La maladie coronaire d'origine ischémique reste l'une des principales causes de mortalité dans le monde industrialisé. Le traitement de l'ischémie aiguë du myocarde est cependant entré dans une nouvelle ère où la mortalité peut être diminuée de moitié en utilisant des procédures qui permettent un retour rapide du débit sanguin dans la zone ischémique du myocarde, c'est-à-dire la revascularisation. Toutefois, cette reperfusion entraîne par elle-même des complications appelées lésions de la reperfusion qui ont été décrites pour la première fois par Jennings et al., en 1960. Par conséquent, le développement de stratégies cardioprotectrices associées à la reperfusion constitue un besoin majeur en clinique afin d'améliorer la fonction myocardique, de diminuer l'incidence des arythmies, de retarder l'apparition de la mort cardiomyocytaire et de limiter la taille de l'infarctus du myocarde lors de l'ischémie/reperfusion (I/R). La découverte de deux formes principales de mécanismes cardioprotecteurs endogènes, qui consistent en la réalisation de brefs cycles d'I/R appliqués avant l'ischémie (pré-conditionnement ischémique) ou après une longue période d'ischémie au début de la reperfusion (post-conditionnement ischémique), a encouragé la recherche de nouveaux moyens pharmacologiques capables de protéger le myocarde ischémié/reperfusé et a développé nos connaissances sur les bases moléculaires des lésions et de la survie cellulaire au cours des processus d'I/R.L'étude des mécanismes responsables de l'induction de la mort cellulaire a permis de mettre en évidence le rôle prépondérant joué par la mitochondrie et l'augmentation de la perméabilité de ses membranes, induite notamment par la formation/ouverture d'un pore au niveau des points de contacts entre les membranes mitochondriales ; ce pore a été appelé " pore de transition de la perméabilité mitochondriale " (mPTP). L'inhibition de l'ouverture de ce pore apparaît comme une stratégie privilégiée pour protéger le myocarde.De nombreuses études ont montré que les espèces réactives d'oxygène (EROs) jouent un rôle majeur dans les lésions de l'I/R et dans l'ouverture du mPTP. En revanche, il existe peu d'informations claires sur le seuil et la période de production (ischémie et/ou reperfusion) des EROs qui conduisent à l'ouverture du mPTP.Par conséquent, nous avons mis au point un modèle cellulaire d'hypoxie/réoxygénation (H/R) afin d'établir une relation causale entre la production d'EROs, l'ouverture du mPTP et la mort cellulaire tout en explorant le rôle de différents types d'EROs.Ce modèle d'H/R développé sur des cardiomyocytes de rats adultes fraîchement isolés nous a permis de mesurer en temps réel et simultanément la production des EROs, l'ouverture du mPTP et la mort cellulaire. Nous avons montré que la production des EROs débute pendant la période d'hypoxie et que cette production est directement liée à l'augmentation du temps d'hypoxie. Cette production d'EROs à l'hypoxie, plus particulièrement de radicaux hydroxyles et de peroxyde d'hydrogène, a été directement relié, et ceci pour la première fois, à l'ouverture du mPTP et à la mort cellulaire lors de l'H/R.Nous avons utilisé ce modèle pour étudier le mécanisme d'action de deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices, un nouveau ligand de la protéine translocatrice mitochondriale (TSPO), le TRO 40303, et l'activation de la voie RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) par la morphine. Nous avons ainsi montré que (1) les propriétés cardioprotectrices du TRO40303 sont associées à une inhibition de l'ouverture du mPTP, ce qui n'avait pas pu être démontré au moyen d'expériences réalisées ex vivo et (2) l'activation de la voie RISK par la morphine, qui aboutit à une limitation de la taille d'infarctus associée à une amélioration des fonctions respiratoires mitochondriales, entraîne également une inhibition de l'ouverture du mPTP et un retard de la mort cellulaire des cardiomyocytes isolés soumis à une H/R.La suite logique de ce travail sera de rechercher si l'inhibition du stress oxydant peut constituer un mécanisme commun aux deux stratégies pharmacologiques cardioprotectrices que nous avons décrites en utilisant notre modèle d'H/R. Pour cela, il serait possible d'étendre notre modèle à des animaux génétiquement modifiés pour appréhender plus précisément les phénomènes impliqués dans cette activité antioxydante.A plus long terme, il sera nécessaire d'approfondir nos connaissances sur la production d'EROs pendant l'I/R en recherchant plus spécifiquement l'origine de cette production, notamment le rôle joué par la mitochondrie et l'effet d'autres espèces réactives dans le but de cibler le traitement et de développer de nouvelles stratégies cardioprotectrices.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les substituts sanguins à base d’hémoglobine (HBOC) en cours de développement et d’évaluation, sont susceptibles, selon leur formulation et le protocole d’évaluation envisagé, d’induire des modifications du comportement des cellules endothéliales (CE). Nous avons développé des protocoles visant à évaluer le rôle de trois paramètres : les contraintes de cisaillement, l’hypoxie et la présence d’HBOC au contact des CE. Plusieurs facteurs, comme le stress oxydatif, la vasomotricité et l’inflammation ont été étudiés par qPCR, RPE, cytométrie en flux et dosage des métabolites. Dans un premier temps, nous avons observé l’action simultanée des contraintes de cisaillement et des HBOC (Hb-Dex-BTC, Oxyglobin®, aa-Hb) sur le comportement des CE. Nos résultats montrent combien le cisaillement influence la réponse des CE en présence d’HBOC. Pour se rapprocher de la situation clinique d’un usage potentiel d’HBOC, nous avons élaboré un protocole d’hypoxie/réoxygénation des CE par ces Hb. Au travers des deux protocoles d’hypoxie développés (brève et chronique), nous avons montré des mécanismes différents de réponse cellulaire : après 4 h, la réoxygénation avec les substituts induit une diminution de l’inflammation engendrée par l’hypoxie. Alors qu’après 24 h, nous constatons son induction quel que soit le substitut utilisé. D’une façon générale, la présence de dextran dans l’Hb-Dex-BTC rend celle-ci plus furtive vis-à-vis des mécanismes de détection de la présence d’Hb par les CE. Dans une dernière partie, nous avons effectué des tests de cytotoxicité sur des Hb de nouvelle génération (PEG-Hb et Hb octamérique produite par génie génétique) par mesure de la viabilité cellulaire et du taux d’apoptose-nécrose, Ces résultats encourageants confirment l’intérêt de poursuivre les évaluations. / Hemoglobin based oxygen carriers (HBOC), under development and evaluation, are potentially able to induce modifications of endothelial cells (EC) behaviour. We developed protocols to evaluate the role of three different parameters, like shear stress, hypoxia and HBOC presence on EC. Several factors, like oxidative stress, vasomotion and inflammation were studied using qPCR, EPR, flow cytometry and metabolites quantification. At first, we observed simultaneously the action of shear stress and HBOC (Dex-BTC Hb, Oxyglobin®, aa-Hb) on EC behaviour. Our results show how shear stress influences EC response face to HBOC. Then, we elaborated a hypoxia/reoxygenation protocol with HBOC. Using two different protocols of hypoxia (brief and chronic) we demonstrated that different mechanisms drive cell response. After 4 h of hypoxia, reoxygénation with blood substitutes induces a diminution of the inflammation engender by hypoxia. However, after 24 h of hypoxia, we observed an over inflammation whatever was the blood substitute used. In conclusion, among the three HBOC tested, we highlighted that the presence of dextran in Dex-BTC-Hb solutions makes Hb furtive for EC Hb detection mechanisms. Finally, we developed cytotoxicity tests on new Hb generation (PEG-Hb, octameric Hb) based on cellular viability and apoptosis-necrosis. These tests were encouraging for both Hb.

L’hypertension pulmonaire (PH) compliquant la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est associée à une augmentation du risque de décès. Le remodelage vasculaire pulmonaire en est la principale cause ; ce remodelage est le résultat de la combinaison des effets de l'hypoxie alvéolaire, d’une inflammation et de la perte du lit vasculaire pulmonaire. Sur le plan anatomique, on observe un épaississement de l’intima dû à une prolifération des cellules musculaires lisses (CML). Ces anomalies sont sous la dépendance du transporteur de la sérotonine (5-HTT). La quantité d’ARN messager du 5- HTT des CML humaines en culture est significativement plus élevée chez les sujets homozygotes pour la forme longue du promoteur de 5-HTT (LL), par rapport aux sujets hétérozygotes (LS) ou homozygotes pour la forme courte (SS), notamment en condition hypoxique. La pression artérielle pulmonaire (PAP) est significativement plus élevée chez les patients homozygotes LL (moy. 34 ± (ET)13 mm Hg), par rapport aux autres patients (22 ± 4 mm Hg et 23 ± 5 mm Hg ; p<0,001). Nous avons également observé que l’interleukine 6 (IL- 6) sérique est corrélée à la PAP (r=0,39 ; p< 0,001). De plus, un polymorphisme fonctionnel du gène codant pour l’IL-6 G(–174)C est associé dans sa forme homozygote GG à une HP plus fréquente (Odds Ratio ajusté= 4.32; [Intervalle de confiance à 95%, 1.96-9.54]) et une PAP significativement plus élevée. En conclusion, la prolifération des CML artérielles pulmonaires dans la BPCO est dépendante du 5-HTT et de l’inflammation. Cette prolifération est en partie induite par l’hypoxie alvéolaire entraînant un remodelage des petites artères et artérioles pulmonaires / The lung high blood pressure complicating (PH) the obstructive chronic bronchopneumopathie ( BPCO) is associated with an increase of the risk of death(deaths). The lung vascular reshaping is the main cause; this reshaping is the result(profit) of the combination(overall) of the effects of the alveolar hypoxie, the inflammation and the loss of the lung vascular bed

Les facteurs de croissance endothéliaux (VEGFs) sont produits par les tumeurs qui sont hypoxiques. Principaux responsables de la néo-vascularisation pathologique, ils régulent le stroma tumoral. Les nouvelles stratégies qui ciblent et inhibent le VEGF ouvrent vers la thérapie anti-cancéreuse moderne. Elles ont pour but de contrôler l’angiogenèse tumorale plutôt que la détruire. Le défi est donc de piéger sélectivement le VEGF produit en excès, dans le microenvironnement tumoral, sous l’effet de l’hypoxie. La thèse présentée dans ce manuscrit est consacrée à la réalisation d’une nouvelle stratégie ciblante par l’intermédiaire de cellules, aussi appelée « Cheval de Troie ». Elle combine dans la même entité, une unité de ciblage et un système de délivrance spécifique d’un gène/molécule thérapeutique. Dans le but d’adresser la thérapie aux cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines, un modèle de cellules endothéliales de type précurseur (CEPs) a été utilisé comme cellules ciblantes capables d’atteindre spécifiquement le site tumoral. Les CEPs ont été « armées » pour exprimer un gène thérapeutique chargé d’inhiber le VEGF. La neutralisation a été obtenue par la production d’une forme soluble du récepteur-2 du VEGF (VEGFR2 soluble), agissant comme inhibiteur. Caractéristique des tumeurs solides se développant, l’hypoxie a été choisie pour déclencher/éteindre l’expression et la sécrétion du VEGFR2 soluble, en introduisant, en amont du gène thérapeutique, une séquence régulatrice : HRE. Adressé au site tumoral par les CEPs, le régulateur de l’angiogenèse qu’est la forme soluble du VEGFR2, est exprimé de manière conditionnée et réversible, à l’hypoxie. Ceci ouvre à de nouvelles stratégies de normalisation contrôlée et stable des vaisseaux tumoraux en vue de l’utilisation de thérapies combinées. / Vascular endothelial growth factors (VEGFs) are over-expressed upon hypoxia in solid tumors. Major actors directing pathologic neo-vascularisation, they regulate the stromal reaction. Novel strategies that target and inhibit VEGF bring promise to modern anti-cancer therapies. They aim to control rather than destroy tumor angiogenesis. Consequently, the challenge is to selectively trap VEGFs, over-produced upon hypoxia, in the tumor microenvironment. The thesis presented in this manuscript focuses on the design of a novel cell-based targeting strategy, so-called “Trojan Horse”, combining in the same engineered entity, a targeting unit and a specific drug/gene delivery system. Aiming to address the therapy to cancer cells without affecting healthy cells, a model of endothelial precursor cell (EPCs) was used as targeting cell able to reach specifically the tumor site. EPCs were “armed” to express a therapeutic gene to inhibit VEGF. Trapping was attempted based on the production of a soluble form of the VEGF receptor-2 (sVEGFR2) as a candidate inhibitor. Hypoxia, a hallmark of developing solid tumors, was chosen to turn on/off the sVEGFR2 expression and secretion by introducing, upstream of the therapeutic gene, a hypoxia response element (HRE) regulating sequence. Properly addressed by the EPCs to the tumor site, such angiogenesis regulator as the soluble form of VEGFR2 is, was chosen to be expressed in a hypoxia-conditioned and reversible manner. This opens new strategies for a stably controlled normalization of tumor vessels in view of adjuvant design for combined therapies.

Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse vise à l'approfondissement des connaissances sur l'impact de l'environnement gestationnel sur le développement de la commande respiratoire chez le nouveau-né. La respiration est une activité rythmique et autonome. La maturation des réseaux neuronaux impliqués dans son contrôle commence au cours de la gestation et persiste pendant la période postnatale. Le contrôle respiratoire est donc particulièrement susceptible à des variations de l'environnement intra-utérin. Nous avons étudié l'effet de deux stress gestationnels chroniques distincts : l'exposition à des cannabinoïdes et l'exposition à une hypoxie prénatale. A l'aide de techniques intégrées telles que la pléthysmographie à corps entier, éléctrophysiologiques comme la préparation de tronc cérébrale isolé ou les tranches de bulbes et immunohisto- et neurochimiques, nous avons pu caractériser l'impact des stress prénataux étudiés sur la plasticité respiratoire développementale. Nous avons pu établir un rôle central de l'anandamide dans la modulation de la commande respiratoire, probablement via des mécanismes noradrénergiques. L'exposition prénatale au WIN 55,212-2 induit une hyperventilation basale chez la souris nouveau-née qui semble relever d'altérations périphériques. Elle induit également une accentuation de la réponse centrale à l'hypoxie aigue et affecte l'apparition d'irrégularités respiratoires telles que les apnées. Quant à l'hypoxie prénatale, elle induit une hyperventilation basale d'origine centrale ainsi qu'une augmentation de l'activité catécholaminergique du tronc cérébrale. / Breathing is an autonomic rhythmic activity. The maturation of the neuronal networks responsible for breathing control begins in early gestation and persists throughout the neonatal period. This renders breathing control particularly susceptible to early insults arising from the intra uterine environment. We have studied the effects of two such gestational stress factors, namely prenatal exposure to cannabinoids and to gestational hypoxia. We use a wide array of in vivo and in vitro techniques in order to characterise the effect of the adverse intra uterine environment on the development of respiratory control. These include integrated techniques such as whole body plethysmography, electrophysiological preparations (en bloc and brainstem slice recordings) as well as immunohisto- and neurochemical approaches. We show that the prenatal stress factors induce developmental respiratory plasticity. This translates as heightened basal ventilation, observed following prenatal exposure to both cannabinoids and hypoxia. Comparisons between in vivo and in vitro techniques reveal a peripheral origin for the alterations observed following prenatal exposure to cannabinoids, suggesting a perturbation of the initiation and/or integration of information from the peripheral carotid bodies. Following prenatal hypoxia, respiratory perturbations have a central origin and can thus be observed in reduced preparations such as brainstem slice recordings. Neurochemical and immunohistochemical assays also reveal alterations in the bioaminergic modulation of the respiratory rhythm generator, perhaps underpinning the observed effects on respiratory control.

Adaptation to chronic hypoxia increases myocardial resistance to acute ischemia/reperfusion (I/R) injury, similarly to application of exogenous erythropoietin (EPO). Nevertheless, it is not known if EPO induced by chronic hypoxia plays a role in its cardioprotective mechanism. The aim of this study was to find out if protective effect of exogenous EPO adds up to protection offered by chronic hypoxia. Adult male mice (ICR) were adapted to intermittent hypobaric hypoxia 8 hours per day, 5 days per week for 5 weeks. The degree of hypoxia corresponded to 7000 metres. Control animals were housed for the same time in normoxic environment. Resistance to I/R injury was assessed according to size of myocardial infarction induced by 45-min global ischemia and 1-h reperfusion of the heart in vitro. Animals were treated 24 h before the experiment with 200 or 5000 U/kg EPO. Treatment with 200 U/kg EPO was sufficient to significantly limit infarct size in normoxic animals (33,56 ± 2,93 % vs. 25,71 ± 2,29 %). Hypoxic adaptation decreased infarct area to 23,49 ± 2,30%, but additive effect of EPO in hypoxic group was not detected. The results indicate that exogenous EPO employs the same cardioprotective mechanisms as adaptation to chronic intermittent hypoxia. Preliminary results indicate that repeated application of EPO...

L'adénosine est un nucléoside ubiquitaire issu de la déphosphorylation de l'ATP qui est libéré par les cellules endothéliales et les myocytes lors de l'hypoxie, de l'ischémie ou du stress oxydatif. Elle exerce un contrôle puissant sur les systèmes nerveux, immunitaire et cardiovasculaire par l'intermédiaire de quatre récepteurs membranaires : A1R, A2AR, A2BR et A3R. La compréhension de l'implication du système adénosinergique dans le système cardiovasculaire implique la possibilité technique d'un dosage de l'adénosine endogène et la quantification de l'expression de ses récepteurs. L'adénosine ayant globalement une action hypotensive (via les récepteurs A2AR) et chronotrope négative (via les récepteurs A1R), nous nous sommes intéressés à son implication chez les patients présentant des syncopes neurocardiogéniques, la bradycardie et l'hypotension étant 2 signes cardinaux dans ce syndrome. Les manifestations cliniques de cette affection peuvent être reproduites par le test d'inclinaison (HUT) et/ou le test à l'ATP. Dans un premier temps nous avons réalisé des dosages d'adénosine plasmatiques chez ces patients au moment d'un test d'inclinaison. Les concentrations en adénosine étaient élevées chez les patients présentant un test positif. Par la suite, nous avons comparé les concentrations en adénosine plasmatiques et l'expression des récepteurs A2A en fonction du résultat du test d'inclinaison et du test à l'ATP. / Adenosine is a ubiquitous nucleoside that comes from the dephosphorylation of ATP and which is released during hypoxia or oxidative stress, by endothelial cells and myocytes. Adenosine interacts on its cell surface receptors, namely A1R, A2AR, A2BR and A3R, to exert physiological effects on target tissues. Our knowledge about the adenosinergic system was improved because of our ability to measure adenosine plasma levels and to quantify its receptors expression. Because adenosine, via A1 or A2A receptor activation leads to bradycardia and hypotension, we first tried to understand the implication of the adenosinergic system in patients with neurocardiogenic syncope (NMS for neutrally mediated syncope). Indeed, this syndrome is characterized by relative or absolute bradycardia associated with a drop in blood pressure and a loss of consciousness. The symptomatology can be reproduced by the tilt test (HUT) or by the intravenous administration of ATP (ATP test). First, we measured adenosine plasma levels in patients with NMS just before and during HUT. We found that adenosine plasma levels were higher in patients with a positive HUT. Then, we compared adenosine plasma levels and the expression of A2A receptors in patients with NMS depending on the result of HUT and ATP-test. We found that elevated adenosine plasma levels and A2A receptors overexpression were associated with positive HUT. On the opposite, low adenosine plasma levels and normal expression of A2A receptor were associated with positive ATP test.

Les concentrations d’oxygène (O2) dans la moelle osseuse hématopoïétique, sont très inférieures à celle de l’air (20% d’O2) puisqu’elles vont de 4% dans les zones juxta-vasculaires à 0,1% près de l’endoste, où siègent les cellules souches hématopoïétiques (CSH), essentiellement quiescentes. Ce paramètre physiologique, rarement pris en compte, est un élément important dans la régulation de l’hématopoïèse. Les effets bénéfiques des faibles concentrations d’oxygène sur le maintien des cellules souches hématopoïétiques sont maintenant bien établis. Par contre, la réponse du compartiment des progéniteurs aux faibles concentrations d’oxygène est moins examinée mais très discutée, certains montrant une différenciation associée à un blocage de la prolifération alors que d’autres montrent leur disparition de la culture probablement par apoptose. C’est dans ce contexte que se place ces travaux qui visent à approfondir les effets des faibles concentrations en oxygène (de 3 à 0,1%) sur ce compartiment. La culture pendant 72h à 0,1% O2 de la lignée murine de progéniteurs hématopoïétiques non leucémiques FDCP-Mix entraîne leur arrêt progressif en quiescence (Ki-67 négatif) de ces cellules sans induction d’apoptose. Cet arrêt est associé à la différenciation granulocytaire d’une majorité de la population. Dans ces mêmes conditions de culture persiste une population restreinte de cellules qui s¹auto-renouvellent lentement et qui sont capables après repiquage en culture à 20% d’O2 de repeupler une culture liquide et de former des colonies en milieu semi-solide. Ces changements fonctionnels sont associés aux modifications de protéines du cycle cellulaire impliquées dans la quiescence cellulaire : p27KIP1, pRb et CDK. Cette caractérisation permet désormais d’utiliser cette lignée comme modèle pour l’étude des équilibres fondamentaux au maintien de l’homéostasie hématopoïétique. / Oxygen concentrations (O2) in hematopoietic bone marrow vary from 4% in capillaries to less than 0.1% in subendosteum, where hematopoietic where mostly quiescent stem cells reside. This physiological factor, rarely investigated, is an essential piece of hematopoiesis regulation. The beneficial effects of low oxygen concentrations on the maintenance of hematopoietic stem cells are now well established. In contrast, the effects of low O2 concentration on the progenitors compartment, were much less explored and are then more controversial: some articles evidence a pro-differentiative effect related to a cell proliferation blockade while others observe their rapid disappearance from cultures probably due to apoptosis. In this particular context takes place this work which aims to investigate the low oxygen concentration effect (from 3% to 0.1%) on this precise compartment. Culture of the murine non-leukemic hematopoietic progenitor cell line FDCP-Mix line at 0.1% O2 during 72h induces a progressive G0 quiescence blockade (Ki-67 negative) without apoptosis increase. This G0 cell cycle arrest is correlated with the granulo-monocytic differentiation of most cells. In the mean time a minor population of self-renewing cells continues to cycle slowly as evidenced by their 5-FU sensitivity in primary culture and by their capacity to give rise to colonies and to repopulate liquid cultures when replated in cultures at 20% O2. G0 quiescence and granulocytic differentiation induced by low O2 concentrations is associated with cell cycle protein modifications: p27KIP1, pRb, CDK. This characterization allows FDCP-Mix usage as model to investigate fundamental balances responsible for hematopoietic long-term maintenance.