Environ 20% des chiots nés vivants meurent au cours des trois premières semaines de vie. Cette mortalité néonatale est ainsi responsable de pertes économiques importantes pour les éleveurs. Néanmoins, les déterminants immunitaires et nutritionnels de ces cas de mortalité sont très mal connus dans l'espèce canine. L'objectif de ce travail était donc d'identifier les facteurs de risque de mortalité néonatale chez le chiot, dont en particulier l'importance de la prise colostrale pour la survie. La première partie des résultats a mis en évidence une association forte entre la croissance précoce (sur les deux premiers jours de vie) et les pertes néonatales. Cette croissance précoce reflétant directement la prise colostrale, la suite des travaux s'est ensuite intéressée aux différents apports colostraux. Le transfert d'immunité passive affecte le taux de mortalité, une concentration sérique en immunoglobulines G à l'âge de 2 jours inférieure à 2,3 g/l étant associée à un risque de mortalité néonatale plus élevé et caractérisant un déficit de transfert. Un résultat similaire a été obtenu avec l'étude de l'immunité spécifique dirigée contre le parvovirus canin de type 2 : les chiots ayant acquis les titres en anticorps les plus faibles à deux jours d'âge séroconvertissent et excrètent du virus significativement plus tôt que les chiots avec de plus forts titres d'anticorps maternels. L'apport énergétique colostral était également associé aux chances de survie : les chiots présentant une glycémie à 24 heures de vie inférieure à 0,92 g/l ayant un plus fort risque de mortalité. Outre la forte relation entre survie et prise colostrale (apportant immunoglobulines et énergie), notre travail montre également l'impact du poids et de la vitalité à la naissance (évalué par le score Apgar). Par ailleurs, la qualité immunologique du colostrum (évaluée par sa concentration en IgG), bien que non directement liée aux chances de survie, s'est montrée très variable entre les chiennes, aggravant probablement le risque de déficit de transfert de l'immunité passive chez certains chiots. Tous ces travaux contribuent à une meilleure connaissance des facteurs de risque de mortalité qu'il est important de contrôler en élevage. Ils révèlent le rôle crucial de la croissance foetale, du déroulement de la mise-bas et de l'ingestion colostrale. Une pesée des chiots au cours des premiers jours de vie peut être a minima conseillée aux éleveurs pour identifier les chiots à risque et auxquels des soins plus attentifs devront être apportés. / Neonatal mortality in dogs (within the first three weeks after birth) accounts on average for 20% of puppies born alive, being thus responsible for a great economic loss to dog breeders. However, immunological and nutritional determinants of puppies survival are poorly described. This dissertation thus investigated the risk factors of neonatal mortality in dogs, and in particular the importance of colostrum intake for survival. The first part of results revealed a strong association between early growth rate (during the first two days of life) and neonatal losses. As early growth rate reflects the colostrum intake, the role of colostrum was then addressed. Passive immune transfer was shown to affect mortality rate, with serum IgG concentration at two days of age lower than 2.3 g/L being characterized as in deficit of maternal immunoglobulins. Similar lack of immunoprotection was observed for a specific canine pathogen (canine parvovirus type 2), as puppies with low antibody titers at two days of age seroconverted or underwent parvovirus infection significantly earlier than puppies with higher titers. Energy intake, evaluated via blood glucose concentration at 24h of life, was also found associated with survival: puppies with low glucose concentration (≤ 92 mg/dl) were found at higher risk of death. Besides the strong relationship between colostrum ingestion, providing passive immunity and energy, the impact of birth weight and vitality at birth (evaluated via Apgar score) on puppies’ survival was also evidenced. Colostrum immune quality (evaluated via IgG concentration), although not directly linked with the risk of neonatal death, was found of great variability, most probably putting some puppies at a risk of passive immune deficit. The present study contributed to the knowledge about the risk factors of mortality to be controlled in breeding kennels. Results provided in this work revealed the crucial role of the fetal growth, course of parturition and intake of the colostrum for the newborn dog. Regular weighing of newborns can be advised as a practical application for dog breeders, as it allows to identify puppies at a higher risk of death and to provide puppies with additional nursing and veterinary care.

Ce travail porte sur différentes méthodes de détection de protéines par des anticorps (Acs) marqués par des boîtes quantiques (QD, « quantum dots »). La première partie de la thèse porte sur le développement et l'optimisation de méthodes de conjugaison d'Acs polyclonaux à des QDs. Une étude de 2007 avait démontré que les conjugués anticorps-quantum dots (Acs-QDs) commerciaux ne présentent que de très rares anticorps fonctionnels à leur surface [Pathak et al., 2007]. Nous avons donc : (i) développé des conditions de réduction ménagée des ponts disulfures des Acs en utilisant soit du dithiothreitol, soit du 2-mercapotethanolamine, (ii) purifié les fragments d'Acs fonctionnels grâce à une colonne d'affinité, (iii) conjugué ces fragments fonctionnels d'Acs aux QDs en utilisant l'agent de liaison amine-thiol SMCC et (iv) développé une méthode de purification des conjugués sur gel d'agarose afin d'éliminer les fragments d'Acs non conjugués et les QDs libres. Des tests en cytométrie en flux ont permis de déterminer l'efficacité des conjugués pour détecter l'expression de la molécule CD4 à la surface de lymphocytes T humains. Un marquage de CD4 réalisé avec des conjugués préparés selon notre méthode s'avère être cinq fois plus sensible qu'en utilisant des conjugués réalisés selon les recommandations commerciales. Une autre méthode de préparation des Acs pour la conjugaison aux QDs a été testée : l'ajout de groupements fonctionnels sulfhydriles sur des amines primaires grâce au N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). Cependant, cette méthode ne permet pas d'avoir un contrôle précis du nombre ni de l'emplacement des groupements fonctionnels sulfhydriles ainsi ajoutés. Les tests de conjugaison aux QDs qui ont été réalisés avec ces Acs-SH, en utilisant l'agent de liaison SMCC, a entraîné la formation d'agrégats de taille variable. Cette méthode a donc été abandonnée.La seconde partie de la thèse porte sur la démonstration de la faisabilité et l'optimisation d'un marquage de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA, « carcinoembryonic antigen ») humain à la surface de lignées cellulaires murines avec un anticorps simple domaine (sdAb) anti-CEA biotinylé détecté grâce à des conjugués streptavidine-QDs commerciaux et analysé par cytométrie en flux. Ces sdAbs ont été biotinylés selon deux approches : (i) avec des agents de biotinylation chimique qui permettent d'ajouter une biotine sur les amines primaires (biotinylation in vitro) et (ii) par une enzyme lors de leur production par E. coli (biotinylation in vivo). La détection du CEA humain à la surface des 100 000 cellules (lignées cellulaires murine MC38 et MC38-CEA) par ces sdAbs biotinylés a été testée en cytométrie de flux puis comparée à celle obtenue par un anticorps monoclonal biotinylé in vitro. Les résultats ont démontré que les sdAbs biotinylés ont une sensibilité de détection similaire que la biotinylation soit réalisée in vitro ou in vivo. Par contre, la sensibilité de la détection du CEA est environ cinquante fois meilleure en utilisant des sdAbs biotinylés (0,6 fmol d'anticorps sont nécessaires pour détecter le CEA) qu'avec des anticorps monoclonaux biotinylés (33 fmol). / We have been working on different ways to detect proteins with antibodies (Abs) labeled by quantum dots (QDs). The first part of his work is to develop and optimize the conjugation of polyclonal antibodies to quantum dot. A study has reported that commercial antibody-quantum dots conjugates (Abs-QDs) present very few functional Ab fragments at the surface of the conjugate [Pathak et al., 2007]. We had: (i) developed an advanced procedure of antibody reduction using dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanolamine (2-MEA) (to prevent the loss of antibody functions), (ii) purified the active fragments by affinity purification on column, (iii) conjugated the active reduced antibody fragments to QDs using the amine-thiol crosslinker SMCC for SH coupling, and (iv) developed the purification of the conjugates on agarose gel to remove free QDs and unconjugated antibody fragments. Our conjugates present about a five times better ability to detect CD4 by flow cytometry on 500 000 isolated human lymphocyte T cells than those made after the commercial procedure. Another procedure for antibody preparation was addition of sulfhydryl groups on primary amines using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). However this procedure presents some variable yield and the number and the localization of sulfhydryl groups added on antibody cannot be fully controlled. Thereby, the conjugation of these Abs-SH to QDs using SMCC chemistry leads to the creation of aggregates. This Ab preparation in preparation for conjugation to QDs was abandoned.The second part of our work focusses on testing and comparing the ability to detect carcinoembryonic antigen (CEA) by flow cytometry with anti-CEA single domain antibodies (sdAbs) labeled by QDs. The sdAbs were biotinylated by using two methods: (i) in vitro chemical biotinylation reagent which adds biotins on primary amines, and (ii) enzymatic in vivo biotinylation during their production in E. coli. These anti-CEA sdAb biotinylation methods were compared to in vitro biotinylated monoclonal Abs against CEA for their respective ability to detect human CEA on 100 000 mice cells (MC38 and MC38-CEA cell lines) using flow cytometry. The results show that the limit detection for biotinylated sdAbs is similar between in vitro and in vivo biotinylation. Furthermore the limit detection with biotinylated sdAb (0.6 fmol are required to detect CEA) is about fifty times better than with biotinylated monoclonal Abs (33 fmol).

Domain swapping is a wide spread phenomenon which involves the association between two or more protein subunits such that intra-molecular interactions between domains in each subunit are replaced by equivalent inter-molecular interactions between the same domains in different subunits. This thesis is devoted to the analysis of the factors that drive proteins to undergo such association modes. The specific system analyzed is the monomer to swapped dimer formation of the B1 domain of the immunoglobulin G binding protein (GB1). The formation of this dimer was shown to be fostered by 4 amino acid substitutions (L5V, F30V, Y33F, A34F) (Byeon et al. 2003). In this work, computational protein design and molecular dynamics simulations, both with detailed atomic models, were used to gain insight into how these 4 mutations may promote the domain swapping reaction.<p>The stability of the wt and quadruple mutant GB1 monomers was assessed using the software DESIGNER, a fully automatic procedure that selects amino acid sequences likely to stabilize a given backbone structure (Wernisch et al. 2000). Results suggest that 3 of the mutations (L5V, F30V, A34F) have a destabilizing effect. The first mutation (L5V) forms destabilizing interactions with surrounding residues, while the second (F30V) is engaged in unfavorable interactions with the protein backbone, consequently causing local strain. Although the A34F substitution itself is found to contribute favorably to the stability of the monomer, this is achieved only at the expense of forcing the wild type W43 into a highly strained conformation concomitant with the formation of unfavorable interactions with both W43 and V54.<p>Finally, we also provide evidence that A34F mutation stabilizes the swapped dimer structure. Although we were unable to perform detailed protein design calculations on the dimer, due to the lower accuracy of the model, inspection of its 3D structure reveals that the 34F side chains pack against one another in the core of the swapped structure, thereby forming extensive non-native interactions that have no counterparts in the individual monomers. Their replacement by the much smaller Ala residue is suggested to be significantly destabilizing by creating a large internal cavity, a phenomenon, well known to be destabilizing in other proteins. Our analysis hence proposes that the A34F mutation plays a dual role, that of destabilizing the GB1 monomer structure while stabilizing the swapped dimer conformation.<p>In addition to the above study, molecular dynamics simulations of the wild type and modeled quadruple mutant GB1 structures were carried out at room and elevated temperatures (450 K) in order to sample the conformational landscape of the protein near its native monomeric state, and to characterize the deformations that occur during early unfolding. This part of the study was aimed at investigating the influence of the amino acid sequence on the conformational properties of the GB1 monomer and the possible link between these properties and the swapping process. Analysis of the room temperature simulations indicates that the mutant GB1 monomer fluctuates more than its wild type counter part. In addition, we find that the C-terminal beta-hairpin is pushed away from the remainder of the structure, in agreement with the fact that this hairpin is the structural element that is exchanged upon domain swapping. The simulations at 450 K reveal that the mutant protein unfolds more readily than the wt, in agreement with its decreased stability. Also, among the regions that unfold early is the alpha-helix C-terminus, where 2 out of the 4 mutations reside. NMR experiments by our collaborators have shown this region to display increased flexibility in the monomeric state of the quadruple mutant.<p>Our atomic scale investigation has thus provided insights into how sequence modifications can foster domain swapping of GB1. Our findings indicate that the role of the amino acid substitutions is to decrease the stability of individual monomers while at the same time increase the stability of the swapped dimer, through the formation of non-native interactions. Both roles cooperate to foster swapping. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished