La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immunitaire touchant environ 1% de la population mondiale. Elle représente l'une des formes d'arthrite les plus sévères parmi plus de cent formes diagnostiquées à ce jour. Malheureusement, l'étiologie de cette maladie n'est pas encore connue et il n'existe aucun traitement curatif. Cette pathologie dégénérative est caractérisée par l'inflammation et l'hypertrophie de la membrane synoviale causant des dommages irréversibles à plusieurs articulations tels que la destruction du cartilage et l'érosion des os. Plusieurs molécules participent au développement de cette affection, notamment des facteurs de croissance, des métalloprotéinases ainsi que des cytokines. De celles-ci, le TNF[alpha] est l'une des plus importantes. En effet, il a été démontré que cette cytokine pro-inflammatoire puissante est essentielle dans la pathogenèse de la PR. Pour ce faire, le TNF[alpha] transmembranaire doit être clivé par la TACE pour générer sa forme soluble et active. Donc, la TACE, via son action protéolytique sur le TNF[alpha], est impliquée dans la progression de la PR. De plus, il a été démontré que cette protéase transmembranaire est induite au niveau des articulations arthritiques et que l'inhibition de cette enzyme diminue les symptômes chez les rats atteints d'arthrite. Ceci en fait donc une cible thérapeutique intéressante, d'où l'importance de comprendre sa régulation et son mode d'action. Afin d'étudier la régulation de la TACE en conditions inflammatoires, nous avons choisi deux agents importants dans le développement de la PR. On sait depuis longtemps que l'hypoxie, soit le manque d'oxygène, est une condition souvent présente au niveau des articulations arthritiques et que ces dernières sont caractérisées par des concentrations élevées de TNF[alpha]. Nous avons donc testé l'influence de ces deux stimuli sur la modulation de l'ARN messager de la TACE chez les deux principaux types cellulaires composant la membrane synoviale, soit les macrophages (synoviocytes de type A) et les synoviocytes de type B. Nous avons démontré, par RT-PCR, que l'hypoxie et le TNF[alpha] induisent l'accumulation de l'ARN messager de la TACE et que ces inductions sont dépendantes de la synthèse de l'ARN. De plus, nous avons établi que ces inductions au niveau de l'ARN messager corrèlent avec l'accumulation de la protéine TACE et l'augmentation de son activité protéolytique chez les synoviocytes de type B stimulés par le TNF[alpha] et en condition hypoxique. Nous avons ensuite cloné le promoteur de la TACE dans le vecteur d'expression pGL2 dans le but d'effectuer des essais luciférase afin d'étudier les mécanismes transcriptionnels régissant la régulation de la TACE. Nous avons démontré, grâce à cette technique, que l'hypoxie augmente l'activité du promoteur de la TACE via l'induction de la liaison du facteur de transcription HIF-1 à deux sites HRE contenus dans ce promoteur. D'un autre côté, même si l'induction régie par le TNF[alpha] requiert en partie la présence du HIF-1, elle est principalement dépendante du facteur de transcription NF-[kappa]B. Finalement, nous avons vérifié l'effet de l'anti-inflammatoire dexaméthasone, souvent utilisé pour traiter la PR, au niveau de la régulation de la TACE et nous avons découvert que ce glucocorticoïde a un effet inhibiteur sur l'activité du promoteur de la TACE. Ces résultats indiquent que l'hypoxie et le TNF[alpha], deux conditions présentes chez les articulations arthritiques, sont impliqués dans la régulation à la hausse de la TACE et, par conséquent, augmentent la disponibilité du TNF[alpha] soluble, une cytokine pro-inflammatoire importante dans l'amplification de la réponse inflammatoire.

Le cancer est une pathologie complexe causée par plusieurs facteurs génétiques et environnementaux. Aux États-Unis seulement, près de 1 400 000 cas de cancer seront diagnostiqués en 2006 et plus de 500 000 personnes en mourront. Encore aujourd'hui, plusieurs types de cancer sont incurables et la plupart des traitements existants ne sont malheureusement pas curatifs. Cette maladie est caractérisée par une croissance cellulaire incontrôlée ainsi qu'une dissémination des cellules anormales. La prolifération accrue des cellules cancéreuses mène à l'apparition de régions hypoxiques chez plusieurs tumeurs solides. Un grand nombre de molécules participent aux différents stades de la progression tumorale et permettent à la tumeur de s'adapter à son microenvironnement. Plusieurs de ces dernières sont synthétisées sous forme de pro-peptides nécessitant un clivage enzymatique ciblé afin d'acquérir leur activité. Il a été démontré que la furine, le prototype de la famille des convertases de proprotéines, joue un rôle important dans la progression tumorale. La furine est surexprimée chez plusieurs types de tumeurs et elle est nécessaire à l'activation de substrats protéiques dont les rôles dans la croissance tumorale ainsi que dans la formation des métastases sont répertoriés. Dernièrement, l'étude des différents promoteurs de la furine a révélé qu'elle pouvait être induite en hypoxie, et. ce, via le facteur de transcription HIF-1. Notre étude avait pour but d'étudier l'implication de la régulation hypoxique de la furine dans le développement du cancer. Nous avons démontré, par immunohistochimie, la présence de régions hypoxiques dans les xénogreffes formées à partir de fibrosarcomes humains ainsi qu'une surexpression de la furine dans ces régions. Afin d'inhiber cette induction dans les régions hypoxiques tumorales, nous avons construit des vecteurs plasmidiques contenant un inhibiteur de la furine, soit l'[alpha]1-AT-PDX, sous le contrôle d'un promoteur inductible en hypoxie. Ces vecteurs possèdent 3 ou 6 répétitions d'une séquence du gène de l'érythropoïétine contenant un site de reconnaissance pour le HIF-1. Nous avons démontré que ces vecteurs augmentent les niveaux de PDX chez les cellules HT1080 cultivées en hypoxie. De plus, nous avons établi que l'augmentation de PDX en hypoxie est principalement due à la présence de HIF-1 dans la cellule. Nous avons aussi observé une diminution de la maturation de la MT1-MMP ainsi que de l'IGF-IR[bêta], deux substrats de la furine. Dans le but de vérifier la possibilité qu'une inhibition de la furine induite en hypoxie puisse affecter la croissance tumorale, nous avons par la suite transfecté les cellules HT1080 afin d'obtenir une population de cellules exprimant de façon stable les plasmides 3HRE-PDX et 6HRE-PDX. Nous avons démontré que, suite à l'implantation de ces cellules chez des souris immunodéficientes, la croissance des tumeurs exprimant du PDX en hypoxie est diminuée de façon significative. Nous avons également démontré, par immunobuvardage de type Western, la présence de PDX à l'intérieur de ces tumeurs. De plus, des expériences d'immunohistochimie ont révélé que l'expression de PDX était principalement située dans les régions hypoxiques des tumeurs. La furine est une enzyme ubiquiste, impliquée dans le maintien physiologique des fonctions cellulaires. Nos résultats démontrent pour la première fois la faisabilité d'inhiber de façon ciblée la furine, soit dans les zones hypoxiques de tumeurs. Cette inhibition diminue la maturation de substrats impliqués dans la modification du microenvironnemt des tumeurs et par conséquent, diminue la progression tumorale.

Le thème central de ce travail a consisté en l’étude et la mise en évidence des interactions existant entre le métaboréflexe et le chémoréflexe lors de l’exercice. L’effort physique est associé à une augmentation de la ventilation, de la fréquence cardiaque ainsi que de la pression artérielle. Ces effets sont médiés au moins en partie par l’activation du métaboréflexe musculaire, et peuvent être amplifiés par le chémoréflexe ventilatoire. Le métaboréflexe et le chémoréflexe impliquent nécessairement une activation du système nerveux orthosympathique. La fonction du métaboréflexe est d’optimaliser le transport d’oxygène à destination des muscles participant à l’exercice, ce qui s’accompagne d’une vasoconstriction dans les autres territoires vasculaires. La fonction du chémoréflexe est de maintenir la capnie et d’apporter une correction ventilatoire à l’acidose métabolique et éventuellement à l’hypoxémie survenant au cours d’efforts effectués en résistance. Une sollicitation excessive du métaboréflexe et du chémoréflexe peut limiter l’aptitude à l’effort en amplifiant les sensations de dyspnée (augmentation des équivalents ventilatoires) et en limitant le transport d’oxygène (augmentation de la pression artérielle limitant le débit cardiaque). L’étude des adaptations cardiovasculaires et ventilatoires ainsi celles du système nerveux sympathique en réponse à un exercice réalisé en hypoxie peut se révéler intéressante à plusieurs niveaux. Une telle étude devrait permettre de mieux comprendre la limitation de l’aptitude à l’effort des sujets sains en altitude. En effet, depuis plusieurs décennies, l'entraînement en altitude est fréquemment utilisé par les athlètes d'endurance. Cette méthode de préparation physique, qui consiste à séjourner et s'entraîner plusieurs semaines à moyenne altitude (2000-2800m), vise à améliorer temporairement la performance aérobie lors du retour au niveau de la mer. Cette étude pourrait également présenter un intérêt pour les travailleurs en altitude mais également de manière générale à toutes les personnes effectuant des séjours en montagne. Les métaborécepteurs et les chémorécepteurs contribuent directement aux ajustements cardio-vasculaires et ventilatoires durant un exercice statique réalisé en situation d’hypoxie C’est pourquoi, dans une première étude, nous avons souhaité différencier précisément les actions respectives du métaboréflexe et du chémoréflexe lors d’un exercice en hypoxie chez une population de sujets jeunes et en bonne santé. Nous avons donc voulu vérifier l’hypothèse selon laquelle les métaborécepteurs joueraient un rôle important dans l’activation sympathique et l’élévation tensionnelle en réponse à un exercice isométrique en hypoxie. Nous avons montré que durant l’effort en hypoxie, les métaborécepteurs et les chémorécepteurs interviennent de manière différente dans les réponses sympathiques, cardiovasculaires et ventilatoires. L’activation du système nerveux sympathique en réponse à un exercice en hypoxie est principalement médiée par les métaborécepteurs. Ces derniers jouent également un rôle prépondérant dans l’élévation tensionnelle. L’élévation de la ventilation est médiée aussi bien par les métaborécepteurs que par les chémorécepteurs. Par contre, les métaborécepteurs jouent un rôle mineur dans l’élévation de la fréquence cardiaque lors d’un exercice isométrique en hypoxie. Lors d’une deuxième étude, nous nous sommes intéressés aux effets du vieillissement sur la contribution du métaboréflexe et du chémoréflexe, toujours durant un effort en hypoxie. L’âge réduit la sensibilité du métaboréflexe. Par contre, l’âge n’affecte pas le chémoréflexe. Les effets de l’âge sur l’interaction des deux réflexes sont méconnus. Nous avons donc testé l’hypothèse selon laquelle l’effort isométrique en hypoxie (maximum de stimulation métaboréflexe) chez le sujet âgé s’accompagne d’une moindre activation sympathique, d’une moindre montée de la pression artérielle, et d’une réponse ventilatoire identique par rapport à celle observée chez le sujet jeune. Nous avons observé une moindre activation sympathique en réponse à l’exercice aussi bien en normoxie qu’en hypoxie chez les sujets plus âgés, subsistant lors de l’arrêt local de la circulation, permettant d’isoler la contribution du métaboréflexe lors de l’exercice. Nous en avons conclu que malgré le fait que l’âge réduise la sensibilité des métaborécepteurs, ceux-ci restent des déterminants majeurs de l’activation orthosympathique lors d’un effort réalisé en hypoxie chez les sujets plus âgés. Dans une troisième étude, nous avons souhaité mettre en évidence les effets de l’hyperoxie sur la sensibilité du métaboréflexe. Au repos, l’hyperoxie est responsable d’une inhibition du chémoréflexe périphérique et d’une diminution de l’activité sympathique, de la tension artérielle et de la fréquence cardiaque. Tandis que, durant l’exercice, l’hyperoxie augmente les décharges des afférences musculaires des fibres chémosensitives du groupe IV et diminue la production de lactate. Nous avons donc voulu tester l’hypothèse selon laquelle l’hyperoxie prolongée accentue les réponses sympathiques et tensionnelles à l’exercice isométrique et ce, même en présence d’une production de lactate diminuée. Nous avons observés que l’hyperoxie amplifie les réponses sympathiques et tensionnelles durant l’exercice. Cette activation du système nerveux sympathique et cette augmentation de la tension artérielle, plus importantes sous hyperoxie, sont dues à une augmentation de la sensibilité des métaborécepteurs par l’hyperoxie. Cette sensibilisation des métaborécepteurs par l’hyperoxie, compense les effets sympathicolytiques et hypotenseurs engendrés par l’inhibition du chémoréflexe. Ceci survient en dépit d’une diminution de la production d’acide lactique durant l’exercice en hyperoxie. Il semble donc que le lactate ne soit pas le médiateur principal de l’activation des métaborécepteurs.

Das Glioblastom ist mit einem Anteil von 20% an allen hirneigenen Tumoren der häufigste und bösartigste primäre intrakranielle Tumor. Trotz multimodalem Therapiekonzept, das operative Resektion, Strahlen- und Chemotherapie verbindet, haben Patienten eine Prognose von im Mittel nur 14,6 Monaten. Sein aggressives Wachstum zieht eine Vaskularisierung nach sich, die jedoch nicht in ausreichendem Maße die Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes sicherstellen kann. Studien mit Messelektroden zeigten einen deutlich reduzierten Sauerstoffpartialdruck im Tumor im Vergleich zum umliegenden Hirngewebe. Dieses hypoxische Milieu löst genetische Alterationen und adaptive Veränderungen der Proteinexpression aus, die eine Selektion besonders aggressiver Tumorzellen bewirkt. Für eine bessere prognostische Einschätzung sowie als zukünftige therapeutische Ziele zur Erhöhung der Response auf Chemo- und Strahlentherapie ist es von großem Interesse, solche Faktoren als mögliche Hypoxiemarker aufzufinden. In dieser Arbeit wurden die Proteine HIF-1α, CAIX, VEGF, EPO und NDRG1 auf mRNA- und Proteinebene in den Glioblastomzelllinien GaMG, U251 und U373 auf eine Veränderung ihrer Expression unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Ausmaß (5% O2, 1% O2 und 0,1% O2) und Dauer (1 h, 6 h und 24 h) der Hypoxie wurde variiert. Anschließend wurde über 24 h und 48 h eine Reoxygenierung durchgeführt. Auch wurden Expressionsuntersuchungen an Gewebeproben von Normalhirnen, Astrozytomen WHO Grad II und Glioblastomen vorgenommen. Die Verwendbarkeit von GAPDH als Marker für diese Analysen wurde durch Experimente sichergestellt, die dessen mRNA und das Protein als nicht durch Hypoxie oder Malignisierung reguliert nachwiesen. Wir bestätigten die Rolle von HIF-1α als Mediator der hypoxischen Zellantwort. Während die mRNA konstant blieb, wurde das Protein unter hypoxischen Bedingungen hochreguliert. Dies zeigte auch, dass unser experimentelles Setting funktionierte. NDRG1, CA-IX sowie EPO wurden unter Hypoxie sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene hochreguliert und blieben unter Reooxygenierung stabil. In Glioblastomen waren diese Gene auf mRNA-Ebene bedeutend stärker exprimiert als in niedriggradigen Astrozytomen. HIF-1α, NDRG1, CA-IX sowie EPO können also in humanen Glioblastomzellen als Hypoxiemarker dienen und möglicherweise auch eine prognostische und therapeutische Bedeutung haben. / Glioblastomas, making up 20 % of all brain tumours, are the most common and most malignant primary intracranial tumours. Multimodal treatment with surgery, chemotherapy, and radiotherapy currently gives patients a median survival time of only 14.6 months. Glioblastomas’ aggressive growth induces vascularization that is, however, inadequate to ensure normoxic conditions in the tumour tissue. Oxygen electrode measurements have shown significantly reduced pO2 in tumour tissue compared to surrounding brain tissue. Resulting hypoxia-induced genetic alterations and adaptive changes in protein expression lead to increased selection of aggressive tumour cells. As putative hypoxia markers, regulating factors are of interest for more accurate prognosis and as therapeutic targets in order to increase response to chemotherapy and radiotherapy. This work examines the proteins HIF-1α, CA-IX, VEGF, EPO, and NDRG1 in glioblastoma cell lines GaMG, U251, and U373 for changes in mRNA and protein expression under hypoxic conditions. Under our protocol, varying levels of hypoxia (5 % O2, 1 % O2, 0.1 % O2) and exposure (1, 6, and 24 h) were used. Subsequently, cells were reoxygenated for 24 and 48 hours, respectively. Expression analysis was done on normal brain tissue, WHO grade II astrocytoma, and glioblastoma. GAPDH was used as a marker for these analyses, its expression invariance on the mRNA and protein levels with respect to hypoxia as well as malignancy having been experimentally verified. We have identified HIF-1α as a mediator of cell responses to hypoxia. With stable mRNA expression, protein expression levels were elevated under hypoxic conditions, confirming the validity of the experimental setup. Hypoxic NDRG1, CA-IX, and EPO levels were elevated (mRNA and protein) and remained stable under reoxygenation. Expression of mRNA was significantly higher in glioblastoma than in low-grade astrocytoma. We conclude that HIF-1α, NDRG1, CA-IX, and EPO may be used as hypoxia markers in human glioblastoma cells and may be relevant for prognosis and therapy.

Les métastases représentent l’étape ultime de la progression tumorale. Les traitements inhibiteurs de l’angiogenèse offrent de nouvelles perspectives thérapeutiques, notamment pour les stades invasifs, mais cependant ils n’apportent qu’une prolongation modeste de la survie des patients. La faible réponse de certains types de cancers aux traitements ciblant l’angiogenèse tumorale, comme le carcinome de la prostate chez l’homme ou du sein chez la femme, est due au développement de résistances tumorales d’une part, et à l’accélération du processus métastatique mise en évidence par certaines études précliniques et cliniques d’autre part. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier le rôle d’une protéine anti-angiogénique endogène, la thrombospondine 1 (TSP1), dans l’invasion et la dissémination métastatique dans le carcinome de la prostate et du sein. Notre laboratoire a montré que la densité microvasculaire est inversement corrélée à l’expression de la TSP1 dans les stades précoces de ces carcinomes. Cependant, cette corrélation est perdue aux stades avancés où l’expression de la TSP1 devient associée à un mauvais pronostic. Les travaux de ma thèse ont permis de montrer que la TSP1 stimule un ensemble de processus intervenant dans la progression tumorale, dont la migration et l’invasion cellulaires, l’extravasation et la dissémination métastatique. Nous avons aussi pu mettre en évidence que l’hypoxie induite par l’inhibition de l’angiogenèse est un activateur majeur de l’invasion et de la formation de métastases, que cette hypoxie soit produite par des molécules endogènes comme la TSP1 ou par des inhibiteurs pharmacologiques de ce processus. De plus, nous démontrons que la TSP1 est un facteur de mauvais pronostic puisque son expression est corrélée avec l’augmentation de l’invasion et de la rechute des patients atteints de cancers de la prostate androgéno-résistants. En conclusion, nos résultats suggèrent que l’expression de la TSP1 pourrait être un facteur prédictif de l’invasion et de l’occurrence de métastases, et que le ciblage de la TSP1 présente un fort potentiel thérapeutique pour bloquer à terme ces processus. / Prognosis is poor once tumors developed metastasis, and overall survival has been only modestly improved by the development of drugs inhibiting angiogenesis. The poor response of certain types of cancer to therapies that target tumor angiogenesis, including prostate and breast carcinomas, is due to the development of an evasion and to the acceleration of the metastatic process noted in some preclinical and clinical studies. The objective of this thesis was to study the role of an endogenous anti-angiogenic factor, thrombospondin 1 (TSP1), in the process of invasion and metastasis of prostate and breast carcinomas. Our laboratory has previously shown that microvessel density is inversely correlated with the expression of TSP1 in primary stages of breast and prostate carcinomas. However, this correlation is lost in advanced cancers, where TSP1 expression becomes associated with poor prognosis. We show that TSP1 stimulates a set of processes involved in tumor progression, including cell migration and invasion, extravasation and metastatic dissemination. We also demonstrate that hypoxia induced by an inhibition of angiogenesis resulting from the activity of endogenous or pharmacological molecules is a major activator of invasion and metastasis. In addition, we demonstrate that TSP1 is a poor prognostic factor since its expression is correlated with increased invasion and relapse in patients with androgen-resistant prostate cancer. In conclusion, our results suggest that the expression of TSP1 could be a predictor of invasion and metastasis occurrence, and that targeting TSP1 could be a great therapeutic potential to block these processes.

Atherosclerosis is the underlying cause of cardiovascular diseases and a major threat to human health worldwide. It involves not only accumulation of lipids in the vessel wall but a chronic inflammatory response mediated by highly specific cellular and molecular responses. Macrophages and dendritic cells (DCs) play an essential role in taking up modified lipids and presenting them to T and B lymphocytes, which promote the immune response. Enhanced activation, migration and accumulation of inflammatory cells at the local site leads to formation of atherosclerotic plaques. Atherosclerotic plaques become hypoxic due to reduced oxygen diffusion and high metabolic demand of accumulated cells. The various immune cells experience hypoxic conditions locally and inflammatory stimuli systemically, thus up-regulating Hypoxia-inducible factor 1α. Though the role of HIF1α in macrophages and lymphocytes has been elucidated, its role in DCs still remains controversial, especially with respect to atherosclerosis. In this project work, the role of HIF1α in DCs was investigated by using a cell specific knockout mouse model where HIF1α was deleted in CD11c+ cells. Aortic root sections from atherosclerotic mice showed presence of hypoxia and up-regulation of HIF1α which co-localized with CD11c+ cells. Atherosclerotic splenic DCs also displayed enhanced expression of HIF1α, proving non-hypoxic stimulation of HIF1α due to systemic inflammation. Conditional knockout (CKO) mice lacking HIF1α in CD11c+ cells, under baseline conditions did not show changes in immune responses suggesting effects of HIF1α only under inflammatory conditions. When these mice were crossed to the Ldlr-/- line and placed on 8 weeks of high fat diet, they developed enhanced plaques with higher T-cell infiltration as compared to the wild-type (WT) controls. The plaques were of a complex phenotype, defined by increased percent of smooth muscle cells (SMCs) and necrotic core area and reduced percent of macrophages and DCs. The mice also displayed enhanced T-cell activation and a Th1 bias in the periphery. The CKO DCs themselves exhibited increased expression of IL 12 and a higher capacity to proliferate and polarize naive T cells to the Th1 phenotype in vitro. The DCs also showed decreased expression of STAT3, in line with the inhibitory effects of STAT3 on DC activation seen in previous studies. When STAT3 was overexpressed in DCs in vitro, IL 12 was down-regulated, but its expression increased significantly on STAT3 inhibition using a mutant vector. In addition, when STAT3 was overexpressed in DCs in vivo using a Cre regulated lentiviral system, the mice showed decreased plaque formation compared to controls. Interestingly, the effects of STAT3 modulation were similar in WT and CKO mice, intending that STAT3 lies downstream of HIF1α. Finally, using a chromatin immunoprecipitation assay (ChIP), it was confirmed that HIF1α binds to hypoxia responsive elements (HREs) in the Stat3 gene promoter thus regulating its expression. When DCs lack HIF1α, STAT3 expression is not stimulated and hence IL 12 production by DCs is uninhibited. This excessive IL 12 can activate naive T cells and polarize them to the Th1 phenotype, thereby enhancing atherosclerotic plaque progression. This project thus concludes that HIF1α restrains DC activation via STAT3 generation and prevents excessive production of IL 12 that helps to keep inflammation and atherosclerosis under check. / Atherosklerose ist die zugrundeliegende Ursache kardiovaskulärer Erkrankungen und stellt weltweit eine bedeutende Gesundheitsgefahr dar. An der Erkrankung ist nicht nur eine Anreicherung von Lipiden in der Gefäßwand beteiligt, sondern auch eine chronische Entzündungsantwort, welche durch hochspezifische zelluläre sowie molekulare Reaktionen vermittelt wird. Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) sind essentiell an der Aufnahme von modifizierten Lipiden sowie deren Präsentation gegenüber T und B Lymphozyten beteiligt, die ihrerseits wiederum Immunantworten fördern. Eine lokal gesteigerte Aktivierung, Migration und Akkumulation inflammatorischer Zellen trägt letztlich zur Bildung atherosklerotischer Plaques bei. Atherosklerotische Plaques werden aufgrund reduzierter Sauerstoff Diffusion und hoher metabolischer Aktivität der akkumulierten Zellen hypoxisch. Die verschiedenen Immunzellen sind lokal hypoxischen Bedingungen sowie systemisch inflammatorischen Stimuli ausgesetzt, wodurch sie Hypoxie-induzierten Faktor 1a (HIF1α) hochregulieren. Obwohl die Bedeutung von HIF1α in Makrophagen und Lymphozyten weitgehend aufgeklärt ist, ist dessen Rolle in DCs immer noch umstritten, insbesondere in Bezug auf Atherosklerose. In diesem Projekt wurde die Rolle von HIF1α in DCs mittels eines zellspezifischen Knockout Mausmodells untersucht, in welchem HIF1α in CD11c+ DCs deletiert wurde. Schnitte der Aortenwurzel aus atherosklerotischen Mäusen zeigten das Bestehen von Hypoxie und die Hochregulation von HIF1α, welches mit CD11c+ Zellen kolokalisierte. DCs aus der Milz atherosklerotischer Tiere wiesen ebenfalls eine erhöhte Expression von HIF1α auf, was eine nicht hypoxische Stimulation von HIF1α aufgrund systemischer Inflammation beweist. Konditionelle Knockout (CKO) Mäuse zeigten im Ausgangszustand keine Veränderung der Immunantwort was einen Einfluss von HIF1α unter ausschließlich inflammatorischen Bedingungen nahelegt. Eine achtwöchige atherogene Diät dieser Mäuse im Ldlr-/- Hintergrund resultierte in der Entwicklung größerer Plaques mit gesteigerter T Zell Infiltration im Vergleich zu wildtypischen (WT) Kontrollen. Die Plaques wiesen einen komplexen Phänotyp auf, der sich durch einen erhöhten prozentualen Anteil glatter Muskelzellen, nekrotischer Fläche sowie einen verminderten prozentualen Anteil an Makrophagen auszeichnete. Die Mäuse zeigten ferner eine erhöhte T Zell Aktivierung und eine Tendenz zur Th1 Antwort in der Peripherie. In vitro zeigten die konditionellen knockout DCs eine gesteigerte IL-12 Expression und eine gesteigerte Fähigkeit die Proliferation naiver T Zellen zu induzieren beziehungsweise in Richtung Th1 zu polarisieren. Die DCs wiesen ferner eine verminderte STAT3 Expression auf. Dies stimmt mit den in früheren Studien beobachteten inhibitorischen Effekten von STAT3 auf die Aktivierung von DCs überein. Eine Überexpression von STAT3 in DCs in vitro führte zu einer Herunterregulation von IL-12. Bei Inhibition von STAT3 mittels eines mutierten Vektors steigerte sich die Expression jedoch signifikant. Ferner führte eine STAT3 Überexpression in DCs mittels eines Cre-regulierten lentiviralen Systems in vivo zu einer verminderten Plaqueformation in den Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Interessanterweise waren die Auswirkungen der STAT3 Modulation in WT und CKO Mäusen ähnlich, was vermuten lässt, dass STAT3 HIF1α nachgeschaltet ist. Mittels eines Chromatin Immunpräzipitiations-Assays wurde letztlich bestätigt, dass HIF1α an Hypoxie-responsive Elemente im Stat3 Genpromotor bindet und dadurch seine Expression reguliert. Wenn DCs HIF1α fehlt wird keine STAT3 Expression gefördert, was eine ungebremste IL-12 Produktion durch DCs zur Folge hat. Dieses überschüssige IL-12 Sekretion kann naive T Zellen aktivieren und in Richtung eines Th1 Phänotyps polarisieren, wodurch das Voranschreiten atherosklerotischer Plaques gefördert wird. Dieses Projekt kommt folglich zu dem Schluss, dass HIF1α die Aktivierung von DCs über STAT3-Bildung beschränkt und eine übermäßige Produktion von IL-12 verhindert, wodurch Inflammation und Atherosklerose im kontrolliert werden.

Hintergrund: Die Überexpression von Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) wird mit Tumorprogression und schlechter Prognose in Zusammenhang gebracht. Wir untersuchten, ob die pharmakologische Hemmung des Transkriptionsfaktors HIF-1 mittels Chetomin, einem Inhibitor der Interaktion von HIF-1 mit dem Koaktivator Protein p300, die Hypoxie-induzierte Strahlenresistenz menschlicher Fibrosarkomzellen vom Typ HT 1080 beeinflusst. Methoden: Die optimale Dosis von Chetomin wurde durch Versuchsreihen mit Hypoxie-sensiblem Promotor in mit destabilisiertem EGFP-Vektor transfizierten HT 1080 HRE-Zellen bestimmt. HT 1080 Zellen wurden mittels RT-PCR sowie Western Blot auf die Transkription der HIF-1-regulierten Gene Carboanhydrase IX (CA9) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) untersucht. Außerdem wurden sie zur Erstellung klonogener Assays unter normoxischen sowie hypoxischen (0,1% O2, 12 Stunden) Bedingungen in vitro mit 0, 2, 5 oder 10 Gy bestrahlt mit oder ohne Chetominbehandlung (150 nM, 12 Stunden, Vorbehandlung 4 Stunden). Ergebnisse: In der RT-PCR zeigte sich eine signifikante Reduktion (Signifikanzniveau p<0,05) der mRNS-Expression von CA9 und VEGF unter Chetomin und Hypoxie auf 44,4 +/- 7,2% beziehungsweise 39,6 +/- 16,0%, im Western Blot supprimierte Chetomin auch die Downstream-Genprodukte von CA9 und VEGF. In den Überlebenskurven erhöhte Chetomin die Wirksamkeit der Bestrahlung wesentlich, der modifizierte Sauerstoffeffekt (modified Oxygen Enhancement Ratio, OER') war mit Ausnahme der 50% SF in Bezug auf die Kontrollen bei 50%, 37% und 10% Relativem Überleben (SF) von 1,57 auf 1,58, von 1,56 auf 1,42 und von 1,38 auf 1,22 reduziert. Schlussfolgerung: Die HIF-1-Hemmung durch Chetomin reduziert effektiv die Hypoxie-abhängige Transkription und verstärkt die Strahlensensibilität von hypoxischen HT 1080 Fibrosarkomzellen in vitro. / Background: Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) overexpression has been linked to tumor progression and poor prognosis. We investigated whether targeting of HIF-1 using chetomin, a disrupter of the interaction of HIF-1 with the transcriptional coactivator p300, influences the radiosensitivity of hypoxic HT 1080 human fibrosarcoma cells. Methods: Optimal dose of chetomin was determined by EGFP-HRE gene reporter assay in stably transfected HT 1080 cells. Cells were assayed for expression of the hypoxia-inducible genes carbonic anhydrase IX (CA9) and vascular endothelial growth factor (VEGF) by RT-PCR and Western blot. For clonogenic survival they were irradiated with 0, 2, 5 or 10 Gy, under normoxic or hypoxic (0.1% O2, 12h) conditions in the presence or absence of chetomin (150 nM, 12h, pre-treatment of 4h). Results: Chetomin treatment significantly reduced CA9 and VEGF mRNA expression in hypoxic cells to 44.4 +/- 7.2% and 39.6 +/- 16.0% respectively, of untreated hypoxic controls. Chetomin suppressed as well downstream gene products of CA9 and VEGF (Western blot). Chetomin clearly radiosensitized hypoxic cells and reduced the modified oxygen enhancement ratio (OER') compared to untreated cells except at 50% survival fraction, from 1.57 to 1.58, from 1.56 to 1.42 and from 1.38 to 1.22 at the 50%, 37% and 10% clonogenic survival levels, respectively. Conclusions: HIF-1 inhibition by chetomin effectively reduces hypoxia-dependent transcription and radiosensitizes HT 1080 human fibrosarcoma cells in vitro.

La compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des métastases est l’un des défis majeurs de la recherche sur le cancer. En effet, la formation de métastases est la cause principale de mortalité chez les patients atteints du cancer. L'influence du microenvironnement tumoral fait partie intégrante de la recherche et plusieurs études démontrent qu’il joue un rôle primordial dans l’invasion des cellules tumorales. L’une des caractéristiques du microenvironnement tumoral est l’hypoxie. Les cellules cancéreuses ont développé différentes stratégies afin de survivre dans ce microenvironnement. Des études récentes rapportent que des mécanismes posttranscriptionnels sont induits par l’hypoxie tels que le routage intracellulaire de molécules d'adhésion, de protéases et l’activation de facteurs de croissance, et qu’ils influencent le phénotype métastatique des cellules cancéreuses. L’étape importante dans l’initiation de la formation des métastases est la dégradation de la membrane basale de la tumeur et de la matrice extracellulaire. Les cellules cancéreuses ont développé des stratégies afin de faciliter leur migration dont l’une est la formation d'invadopodes. Malgré plusieurs études sur la biogenèse et les fonctions de ces structures, peu de travaux ont été accomplis concernant l’influence du microenvironnement tumoral hypoxique sur la formation et les fonctions des invadopodes. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude des mécanismes induits par l’hypoxie dans l’invasion des cellules cancéreuses. Dans le premier chapitre de la section résultats, nous démontrons que l’hypoxie induit une relocalisation stratégique de la furine, une convertase de pro-protéines, dans une boucle de recyclage en périphérie cellulaire. Nous démontrons que la redistribution de la furine favorise l’invasion cellulaire en condition hypoxique. Dans le deuxième chapitre, nous avons étudié l'impact de la relocalisation de la furine en hypoxie sur la maturation de substrats tumorigéniques. Nos résultats indiquent que l’hypoxie favorise la maturation du TGFß par la furine dans des vésicules acides. Nous démontrons que la présence d’une histidine, sensible au pH, située au site de clivage du pro-TGFß par la furine influence la capacité de cette dernière à cliver la pro-protéine. Enfin, dans le dernier chapitre, nous démontrons que l’induction hypoxique de la formation des invadopodes est principalement causée par la signalisation dépendante de Smad3 du TGFß. Nous identifions la HDAC6 comme étant un régulateur de la signalisation du TGFß en hypoxie. La HDAC6 permettrait la libération de Smad3 du réseau de tubuline, et suite à la liaison du TGFß sécrété à son récepteur, permettrait la phosphorylation et la translocation nucléaire de Smad3 afin d'induire ses gènes cibles. L'ensemble de ces travaux a permis d'identifier des molécules clés impliquées dans la formation des invadopodes en condition hypoxique. Nos travaux ont contribué de manière substantielle à nos connaissances des mécanismes impliqués dans l’invasion cellulaire dans le microenvironnement hypoxique. Nos résultats permettront en outre l’identification de cibles thérapeutiques potentielles qui pourraient servir à inhiber l’invasion cellulaire et la formation de métastases.

Freie Universiẗat, Diss., 2006--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Zugl.: Giessen, Univ., Habil.-Schr., 2005