Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T19:38:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lázaro Moreira Marques Neto - 2014.pdf: 2595139 bytes, checksum: 33c715b27b61926700bbdbafb220894a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-12T19:38:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lázaro Moreira Marques Neto - 2014.pdf: 2595139 bytes, checksum: 33c715b27b61926700bbdbafb220894a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T19:38:53Z (GMT). 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Consequently the need for a new vaccine strategy is urgently needed. Subunit protein vaccines and fusion proteins strategy only deal with the components of the organism that best stimulate the immune system rather than using the whole organism system. However, the development of fusion proteins has no defined rules, as approximating artificial peptides from different proteins leads to new and unpredicted intramolecular interactions. In this study we propose the construction of a fusion protein (CDα) composed of antigenic subunits from proteins of Mycobacterium tuberculosis (Ag85c, MPT51 and HspX). The subunits were chosen due to their potential in inducing a Th1-type immune response and especially for its role in activation and induction of various populations of CD8+ T lymphocytes. Based on analyzes in silico we could design primers that allowed the amplification and subsequent fusion of the subunit gene sequences of, and in addition, inserting a hinge sequence of glycine and serine between each subunit that allowed better protein stability. The gene sequence of CDα was inserted into an expression plasmid and transformed into Escherichia coli BL21 and from this it was possible to induce its expression and purify the recombinant protein on a large scale, however, it was not possible to obtain the protein in a soluble form. The protein sequence was confirmed by sequencing the expression plasmid and analysis of purified recombinant protein composition by mass spectrometry MALDI-TOF. The purified protein was used to standardize an immunoassay test to detect human antibodies, and our data show that the CDα is not antigenic for humoral immune response of patients infected with Mtb (latent TB or active TB). Monoclonal antibodies produced by immunization of BALB/c mice generated titers of 1:20,000 against IgG1 and IgG2a, indicating that the protein has immunogenic potential. We conclude that the CDα protein was constructed without any error or mutation, and this was possible due to technical alliance in silico and in vitro, however further studies are needed to purify the protein in soluble form and especially to ascertain their vaccine potential. / A tuberculose (TB) é um mal antigo que assola a humanidade há milhares de anos e ainda hoje é um grave problema de saúde pública, causando adoecimento de mais de 8 milhões e matando mais de 1 milhão de pessoas todo o ano. A vacina utilizada atualmente, a BCG, foi desenvolvida em 1921 e a partir de 1924 passou a ser utilizada como método profilático contra a tuberculose, sendo considerada a vacina mais amplamente utilizada em todo o mundo. Seu potencial protetor é muito variável, tendo índices de proteção variando de 0 a 80%, mas ainda é utilizada porque ela protege contra as formas mais graves da doença na infância. Vacinas de subunidade protéica e proteínas de fusão utilizam da estratégia de poder lidar apenas com os componentes do microrganismo que melhor estimulam o sistema imune ao invés de utilizar o microrganismo inteiro. No entanto, o desenvolvimento de proteínas de fusão não possui regras definidas, pois a aproximação artificial de peptídeos pertencentes a diferentes proteínas acarretam em novas interações intramoleculares cujos resultados ainda não podem ser totalmente previstos. Nesse trabalho propusemos a construção de uma proteína de fusão (CDα) a partir de subunidades de proteínas conhecidamente antigênicas do Mycobacterium tuberculosis (Ag85c, MPT51 e HspX). As subunidades foram escolhidas a partir de seu potencial de induzir uma resposta imune do tipo Th1 e, principalmente, pelo seu papel na ativação e indução de populações diversas de linfócitos T CD8+. Com base em análises "in silico" foi possível construir oligonucleotídeos iniciadores que possibilitaram a amplificação e posterior fusão das sequências gênicas das subunidades além da inserção de uma sequência hinge de glicina e serina entre cada subunidade que permitiram melhor estabilidade da proteína. A sequência gênica da CDα foi inserida em um plasmídeo de expressão e transformada em Escherichia coli BL21 e a partir disso foi possível induzir sua expressão e purificar a proteína em larga escala, contudo, não foi possível obter a proteína em sua forma solúvel. A sequência da proteína foi confirmada pelo sequênciamento do plasmídeo e por análise da constituição protéica por espectrometria de massa MALDI-TOF. A partir da proteína purificada foi possível padronizar a utilização da proteína em teste de imunoensaio demonstrando que a proteína não é antigênica para a resposta imune humoral de pacientes infectados com o Mtb (TB ativa ou TB latente). Produzimos anticorpos monoclonais por imunização de camundongos BALB/c gerando títulos de 20.000 para IgG1e IgG2, indicando que a proteína tem potencial imunogênico. Podemos concluir que, a proteína CDα foi construída sem qualquer erro ou mutação e isso foi possível devido à aliança de técnicas "in silico" e "in vitro", contudo estudos precisam ser feitos para obter a proteína em sua forma solúvel e principalmente para averiguar seu potencial vacinal.