Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DEBORA.pdf: 1139278 bytes, checksum: 191ff40c879efded12bdb95a873d58d6 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this study was to test the potential neuroprotective action of Hypericum perforatum alcoholic extract on dopaminergic neurons lesioned in rat by the toxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) as an animal model of PD. The 6-OHDA was stereotaxically infused in rats into the medial forebrain bundle unilaterally to test rotational behavior and bilaterally to other tests. Hypericum perforatum was administered at doses of 100, 200 and 400 mg/kg by gavage for 35 days, starting 28 days before the treatment of the lesion. In the test of rotational behavior, a unilateral lesion with 6-OHDA caused an increase in the number of contralateral rotations and this effect was reversed by treatment with Hypericum perforatum. In the sucrose preference test was significant reduction in depressive-like behavior in animals injured with 6-OHDA-treated and Hypericum perforatum. In the forced swimming test, 6-OHDA animals treated with Hypericum perforatum kept less time immobile when compared to 6-OHDA animals treated with vehicle. In the open field test, we observed a significant reduction of locomotor function in the injured groups with 6-OHDA, however, according to results obtained in the forced swimming test, the motor impairment did not affect the immobility time. In the social recognition test, animals treated with 6-OHDA Hypericum perforatum performed significantly better than animals treated with 6-OHDA vehicle. In the olfactory discrimination test, there was no difference in the ability to discriminate odors, and possibly did not olfaction loss in animals injured with 6-OHDA. These results suggest that Hypericum perforatum reduced the death of dopaminergic neurons. This potential neuroprotection was confirmed by analysis of Immunodetection of proteins (Western Blot) by expression of the enzyme tyrosine hydroxylase (TH). Together, these results characterize the Hypericum perforatum as a possible drug to be used in the treatment of PD. / O objetivo deste estudo foi testar o potencial neuroprotetor do extrato alcoólico do Hypericum perforatum sobre neurônios dopaminérgicos de ratos lesionados pela toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) como modelo animal de DP. Ratos tiveram 6-OHDA estereotaxicamente infundida no feixe prosencefálico medial, unilateralmente para o teste de comportamento rotatório e bilateralmente para os demais testes. O Hypericum perforatum foi administrado nas doses de 100, 200 e 400 mg/Kg por gavagem durante 35 dias, iniciando–se o tratamento 28 dias antes da lesão. No teste de comportamento rotatório, a lesão unilateral com 6-OHDA causou um aumento no número de rotações contralaterais e esse efeito foi revertido pelo tratamento com Hypericum perforatum. No teste de preferência a sacarose houve redução significativa do comportamento tipo depressivo nos animais lesados com 6-OHDA e tratados com Hypericum perforatum. No teste de natação forçada, os animais 6-OHDA tratados com Hypericum perforatum permaneceram menos tempo imóveis quando comparados aos animais tratados com veículo. No teste do campo aberto, foi observada redução significativa da função locomotora nos grupos lesados com 6-OHDA, no entanto, de acordo com os dados obtidos no teste de natação forçada, o prejuízo motor não influenciou o tempo de imobilidade. No teste de reconhecimento social, animais 6-OHDA tratados com Hypericum perforatum tiveram um desempenho significativamente melhor do que os animais 6-OHDA tratados com veículo. No teste de discriminação olfativa, não houve diferença na capacidade de discriminação de odores, sendo que possivelmente não houve prejuízo na olfação dos animais lesados com 6-OHDA. Esses resultados sugerem que o Hypericum perforatum reduziram a morte dos neurônios dopaminérgicos. Essa possível neuroproteção foi confirmada através da análise de Imunodetecção de proteínas (Western Blot), através da expressão da enzima Tirosina Hidroxilase (TH). Em conjunto, esses resultados caracterizam o Hypericum perforatum como possível fármaco a ser utilizado no tratamento da DP.

Plantas do gênero Hypericum (Hypericaceae) são reconhecidas fontes de moléculas com fins terapêuticos. Para espécies nativas do sul do Brasil, atividades como antifúngica e antinociceptiva já foram relatadas, atribuídas principalmente a compostos extraídos em suas frações lipofílicas como derivados de floroglucinol, benzopiranos e benzofenonas. Neste estudo, o potencial sinérgico entre frações lipofílicas de H. carinatum e o fármaco fluconazol, frente a fungos leveduriformes emergentes, foi avaliado por duas metodologias distintas: checkerboard e isobolograma. Para isolados de Candida krusei e C. famata o efeito da associação foi superior ao do fármaco isolado. Dessa forma, o perfil de suscetibilidade observado sugere que a fração esteja auxiliando a ação do fármaco. Ainda abordando o potencial terapêutico de espécies de Hypericum, a investigação da atividade antinociceptiva (via oral) do benzopirano HP1 de H. polyanthemum, quando incorporado em nanoemulsões, foi avaliada. Os resultados demonstraram que HP1 pode ser adequadamente incorporado em nanoemulsões, dada sua solubilidade no núcleo oleoso. Em relação ao efeito antinociceptivo, nanoemulsões contendo HP1 demonstraram o mesmo efeito do composto livre, em magnitude, porém em dose inferior. A redução da dose ativa sugere que uma melhor solubilização do composto possa ter ocorrido quando o mesmo está inserido em nanoemulsões. Nesse contexto, estudos de permeabilidade intestinal ex vivo (Ussing chambers) de HP1, na sua forma livre e incorporado em nanoemulsões, foram realizados. Os resultados demonstraram que a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, quando incorporado em nanoemulsões, foi cerca de 4 vezes maior em relação a forma livre. Além disso, experimentos de lipólise in vitro mostraram que enzimas presentes no trato gastrointestinal são hábeis em hidrolisar nanoemulsões a espécies coloidais, mais solúveis e facilmente absorvíveis pelas células intestinais. Ainda, a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, na sua forma livre, no sentido absortivo foi maior que no sentido secretório indicando que transportadores ativos estão, ao menos em parte, auxiliando a absorção deste composto pelas células intestinais. Dessa forma, com vistas a elucidar o provável transportador ativo de HP1, dada a semelhança estrutural deste benzopirano com moléculas canabinoides e a relação existente entre os sistemas opioide e canabinoide, a influência deste último na absorção de HP1 foi investigada. Os resultados demonstraram que o benzopirano HP1 pode estar relacionado ao sistema canabinoide, mas a natureza dessa ligação, seja de transporte, agonismo/antagonismo ou físico-química, não foi possível de ser elucidada. Os resultados obtidos nesta tese são relevantes à medida que espécies de fungos leveduriformes emergentes se mostram cada vez mais resistentes aos fármacos comumente utilizados. Além disso, a importância destes resultados se dá pela viabilidade de incorporação do benzopirano HP1 em nanoemulsões e a capacidade desses sistemas em reduzir a dose ativa no benzopirano HP1 por uma maior solubilização do composto e assim, melhor absorção. Dessa maneira, os resultados deste trabalho representam o alto potencial biológico de espécies de Hypericum e abrem possibilidade para mais estudos utilizando estas plantas. / Plants from genus Hypericum (Hypericaceae) are recognized as a source of therapeutical agents. To south Brazil species, acitivities like antifungal and antinociceptive had already been demonstrated, attributed mainly to compounds from lipophilic fractions as phloroglucinol derivatives, benzophenones and benzopyrans. In this study, antifungal potential of lipophilic fractions of H. carinatum and fluconazole against emerging yeasts was evaluated by two methodologies for multiple dose-response analyzes: checkerboard and isobologram. To Candida krusei and C. famata isolates the effect of association was higher than the effect of fluconazole alone. Thus, the susceptibility profile observed for these species suggests that, somehow, the fractions are facilitating the action of drug. Still on therapeutical potential of Hypericum species, the antinociceptive study of a benzopyran (HP1) isolated from H. polyanthemum, incorporate in nanoemulsions, was evaluated. The results demonstrated that HP1 could be incorporated in a nanoemulsion system, given the high solubility in the oil core. Regarding the antinociceptive effect, HP1 loaded in nanoemulsions showed the same effect of free form, in magnitude, at lower doses. These results suggest a better solubilization of HP1 when loaded in nanoemulsions, and, thus, better absorption by organism. In this context, ex vivo intestinal permeability studies (Ussing chambers) of HP1 free form and loaded in nanoemulsions were performed. The results showed that the intestinal permeability of HP1 loaded in nanoemulsions were about 4 times higher than HP1 free form. Besides, the intestinal permeability of HP1 free form in absorptive direction was higher than secretory direction indicating that active transporters are, at least in part, involved in HP1 intestinal absorption. Thus, in order to elucidate the probable active transporter of HP1 and since its structure looks like a cannabinoid molecule and there is a relation between the opioid and cannabinoid pathways, the influence of intestinal cannabinoid system in HP1 absorption was investigated. The results indicated that the benzopyran HP1 may be related to cannabinoid system, but the nature of this interaction: transport, agonism/antagonism or physico-chemical is still unknown. The outcomes obtained are relevant since the resistance of emerging yeast species to available drugs, used for a variety of fungal infections, is increasing. The importance of these findings lies also in the feasibility of incorporating HP1 into nanoemulsions, and the capacity of these systems in reduce the antinociceptive active doses, by higher solubilization, and thus, absorption. Then, together the results represent the high biological potential of Hypericum species and open new possibilities to further studies with these plants.

Produtos naturais são uma importante fonte de fármacos e muitos vegetais têm sido explorados na busca de substâncias potencialmente ativas. Dentre estas, destacam-se as espécies do gênero Hypericum, principalmente H. perforatum, utilizado há séculos com diversos fins terapêuticos, principalmente no tratamento de feridas. Mais recentemente, a planta está em evidência devido à comprovada atividade antidepressiva, sendo extensamente utilizada em várias partes do mundo no tratamento de depressões leve a moderada. Ambas as atividades citadas se devem a presença de derivados do floroglucinol. As espécies de Hypericum encontradas no sul do Brasil são fonte de floroglucinóis com diversas atividades biológicas descritas. Um dos objetivos deste estudo foi investigar a atividade proliferativa de frações enriquecidas em floroglucinóis de H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, visando indicar possível atividade cicatrizante. Outro objetivo foi ampliar o conhecimento fitoquímico acerca das frações lipofílicas de H. austrobrasiliense e H. caprifoliatum. As partes aéreas, coletadas na época de floração, foram secas, moídas e extraídas com n-hexano. Para os ensaios de proliferação celular foi utilizada uma linhagem de queratinócitos (HaCaT) cultivada in vitro. Os extratos n-hexano das espécies de Hypericum foram caracterizados por CLAE, mostrando a presença majoritária de floroglucinóis. Entre as amostras testadas, as frações de H. carinatum e H. polyanthemum foram as mais promissoras, promovendo uma proliferação 20 a 40% superior àquela obtida com o controle, indicando uma indução no processo de crescimento celular. Os processos cromatográficos realizados com os extratos n-hexano de H. austrobrasiliense levaram ao isolamento de austrobrasilol A, austrobrasilol B e isoaustrobrasilol B, derivados de floroglucinol com estruturas inéditas, do extrato n-hexano de H. caprifoliatum foram obtidos hiperbrasilol B e iso-hiperbrasilol B. Os novos derivados de floroglucinol foram submetidos ao teste da placa aquecida e rotarod, onde demonstraram serem efetivos, provocando uma redução na percepção da dor nos mesmos níveis apresentados pelo floroglucinol dimérico uliginosina B, e não provocaram prejuízo motor. Os resultados obtidos reforçam a importância de vegetais deste gênero como fontes potenciais de compostos biologicamente ativos; neste caso, induzindo a proliferação de células envolvidas na cicatrização e reduzindo a nocicepção, podendo futuramente servir como protótipos de novos agentes cicatrizantes e analgésicos. / Natural products are an important source of vegetable drugs and have been explored in the search for potentially active substances. Among these, there are the species of the genus Hypericum, especially H. perforatum, used for centuries for various therapeutic purposes, highlighting the use in the treatment of wounds. More recently, the plant has received high attention due to the antidepressant activity and is widely used all over the world to treat mild to moderate depression. Both activities could be attributed to the presence of phloroglucinol derivatives. The species of Hypericum native to southern Brazil are a source of phloroglucinols with diverse biological activities. One goal of this study was to investigate the proliferative activity of phloroglucinol enriched fractions of H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum and H. polyanthemum, aiming to indicate possible wound healing activity. Another objective was to expand the phytochemical knowledge of lipophilic fractions of H. austrobrasiliense and H. caprifoliatum. The aerial parts collected at flowering time were dried, ground and extracted with n-hexane. For cell proliferation assays, keratinocyte cells (HaCaT) were used, grown in vitro. The n-hexane extract of Hypericum species were characterized by HPLC, showing predominant presence of phloroglucinols. Among the tested samples, the fractions of H. carinatum and H. polyanthemum were the most promising, promoving a proliferation 20 to 40% higher than that obtained with the control, indicating the induction of cell growth. The chromatographic process carried out the n-hexane extracts of H. austrobrasiliense led to the isolation of austrobrasilol A, austrobrasilol B and isoaustrobrasilol B, new phloroglucinol derivatives, and to the n-hexane extract of H. caprifoliatum were obtained hyperbrasilol B and isohyperbrasilol B. The new phloroglucinol derivatives were tested in hot plate and rotarod tests, proving to be effective, causing a reduction in pain perception at the same levels provided by dimeric phloroglucinol uliginosin B and did not cause motor impairment. The results emphasize the importance of this kind of plants as potential sources of biologically active compounds; in this case inducing the proliferation of keratinocyte cells and reducing the nociception, and may eventually serve as prototypes of new wound healing and analgesic agents.

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2003. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains vi, 147 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 128-139).

OBJETIVO: Desenvolver e validar a técnica de CLAE-DE para o doseamento de dopamina (DA), ácido diidrofenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 3-metoxitiramina (3-MT); validar a técnica de microdiálise (MD) cerebral em animais conscientes e avaliar o efeito do tratamento agudo com um extrato lipofílico das partes aéreas de Hypericum caprifoliatum (HCP) sobre os níveis cerebrais de DA e seus metabólitos. MATERIAIS E MÉTODOS: A validação analítica foi realizada conforme o preconizado pela ANVISA, com análise dos parâmetros linearidade, precisão, exatidão, especificidade e limite inferior de quantificação. A técnica de microdiálise foi realizada de forma clássica: guias de sonda foram implantadas nas regiões cerebrais de interesse por cirurgia estereotáxica; os dialisados foram obtidos, 48 horas após a cirurgia, através da perfusão da sonda com líquido cérebroespinhal artificial (1 μL/min) e coleta durante três horas, em intervalos de 20 min; as três primeiras coletas foram utilizadas para determinação da linha de base e só então foram administrados os tratamentos. Para a validação da MD a sonda foi implantada no estriado (A: -0,3; L: + 3,2; P: - 4,5) e o tratamento foi sulfato de anfetamina (2 mg/kg, s.c.). Para a avaliação do efeito de HCP, a sonda foi implantada no núcleo acumbens (A: +2,2; L: -1,5; P: -5,8) e o tratamento foi uma dose de 270 mg/kg do extrato (v.o.). RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os parâmetros avaliados para validar o método analítico ficaram dentro dos limites especificados pela ANVISA. O sulfato de anfetamina produziu um aumento nos níveis extracelulares de DA em 160% e uma redução de DOPAC e de HVA em 80% e 50%, respectivamente. O extrato HCP não alterou o conteúdo intersticial de DA, DOPAC e HVA no núcleo acumbens. Os valores basais encontrados estão de acordo com dados relatados na literatura. Não foi possível quantificar 3-MT. CONCLUSÃO: A metodologia analítica e as condições experimentais de microdiálise utilizadas permitiram a mensuração de mudanças induzidas por anfetamina nos níveis extracelulares de DA e seus principais metabólitos demonstrando que os fundamentos da técnica estão estabelecidos em nossas condições. O regime de tratamento empregado com HCP não foi suficiente para alterar os níveis de DA e seus principais metabólitos no núcleo acumbens de ratos. / OBJECTIVE: The objectives of this work were to validate the HLPC-ED technique for measuring dopamine (DA), dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanillic acid (HVA) and 3- methoxytyramine (3-MT); to put into operation the brain microdialysis technique (MD) in freely moving rats; to evaluate, by using MD, the effect of a single treatment with lipophilic extract from aerial parts of Hypericum caprifoliatum (HCP) on DA, DOPAC, HVA and 3-MT brain levels. MATERIALS AND METHODS: In order to validate the analytical technique we followed the parameters established by ANVISA for bioanalytical samples. The parameters were: precision, accuracy, specificity and also the lower limit of quantitation. The microdialysis technique was carried out following classical procedures: male Wistar rats were submitted to stereotaxic surgery for the guide cannula implantation in the brain regions of interest; 48 hours later, the microdiaysis probe was inserted and perfused with cerebrospinal fluid (1 μL/min). After baseline samples collecting (1 h), the treatments were administrated and samples were collected every 20 min, during 2h. To accomplish MD technique validation the animals were treated with amphetamine sulfate (2 mg/kg, s.c.) and the extracellular levels of DA, DOPAC e HVA were measured in striatum (A: -0,3; L: + 3,2; P: - 4,5). The effect of HCP acute treatment (270 mg/kg, p.o.) was evaluated in nucleus accumbens (A: +2,2; L: -1,5; P: -5,8). RESULTS AND DISCUSSION: The analytical parameters values found were within the acceptable ranges for bio-analytical limits specified by ANVISA. As expected, amphetamine sulfate administration significantly increased DA (160%) extracellular levels and decreased DOPAC (80%) and HVA (50%) levels. The quantification of 3-MT was not possible. Acute HCP administration did not affected DA, DOPAC and HVA levels in the nucleus accumbens. CONCLUSION: The HPLC-ED methodology and microdialysis procedures employed allowed the detection of amphetamineinduced changes in extracellular levels of DA and its metabolites demonstrating that the technical starting point was acceptable. The acute administration of 270 mg/kg, p.o. of HCP to rats was not sufficient to modify the extracellular levels of DA, DOPAC and HVA in the nucleus accumbens.

Aproximadamente vinte espécies do gênero Hypericum (Guttiferae) têm ocorrência natural no Brasil, e concentram-se principalmente na região Sul do País. Considerando a importância deste gênero como fonte de substâncias com variadas atividades biológicas, tais como analgésica, antidepressiva, antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa, entre outras, o presente trabalho teve como objetivos analisar a constituição química e o potencial antioxidante de espécies de Hypericum, desenvolver protocolos para manutenção de algumas espécies nativas através de culturas de tecidos e células e validar metodologia para quantificação de benzopiranos em H. polyanthemum proveniente de cultivo a campo, in vitro e aclimatizado. Utilizando-se métodos cromatográficos e espectroscópicos, foram isolados e identificados o ácido fenólico ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico e os flavonóides 3,7-dimetil-quercetina, 3-Ometil- quercetina, I3,II8-biapigenina, guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo, todos derivados da quercetina e obtidos da fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum. Ainda desta espécie, porém da fração n-hexano das raízes, obteve-se o derivado de floroglucinol uliginosina B. De H. myrianthum foram isolados e identificados os flavonóides quercetina e hiperosídeo, da fração metanólica das partes aéres, bem como os derivados de floroglucinol japonicina A e uliginosina B, fração n-hexano das raízes. Através do método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, foram quantificados os teores de fenólicos totais das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, verificando-se teores variando entre 37,40 a 228,36 mg EQ/g de extrato seco. Utilizando as técnicas de TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGV (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e reação bioautográfica e espectrofotométrica com radicais DPPH• (2,2 difenil-1-picril-hidrazil) evidenciou-se que extratos brutos metanólicos, e frações metanólicas e n-hexânicas das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum H. myrianthum e H. polyanthemum, bem como produtos isolados de espécies de Hypericum nativas do Estado apresentam potencial antioxidante. A regeneração in vitro foi obtida em meio Murashige & Skoog modificado (MΔ) para as espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 6-benzilamino-purina (BAP), ácido naftaleno-acético (ANA) e ácido 2,4 dicloro-fenóxi-acético (2,4-D). Plântulas dessas espécies foram posteriormente aclimatizadas com sucesso, sendo cultivadas a campo. As espécies micropropagadas demonstraram perfis químicos qualitativamente similares aos apresentados pelas plantas desenvolvidas no campo, de modo que o cultivo in vitro apresenta-se como uma alternativa interessante aos métodos convencionais de produção de biomassa para extração de metabólitos secundários bioativos. Culturas de calos foram estabelecidas em meio MΔ para H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum, utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento cinetina (CIN), BAP, ANA e 2,4-D. Considerando-se as importantes atividades biológicas de produtos obtidos de H. polyanthemum foi estabelecida uma metodologia para quantificação, através da técnica de CLAE, de benzopiranos no extrato apolar desta planta, espécie de ocorrência restrita. A validação analítica foi avaliada conforme o preconizado por normas reconhecidas internacionalmente, com análise dos parâmetros linearidade, seletividade, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e limites de detecção e quantificação, demonstrando resultados coerentes com os exigidos pela legislação vigente. Foram evidenciadas variações no teor de benzopiranos na planta micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo, provavelmente devido a fatores, que vão desde a regulação endógena de processos fisiológicos até variações sazonais no cultivo. / Approximately twenty species of Hypericum genus (Guttiferae) are native of Brazil, occurring mainly in the South region. Considering the importance of the genus as a source of compounds with different biological activities, such as analgesic, antidepressant, antimicrobial, antiviral, antiproliferative, among others, the objectives of this work were to evaluate the phytochemistry and antioxidant potential of some Hypericum species, to develop protocols for the maintenance of the species through in vitro cultures and to validate a technique to quantify the benzopyrans in H. polyanthemum grown in field, in vitro and acclimatized plants. Chromatographic and spectroscopic techniques were used for the isolation and identification of the phenolic acid 5-O-caffeoyl-1-methyl ester-quinic acid and the flavonoids quercetin 3,7-dimethyl ether, quercetin 3-methyl ether, I3,II8-biapigenin, guaijaverin, isoquercitrin and hyperoside, all of them quercetin derivatives and obtained from ethyl acetate fraction of H. ternum aerial parts. From n-hexane fraction of the roots of this species the phloroglucinol derivative uliginosin B was obtained. The flavonoids quercetin and hyperoside (from aerial parts of methanolic fraction), and the phloroglucinol derivatives japonicin A and uliginosin B (from n-hexane fraction of roots) were isolated from H. myrianthum. Total phenol concentration ranging from 37.40 to 228.36 mg QE/g dry extract (Folin–Ciocalteu colorimetric method) in H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum was measured. The antioxidant potential of the extracts obtained from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum and isolated compounds was determined using TRAP (Total Radicaltrapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGR (Oxygen Radical Absorbance Capacity) and bioautographic and spectrofotometric reaction with DPPH• (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical techniques. In vitro regeneration of H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum was obtained in Murashige & Skoog modified medium (MΔ) supplemented with differents combinations and concentrations of the growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP), α-naphthalene acetic acid (ANA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Plantlets were acclimatizated and transferred to open field. The micropropagated species showed chemical pattern qualitatively similar to field grown plants, demonstrating that the in vitro cultures are an alternative to conventional methods for biomass production of bioactive secondary metabolites. Callus cultures of H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum were established in MΔ medium using different combinations and concentrations of kinetin (CIN), BAP, ANA and 2,4-D. Considering the important biological activities of the benzopyrans isolated from H. polyanthemum, an HPLC quantification methodology was established. Analytical validation was performed according to international rules (linearity, selectivity, precision, accuracy, detection and quantitation limits) showing results coherent with those required by the current legislation. Variation of the benzopyrans concentration was observed among the micropropagated plantlet, acclimatizated and field grown plants, probably due to factors as endogenous regulation of physiological process and seasonal variation of the culture.

Plantas do gênero Hypericum (Hypericaceae) são reconhecidas fontes de moléculas com fins terapêuticos. Para espécies nativas do sul do Brasil, atividades como antifúngica e antinociceptiva já foram relatadas, atribuídas principalmente a compostos extraídos em suas frações lipofílicas como derivados de floroglucinol, benzopiranos e benzofenonas. Neste estudo, o potencial sinérgico entre frações lipofílicas de H. carinatum e o fármaco fluconazol, frente a fungos leveduriformes emergentes, foi avaliado por duas metodologias distintas: checkerboard e isobolograma. Para isolados de Candida krusei e C. famata o efeito da associação foi superior ao do fármaco isolado. Dessa forma, o perfil de suscetibilidade observado sugere que a fração esteja auxiliando a ação do fármaco. Ainda abordando o potencial terapêutico de espécies de Hypericum, a investigação da atividade antinociceptiva (via oral) do benzopirano HP1 de H. polyanthemum, quando incorporado em nanoemulsões, foi avaliada. Os resultados demonstraram que HP1 pode ser adequadamente incorporado em nanoemulsões, dada sua solubilidade no núcleo oleoso. Em relação ao efeito antinociceptivo, nanoemulsões contendo HP1 demonstraram o mesmo efeito do composto livre, em magnitude, porém em dose inferior. A redução da dose ativa sugere que uma melhor solubilização do composto possa ter ocorrido quando o mesmo está inserido em nanoemulsões. Nesse contexto, estudos de permeabilidade intestinal ex vivo (Ussing chambers) de HP1, na sua forma livre e incorporado em nanoemulsões, foram realizados. Os resultados demonstraram que a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, quando incorporado em nanoemulsões, foi cerca de 4 vezes maior em relação a forma livre. Além disso, experimentos de lipólise in vitro mostraram que enzimas presentes no trato gastrointestinal são hábeis em hidrolisar nanoemulsões a espécies coloidais, mais solúveis e facilmente absorvíveis pelas células intestinais. Ainda, a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, na sua forma livre, no sentido absortivo foi maior que no sentido secretório indicando que transportadores ativos estão, ao menos em parte, auxiliando a absorção deste composto pelas células intestinais. Dessa forma, com vistas a elucidar o provável transportador ativo de HP1, dada a semelhança estrutural deste benzopirano com moléculas canabinoides e a relação existente entre os sistemas opioide e canabinoide, a influência deste último na absorção de HP1 foi investigada. Os resultados demonstraram que o benzopirano HP1 pode estar relacionado ao sistema canabinoide, mas a natureza dessa ligação, seja de transporte, agonismo/antagonismo ou físico-química, não foi possível de ser elucidada. Os resultados obtidos nesta tese são relevantes à medida que espécies de fungos leveduriformes emergentes se mostram cada vez mais resistentes aos fármacos comumente utilizados. Além disso, a importância destes resultados se dá pela viabilidade de incorporação do benzopirano HP1 em nanoemulsões e a capacidade desses sistemas em reduzir a dose ativa no benzopirano HP1 por uma maior solubilização do composto e assim, melhor absorção. Dessa maneira, os resultados deste trabalho representam o alto potencial biológico de espécies de Hypericum e abrem possibilidade para mais estudos utilizando estas plantas. / Plants from genus Hypericum (Hypericaceae) are recognized as a source of therapeutical agents. To south Brazil species, acitivities like antifungal and antinociceptive had already been demonstrated, attributed mainly to compounds from lipophilic fractions as phloroglucinol derivatives, benzophenones and benzopyrans. In this study, antifungal potential of lipophilic fractions of H. carinatum and fluconazole against emerging yeasts was evaluated by two methodologies for multiple dose-response analyzes: checkerboard and isobologram. To Candida krusei and C. famata isolates the effect of association was higher than the effect of fluconazole alone. Thus, the susceptibility profile observed for these species suggests that, somehow, the fractions are facilitating the action of drug. Still on therapeutical potential of Hypericum species, the antinociceptive study of a benzopyran (HP1) isolated from H. polyanthemum, incorporate in nanoemulsions, was evaluated. The results demonstrated that HP1 could be incorporated in a nanoemulsion system, given the high solubility in the oil core. Regarding the antinociceptive effect, HP1 loaded in nanoemulsions showed the same effect of free form, in magnitude, at lower doses. These results suggest a better solubilization of HP1 when loaded in nanoemulsions, and, thus, better absorption by organism. In this context, ex vivo intestinal permeability studies (Ussing chambers) of HP1 free form and loaded in nanoemulsions were performed. The results showed that the intestinal permeability of HP1 loaded in nanoemulsions were about 4 times higher than HP1 free form. Besides, the intestinal permeability of HP1 free form in absorptive direction was higher than secretory direction indicating that active transporters are, at least in part, involved in HP1 intestinal absorption. Thus, in order to elucidate the probable active transporter of HP1 and since its structure looks like a cannabinoid molecule and there is a relation between the opioid and cannabinoid pathways, the influence of intestinal cannabinoid system in HP1 absorption was investigated. The results indicated that the benzopyran HP1 may be related to cannabinoid system, but the nature of this interaction: transport, agonism/antagonism or physico-chemical is still unknown. The outcomes obtained are relevant since the resistance of emerging yeast species to available drugs, used for a variety of fungal infections, is increasing. The importance of these findings lies also in the feasibility of incorporating HP1 into nanoemulsions, and the capacity of these systems in reduce the antinociceptive active doses, by higher solubilization, and thus, absorption. Then, together the results represent the high biological potential of Hypericum species and open new possibilities to further studies with these plants.

Produtos naturais são uma importante fonte de fármacos e muitos vegetais têm sido explorados na busca de substâncias potencialmente ativas. Dentre estas, destacam-se as espécies do gênero Hypericum, principalmente H. perforatum, utilizado há séculos com diversos fins terapêuticos, principalmente no tratamento de feridas. Mais recentemente, a planta está em evidência devido à comprovada atividade antidepressiva, sendo extensamente utilizada em várias partes do mundo no tratamento de depressões leve a moderada. Ambas as atividades citadas se devem a presença de derivados do floroglucinol. As espécies de Hypericum encontradas no sul do Brasil são fonte de floroglucinóis com diversas atividades biológicas descritas. Um dos objetivos deste estudo foi investigar a atividade proliferativa de frações enriquecidas em floroglucinóis de H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, visando indicar possível atividade cicatrizante. Outro objetivo foi ampliar o conhecimento fitoquímico acerca das frações lipofílicas de H. austrobrasiliense e H. caprifoliatum. As partes aéreas, coletadas na época de floração, foram secas, moídas e extraídas com n-hexano. Para os ensaios de proliferação celular foi utilizada uma linhagem de queratinócitos (HaCaT) cultivada in vitro. Os extratos n-hexano das espécies de Hypericum foram caracterizados por CLAE, mostrando a presença majoritária de floroglucinóis. Entre as amostras testadas, as frações de H. carinatum e H. polyanthemum foram as mais promissoras, promovendo uma proliferação 20 a 40% superior àquela obtida com o controle, indicando uma indução no processo de crescimento celular. Os processos cromatográficos realizados com os extratos n-hexano de H. austrobrasiliense levaram ao isolamento de austrobrasilol A, austrobrasilol B e isoaustrobrasilol B, derivados de floroglucinol com estruturas inéditas, do extrato n-hexano de H. caprifoliatum foram obtidos hiperbrasilol B e iso-hiperbrasilol B. Os novos derivados de floroglucinol foram submetidos ao teste da placa aquecida e rotarod, onde demonstraram serem efetivos, provocando uma redução na percepção da dor nos mesmos níveis apresentados pelo floroglucinol dimérico uliginosina B, e não provocaram prejuízo motor. Os resultados obtidos reforçam a importância de vegetais deste gênero como fontes potenciais de compostos biologicamente ativos; neste caso, induzindo a proliferação de células envolvidas na cicatrização e reduzindo a nocicepção, podendo futuramente servir como protótipos de novos agentes cicatrizantes e analgésicos. / Natural products are an important source of vegetable drugs and have been explored in the search for potentially active substances. Among these, there are the species of the genus Hypericum, especially H. perforatum, used for centuries for various therapeutic purposes, highlighting the use in the treatment of wounds. More recently, the plant has received high attention due to the antidepressant activity and is widely used all over the world to treat mild to moderate depression. Both activities could be attributed to the presence of phloroglucinol derivatives. The species of Hypericum native to southern Brazil are a source of phloroglucinols with diverse biological activities. One goal of this study was to investigate the proliferative activity of phloroglucinol enriched fractions of H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum and H. polyanthemum, aiming to indicate possible wound healing activity. Another objective was to expand the phytochemical knowledge of lipophilic fractions of H. austrobrasiliense and H. caprifoliatum. The aerial parts collected at flowering time were dried, ground and extracted with n-hexane. For cell proliferation assays, keratinocyte cells (HaCaT) were used, grown in vitro. The n-hexane extract of Hypericum species were characterized by HPLC, showing predominant presence of phloroglucinols. Among the tested samples, the fractions of H. carinatum and H. polyanthemum were the most promising, promoving a proliferation 20 to 40% higher than that obtained with the control, indicating the induction of cell growth. The chromatographic process carried out the n-hexane extracts of H. austrobrasiliense led to the isolation of austrobrasilol A, austrobrasilol B and isoaustrobrasilol B, new phloroglucinol derivatives, and to the n-hexane extract of H. caprifoliatum were obtained hyperbrasilol B and isohyperbrasilol B. The new phloroglucinol derivatives were tested in hot plate and rotarod tests, proving to be effective, causing a reduction in pain perception at the same levels provided by dimeric phloroglucinol uliginosin B and did not cause motor impairment. The results emphasize the importance of this kind of plants as potential sources of biologically active compounds; in this case inducing the proliferation of keratinocyte cells and reducing the nociception, and may eventually serve as prototypes of new wound healing and analgesic agents.

Aproximadamente vinte espécies do gênero Hypericum (Guttiferae) têm ocorrência natural no Brasil, e concentram-se principalmente na região Sul do País. Considerando a importância deste gênero como fonte de substâncias com variadas atividades biológicas, tais como analgésica, antidepressiva, antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa, entre outras, o presente trabalho teve como objetivos analisar a constituição química e o potencial antioxidante de espécies de Hypericum, desenvolver protocolos para manutenção de algumas espécies nativas através de culturas de tecidos e células e validar metodologia para quantificação de benzopiranos em H. polyanthemum proveniente de cultivo a campo, in vitro e aclimatizado. Utilizando-se métodos cromatográficos e espectroscópicos, foram isolados e identificados o ácido fenólico ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico e os flavonóides 3,7-dimetil-quercetina, 3-Ometil- quercetina, I3,II8-biapigenina, guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo, todos derivados da quercetina e obtidos da fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum. Ainda desta espécie, porém da fração n-hexano das raízes, obteve-se o derivado de floroglucinol uliginosina B. De H. myrianthum foram isolados e identificados os flavonóides quercetina e hiperosídeo, da fração metanólica das partes aéres, bem como os derivados de floroglucinol japonicina A e uliginosina B, fração n-hexano das raízes. Através do método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, foram quantificados os teores de fenólicos totais das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, verificando-se teores variando entre 37,40 a 228,36 mg EQ/g de extrato seco. Utilizando as técnicas de TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGV (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e reação bioautográfica e espectrofotométrica com radicais DPPH• (2,2 difenil-1-picril-hidrazil) evidenciou-se que extratos brutos metanólicos, e frações metanólicas e n-hexânicas das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum H. myrianthum e H. polyanthemum, bem como produtos isolados de espécies de Hypericum nativas do Estado apresentam potencial antioxidante. A regeneração in vitro foi obtida em meio Murashige & Skoog modificado (MΔ) para as espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 6-benzilamino-purina (BAP), ácido naftaleno-acético (ANA) e ácido 2,4 dicloro-fenóxi-acético (2,4-D). Plântulas dessas espécies foram posteriormente aclimatizadas com sucesso, sendo cultivadas a campo. As espécies micropropagadas demonstraram perfis químicos qualitativamente similares aos apresentados pelas plantas desenvolvidas no campo, de modo que o cultivo in vitro apresenta-se como uma alternativa interessante aos métodos convencionais de produção de biomassa para extração de metabólitos secundários bioativos. Culturas de calos foram estabelecidas em meio MΔ para H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum, utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento cinetina (CIN), BAP, ANA e 2,4-D. Considerando-se as importantes atividades biológicas de produtos obtidos de H. polyanthemum foi estabelecida uma metodologia para quantificação, através da técnica de CLAE, de benzopiranos no extrato apolar desta planta, espécie de ocorrência restrita. A validação analítica foi avaliada conforme o preconizado por normas reconhecidas internacionalmente, com análise dos parâmetros linearidade, seletividade, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e limites de detecção e quantificação, demonstrando resultados coerentes com os exigidos pela legislação vigente. Foram evidenciadas variações no teor de benzopiranos na planta micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo, provavelmente devido a fatores, que vão desde a regulação endógena de processos fisiológicos até variações sazonais no cultivo. / Approximately twenty species of Hypericum genus (Guttiferae) are native of Brazil, occurring mainly in the South region. Considering the importance of the genus as a source of compounds with different biological activities, such as analgesic, antidepressant, antimicrobial, antiviral, antiproliferative, among others, the objectives of this work were to evaluate the phytochemistry and antioxidant potential of some Hypericum species, to develop protocols for the maintenance of the species through in vitro cultures and to validate a technique to quantify the benzopyrans in H. polyanthemum grown in field, in vitro and acclimatized plants. Chromatographic and spectroscopic techniques were used for the isolation and identification of the phenolic acid 5-O-caffeoyl-1-methyl ester-quinic acid and the flavonoids quercetin 3,7-dimethyl ether, quercetin 3-methyl ether, I3,II8-biapigenin, guaijaverin, isoquercitrin and hyperoside, all of them quercetin derivatives and obtained from ethyl acetate fraction of H. ternum aerial parts. From n-hexane fraction of the roots of this species the phloroglucinol derivative uliginosin B was obtained. The flavonoids quercetin and hyperoside (from aerial parts of methanolic fraction), and the phloroglucinol derivatives japonicin A and uliginosin B (from n-hexane fraction of roots) were isolated from H. myrianthum. Total phenol concentration ranging from 37.40 to 228.36 mg QE/g dry extract (Folin–Ciocalteu colorimetric method) in H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum was measured. The antioxidant potential of the extracts obtained from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum and isolated compounds was determined using TRAP (Total Radicaltrapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGR (Oxygen Radical Absorbance Capacity) and bioautographic and spectrofotometric reaction with DPPH• (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical techniques. In vitro regeneration of H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum was obtained in Murashige & Skoog modified medium (MΔ) supplemented with differents combinations and concentrations of the growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP), α-naphthalene acetic acid (ANA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Plantlets were acclimatizated and transferred to open field. The micropropagated species showed chemical pattern qualitatively similar to field grown plants, demonstrating that the in vitro cultures are an alternative to conventional methods for biomass production of bioactive secondary metabolites. Callus cultures of H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum were established in MΔ medium using different combinations and concentrations of kinetin (CIN), BAP, ANA and 2,4-D. Considering the important biological activities of the benzopyrans isolated from H. polyanthemum, an HPLC quantification methodology was established. Analytical validation was performed according to international rules (linearity, selectivity, precision, accuracy, detection and quantitation limits) showing results coherent with those required by the current legislation. Variation of the benzopyrans concentration was observed among the micropropagated plantlet, acclimatizated and field grown plants, probably due to factors as endogenous regulation of physiological process and seasonal variation of the culture.

OBJETIVO: Desenvolver e validar a técnica de CLAE-DE para o doseamento de dopamina (DA), ácido diidrofenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 3-metoxitiramina (3-MT); validar a técnica de microdiálise (MD) cerebral em animais conscientes e avaliar o efeito do tratamento agudo com um extrato lipofílico das partes aéreas de Hypericum caprifoliatum (HCP) sobre os níveis cerebrais de DA e seus metabólitos. MATERIAIS E MÉTODOS: A validação analítica foi realizada conforme o preconizado pela ANVISA, com análise dos parâmetros linearidade, precisão, exatidão, especificidade e limite inferior de quantificação. A técnica de microdiálise foi realizada de forma clássica: guias de sonda foram implantadas nas regiões cerebrais de interesse por cirurgia estereotáxica; os dialisados foram obtidos, 48 horas após a cirurgia, através da perfusão da sonda com líquido cérebroespinhal artificial (1 μL/min) e coleta durante três horas, em intervalos de 20 min; as três primeiras coletas foram utilizadas para determinação da linha de base e só então foram administrados os tratamentos. Para a validação da MD a sonda foi implantada no estriado (A: -0,3; L: + 3,2; P: - 4,5) e o tratamento foi sulfato de anfetamina (2 mg/kg, s.c.). Para a avaliação do efeito de HCP, a sonda foi implantada no núcleo acumbens (A: +2,2; L: -1,5; P: -5,8) e o tratamento foi uma dose de 270 mg/kg do extrato (v.o.). RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os parâmetros avaliados para validar o método analítico ficaram dentro dos limites especificados pela ANVISA. O sulfato de anfetamina produziu um aumento nos níveis extracelulares de DA em 160% e uma redução de DOPAC e de HVA em 80% e 50%, respectivamente. O extrato HCP não alterou o conteúdo intersticial de DA, DOPAC e HVA no núcleo acumbens. Os valores basais encontrados estão de acordo com dados relatados na literatura. Não foi possível quantificar 3-MT. CONCLUSÃO: A metodologia analítica e as condições experimentais de microdiálise utilizadas permitiram a mensuração de mudanças induzidas por anfetamina nos níveis extracelulares de DA e seus principais metabólitos demonstrando que os fundamentos da técnica estão estabelecidos em nossas condições. O regime de tratamento empregado com HCP não foi suficiente para alterar os níveis de DA e seus principais metabólitos no núcleo acumbens de ratos. / OBJECTIVE: The objectives of this work were to validate the HLPC-ED technique for measuring dopamine (DA), dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), homovanillic acid (HVA) and 3- methoxytyramine (3-MT); to put into operation the brain microdialysis technique (MD) in freely moving rats; to evaluate, by using MD, the effect of a single treatment with lipophilic extract from aerial parts of Hypericum caprifoliatum (HCP) on DA, DOPAC, HVA and 3-MT brain levels. MATERIALS AND METHODS: In order to validate the analytical technique we followed the parameters established by ANVISA for bioanalytical samples. The parameters were: precision, accuracy, specificity and also the lower limit of quantitation. The microdialysis technique was carried out following classical procedures: male Wistar rats were submitted to stereotaxic surgery for the guide cannula implantation in the brain regions of interest; 48 hours later, the microdiaysis probe was inserted and perfused with cerebrospinal fluid (1 μL/min). After baseline samples collecting (1 h), the treatments were administrated and samples were collected every 20 min, during 2h. To accomplish MD technique validation the animals were treated with amphetamine sulfate (2 mg/kg, s.c.) and the extracellular levels of DA, DOPAC e HVA were measured in striatum (A: -0,3; L: + 3,2; P: - 4,5). The effect of HCP acute treatment (270 mg/kg, p.o.) was evaluated in nucleus accumbens (A: +2,2; L: -1,5; P: -5,8). RESULTS AND DISCUSSION: The analytical parameters values found were within the acceptable ranges for bio-analytical limits specified by ANVISA. As expected, amphetamine sulfate administration significantly increased DA (160%) extracellular levels and decreased DOPAC (80%) and HVA (50%) levels. The quantification of 3-MT was not possible. Acute HCP administration did not affected DA, DOPAC and HVA levels in the nucleus accumbens. CONCLUSION: The HPLC-ED methodology and microdialysis procedures employed allowed the detection of amphetamineinduced changes in extracellular levels of DA and its metabolites demonstrating that the technical starting point was acceptable. The acute administration of 270 mg/kg, p.o. of HCP to rats was not sufficient to modify the extracellular levels of DA, DOPAC and HVA in the nucleus accumbens.