3) Des analyses quantitatives de RT-PCR en temps réel ont démontré que la 17P-HSD1 module l'expression endogène des gènes estrogéno-régulés (dont pS2 et c-Myc) ainsi que leur réactivité à l'estradiol dans la lignée de CCS humain T47D. (4) L'analyse de puces à ADN a révélé que, dans les cellules T47D cultivées en l'absence de stéroïde, la 17P-HSD1 est capable de moduler la transcription de plus d'une quarantaine de gènes endogènes comprenant plusieurs protéines kinases impliquées dans la régulation de la croissance cellulaire. (5) Des analyses protéomiques complètes ont montré qu'en présence d'estradiol, la surexpression de la 17P-HSD1 entraine une modification du profil protéomique des cellules MCF7. (6) L'étude protéomique a également révélé que les lignées cellulaires MCF7 et T47D présentent une certaine divergence protéomique. La première exprime plus fortement les protéines impliquées dans la répression de la croissance cellulaire tandis que celles qui contribuent à la stimulation de la prolifération cellulaire sont plus fortement exprimées dans la dernière. / Human 17p-hydroxysteroid dehydrogenases types 1 (17P-HSD1) and 5 (17P-HSD5) catalyze the formation of the active estrogen estradiol (E2) and the inactivation of the androgen dihydrotestosterone (DHT). E2 stimulates breast cancer cell (BCC) growth whereas DHT has shown an antiproliferative effect. In this thesis, I present the study of the roles of 17P-HSD1 and 17P-HSD5 in the modulation of hormone levels and in the proliferation of BCC, and of the impact of the expression of 17P-HSD1 on that of endogenous genes and proteins in BCC. The main results obtained in this study are as follow: (1) using RNA interference and an inhibitor of 17P-HSD1, enzyme immunoassays and cell proliferation assays demonstrate that 17p-HSDl expression is negatively correlated to DHT levels in BCC, but positively correlated to E2 levels and BCC proliferation. 17P-HSD1 up-regulates BCC growth by a dual action on E2 synthesis and DHT inactivation. (2) 17P-HSD5 tends to increase the level of E2 in the human BCC line MCF7 and significantly contributes to the increase of the cell growth. (3) Quantitative real-time RT-PCR analyses showed that 17P-HSD1 modulates the expression of endogenous estrogen-responsive genes (including pS2 and c-Myc) and their responsiveness to E2 in the human BCC line T47D. (4) DNA-microarray analysis revealed that, in T47D cells cultured in steroid-deprived medium, 17P-HSD1 modulates the transcription of more than forty endogenous genes which include several protein kinases involved in cell growth regulation. (5) Complete functional proteomics analyses showed that in the presence of E2, the overexpression of 17pHSD1 modifies the proteomic profile of MCF7 cells. (6) The proteomic data also reveals that the proteomes of T47D and MCF7 cell lines differ significantly and suggest that MCF7 cells express a higher level of proteins implicated in cell proliferation repression than T47D cells, whereas the latter expresses more proteins strongly involved in cell growth progression.

La famille des enzymes 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) humaines est responsable de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Les enzymes réductrices de cette famille, c'est-à-dire la 17β-HSDl, la 17β-HSD5 et la 17β-HSD7, sont impliquées dans la dernière étape de la synthèse des estrogènes actifs, jouant ainsi des rôles importants dans plusieurs cancers reliés au système endocrinien. Les autres facteurs qui permettent la progression ou la deletion de gènes sont les molécules de stéroïdes en action avec les récepteurs stéroïdiens nucléaires. Dans cette thèse, je présente la structure cristalline de la 17β-HSD1 avec plusieurs stéroïdes, incluant A-diol, 3β-diol, DHT et E₁, les deux premiers étant reconnus pour avoir une plus faible affinité pour l'enzyme. De plus, des études de cristallographie, de modélisation par ordinateur aussi bien que des études de biologie cellulaire ont démontré la propriété inhérente de translation des stéroïdes sexuels. Cette étude est d'un intérêt particulier puisqu'elle ouvre de nouvelles portes pour l'exploration d'une thérapie hormonale adjuvante. Je présente, de plus, des études d'inhibition aussi bien que le design et la prédiction de nouveaux inhibiteurs en utilisant la cristallographie, les essais enzymatiques et la modélisation de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD5. Finalement, je présente une étude préliminaire structure-fonction de la 17β-HSD7. Une revue sur plusieurs sujets touchant la cristallogenèse et l'activité de la 17β-HSD est aussi rapportée dans l'annexe.

L 'histoire familiale et l'exposition aux estrogènes sont deux facteurs de risque de cancer du sein bien connus. À l'opposé, les androgènes agissent comme protecteurs dans le tissu mammaire tout comme certains métabolites de la progestérone. Ce sont les membres de la famille des 17f3-hydroxystéroïdes déshydrogénases qui sont responsables des étapes importantes dans la formation et l' inactivation de tous les stéroïdes sexuels. Plus particulièrement, la 17f3-HSD de type 5 est une enzyme clé dans la formation des androgènes et dans l' inactivation de la progestérone en métabolites protecteurs. Nous avons donc procédé à l' identification des variants de séquence du gène HSD 17 B5 chez des femmes canadiennes-françaises ayant eu un cancer du sein. Par la suite, nous avons fait l'analyse fonctionnelle des variants qui entraînent un changement d'acide aminé. Ces différentes expérimentations nous ont permis de vérifier l'implication potentielle de ce gène dans la modulation du risque de développer un cancer du sein.