Les miopaties inflamatòries (MI) es defineixen com a malalties musculars amb presència d'infiltrats inflamatoris a la biòpsia muscular. Hem estudiat la miositis per cossos d'inclusió (MCI), la dermatomiositis (DM) i les disferlinopaties (DISF) perque hem aconseguit sèries de malalts llargues clínicament ben definides. En el primer treball es va estudiar la freqüènica i possible rellevància immunopatogènica de banda monoclonal (BM) en malalts amb MCI. Per això vàrem estudiar el sèrum de 70 malalts amb MCI i 80 controls. Es van analitzar per immunofixació, immunohistoquímica (IH), ANAs, immunoprecipitació (IP) d'ARNs i Western-Blot (WB). Un 22.8% de malalts amb MCI presentaren banda monoclonal. Els ANAs i la IP de ARNs no foren significatius. Alguns sèrums reconeixien mionuclis per IH. El WB va revelar reactivitat contra diversos antígens musculars amb més freqüència a la MCI i BM. Concluim que la MCI, sense tenir en compte l' edat, s'associa més freqüentment a BM, que sovint reconeix antígens musculars, especialment mionuclis, suggerint una desregulació immunològica. En el segon i tercer treballs es va estudiar el paper dels factors de transcripció STAT, i especialment STAT1 en la patogènia de la de DM. Es varen estudiar biòpsies de DM, polimiositis (PM), músculs isquèmics i controls, així com cultius primaris de múscul esquelètic (CPME) humà estimulats amb diferents citoquines/factors de creixement. La anàlisi es va realitzar mitjançant IH, WB i RT-PCR semiquantitativa. Es va observar un augment d'expressió de STAT1 en les fibres perifasciculars (FP) a la DM i no a la resta de biòpsies estudiades on només hi havia expressió als infiltrats inflamatoris. En els CPME només l' IFN-g i no altres citoquines/factors de creixement estudiats augmentava la expressió de STAT1. A més es va observar una expressió incrementada de catepsines B i L a les FP i no en les altres miopaties estudiades. Els nivells de Bclx-l també estaven augmentats i els de Fas es manteniren a nivells basals. La fludarabina bloquejava els efectes del IFN-g. Concluim d'aquests treballs que l'expressió augmentada de catepsines a les FP a la DM pot contribuir a la seva patogènia junt amb un fenòmen d'isquèmia, que el model de CPME pot ser d'utilitat en l'estudi del paper de les citoquines a les MI i que la fludarabina pot ésser d'utilitat en el tractament de malalts amb DM resistents a altres tractaments. En el darrer treball es va caracteritzar la inflamació en malalts amb DISF, un tipus de distròfia muscular lligada a un gen (disferlina) descrit molt recentment, i es va observar un predomini de macròfags amb un nombre reduït de limfòcits T CD8+ amb una absència d'expressió de complex d'histocompatibilitat de classe I (MHC-I). Concluim que en malalts joves amb debilitat de cintures esporàdica, CK molt aixecades, fibres necròtiques, infiltrats endomisials i/o perivasculars, sense augment de MHC-I a la biòpsia muscular, s'ha de plantejar un diagnòstic de DISF ja que en les fases inicials de la malaltia els signes de distròfia muscular poden ser molt lleus. / Las miopatías inflamatorias (MI) se definen como enfermedades musculares con presencia de infiltrados inflamatorios en la biopsia muscular. Hemos estudiado la miositis por cuerpos de inclusión (MCI), la dermatomiositis (DM) y las disferlinopatías (DISF) porque hemos conseguido series de enfermos amplias clínicamente bien definidas. En el primer trabajo se estudió la frecuencia y posible relevancia inmunopatogénica de banda monoclonal (BM) en enfermos con MCI. Para ello estudiamos el suero de 70 enfermos con MCI y 80 controles. Se analizaron mediante inmunofijación, inmunohistoquímica (IH), ANAs, inmunoprecipitación (IP) de ARNs y Western-Blot (WB). Un 22.8% de enfermos con MCI presentaron banda monoclonal. Los ANAs y la IP de ARNs no fueron significativos. Algunos sueros reconocían mionúcleos por IH. El WB reveló reactividad contra diversos antígenos musculares con más frecuencia en la MCI y BM. Concluimos que la MCI, sin tener en cuenta la edad, se asocia con más frecuencia a BM, que a menudo reconoce antígenos musculares, especialmente mionúcleos, sugiriendo una desregulación inmunológica. En el segundo i tercer trabajos se estudió el papel de los factores de transcripción STAT, y especialmente STAT1 en la patogenia de la DM. Se estudiaron biopsias de DM, polimiositis (PM), músculos isquémicos y controles, así como cultivos primarios de músculo esquelètico (CPME) humano estimulados con distintas citoquinas/factores de crecimiento. El análisis se realizó mediante IH, WB y RT-PCR semicuantitativa. Se observó un aumento de expresión de STAT1 en las fibras perifasciculares (FP) en la DM y no en el resto de biopsias estudiadas donde sólo había expresión en los infiltrados inflamatorios. En los CPME sólo IFN-g y no otras citoquinas/factores de crecimiento estudidos aumentaba la expresión de STAT1. Además se observó una expresión aumentada de catepsinas B y L en las FP y no en las otras miopatías estudiadas. Los niveles de Bclx-l también estaban aumentados y los de Fas se mantuvieron a niveles basales. La fludarabina bloqueaba los efectos del IFN-g. Concluimos de estos trabajos que la expresión aumentada de catepsinas en las FP en la DM puede contribuir a su patogenia junto con un fenómeno de isquemia, que el modelo de CPME puede ser de utildad en elestudio del papel de las citoquinas en las MI y que la fludarabina puede ser de utilidad en el tratamiento de enfermos con DM resistentes a otros tratamientos. En el último trabajo se caracteritzó la inflamación en enfermos con DISF, un tipo de distrofia muscular ligada a un gen (disferlina) descrito muy recientemente, y se observó un predominio de macrófagos con un número reducido de linfocitos T CD8+ con una ausencia de expresión de complejo de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Concluimos que en enfermos jóvenes con debilidad de cinturas esporádica, CK muy elevadas, fibras necróticas, infiltrados endomisiales y/o perivasculares, sin aumento de MHC-I en la biopsia muscular, se ha de plantear un diagnóstico de DISF ya que en las fases iniciales de la enfermedad los signos de distrofia muscular pueden ser muy leves. / The inflammatory myopathies (MI) can be defined as muscular diseases that show inflammatory infiltrates in the muscle biopsy. We have studied inclusion bosy myositis (IBM), dermatomyositis (DM) and disferlinopathies (DYSF) because we have gathered long series of patients clinically well-defined. In the first paper we studied the frequency and possible immunopathologic relevance of monoclonal gammopathy (MG) in patients with IBM. We studied sera of 70 patients with IBM and 80 controls. We performed immunofixation, immunohistochemistry (IH), ANAs, RNA immunoprecipitation (IP) and Western-Blot (WB). 22.8% of IBM patientspresented MG. ANAs and RNA IP were not significant Some sera recognized myonuclei in the IH. WB showed reactivity against several muscle antigens, more frequently in IBM with MG. We conclude that IBM, regardless of age, is frequently associated with MG, that often recognizes muscle antigens, specially myonuclei, suggesting and immunologic disregulation in these patients. In the second and third papers we studied the role of transcription factors STAT, specially STAT1 in the pathogenesis of DM. We studied both, muscle biopsies of DM, polymyositis (PM), ischemic muscles and controls, and human skeletal muscle primary cultures (SMPC) stimulated with diferent cytokines/growth factors. We performed IH, WB and semiquantitative RT-PCR . We observed an increased expression of STAT1in perifascicular muscle fibers (PF) in DM and not in the other biopsies studied, where only inflammatory infiltrates were positive. In the SMPC only IFN-g and not other cytokines/growth factors studied was able to upregulate the expression of STAT1. Furthermore, an increased expression of cathepsins B and L was observed at the PF in DM and not in the other biopsies studied. Bclx-l levels were also raised whereas Fas expression remained unchanged. Fludarabine blocked IFN-g effects. We conclude from this work that increased expression of cathepsins at the PF in DM may contribute to its pathology together with the ischemia, SMPC can be useful to study the role of cytokines in IM and that fludarabine may be useful in the treatment of patients with DM who are resistant to other therapies. In the last paper we characterized inflammation in patients with DYSF, a type of muscle dystrophy linked to a gene (dysferlin) recently described, and we observed an increased number of macrophages, a reduced number of T CD8+ lymphocytes together with a lack of histocompatibility complex class-I (MHC-I) expression. We conclude that in young patients with sporadic limb girdle weakness, high CK levels, necrotic fibers, endomysial and/or perivascular infiltrates, without raised expression of MHC-I, a diagnosis of DYSF should be considered, specially at the initial stages of the disease when the dystrophic features may be very benign.

INTRODUCCIÓN: La dermatomiositis (DM) es una enfermedad de origen autoinmune, incluida en el grupo de las miopatías inflamatorias idiopáticas. En el control clínico de este proceso se precisan marcadores que permitan determinar el grado de actividad de la enfermedad, facilitando así el ajuste la terapia inmunomoduladora. Se analiza la relación entre los productos de activación del complemento (PAC) y la actividad de la DM y su utilidad en el seguimiento de la enfermedad y en la predicción de las reagudizaciones en relación a los parámetros bioquímicos habituales.MÉTODOS:Se estudiaron 16 pacientes con DM, que fueron seguidos periódicamente. En cada revisión se estableció el grado de actividad cutánea y muscular del proceso y se correlacionó dicha actividad con los niveles plasmáticos de C3a y C5b-9, determinados mediante técnica de ELISA. RESULTADOS:Si bien se obtuvo cierta correlación entre la actividad del proceso y los niveles plasmáticos de C3a y C5b-9, la intensidad de dicha correlación no superó a la obtenida por los marcadores bioquímicos tradicionales. En la capacidad de predicción de reagudizaciones, C3a se mostró como el marcador más sensible (100%) con una especificidad suficiente (83.3 %).CONCLUSIONES:C3a y en menor medida C5b-9 serían de utilidad en la identificación de pacientes con DM especialmente activas, así como en la predicción de reagudizaciones del proceso. Sin embargo no tienen una utilidad superior al resto de marcadores bioquímicos como marcadores de actividad actual.

El factor de la necrosis tumoral, TNF-alfa, es una citocina pleiotrópica implicada en un amplio espectro de respuestas inflamatorias y del sistema inmune. El efecto biológico del TNF-alfaestá mediado por dos receptores de membrana, el receptor 1 de TNF, TNFR1 y el receptor 2 de TNF, TNFR2. Estos dos receptores se pueden presentar como receptores solubles formados a partir del procesamiento proteolítico de la región extracelular del receptor de membrana. Se han descrito concentraciones elevadas de receptor soluble de TNFR2 en el suero de múltiples patologías inflamatorias. En este trabajo, describimos por primera vez una isoforma de RNAm de TNFR2 humano, producida por splicing alternativo, a la que le faltan los exones 7 y 8 que codifican la mayor parte de la región citoplasmática y parte del domininio intracitoplasmático de la proteina. El splicing alternativo de los dos exones produjo un cambio en la pauta de lectura, lo que llevó a la aparición de un nuevo codón de parada tras 6 nuevos aminoácidos. Se obtenía de este modo, un cDNA que codificaba una proteína de TNFR2 formada por la misma región extracelular y los mismos 5 primeros aminoácidos del dominio transmembrana, que el TNFR2 nativo, seguidos de 6 nuevos aminoácidos como único extremo carboxilo terminal. El estudio de la expresión de la proteína en células tranfectadas con el cDNA de esta isoforma, mostró la naturaleza soluble de esta proteína. La proteína poseía un peso molecular de aproximadamente 42 KDa. En un ensayo de citotoxicidad inducida por TNF-alfa, se mostró que esta isoforma podía bloquear la apoptosis inducida por TNF-alfa lo que sugiere su función reguladora de la acción del TNF como antagonista de su función biológica. Se desarrolló un ELISA que cuantifica el receptor soluble generado por splicing alternativo. Y se determinaron las concentraciones de receptor soluble producido por splicing alternativo en el suero de individuos sanos y en pacientes de diferentes patologías inflamatorias. Nuestros datos muestran que el receptor soluble producido por splicing alternativo está presente en el suero de individuos sanos a bajas concentraciones y a concentraciones elevadas en sujetos con sepsis y artritis reumatoide. Se determinó que existe una asociación negativa entre el receptor soluble producido por splicing alternativo y varios componentes del síndrome metabólico y también con la resistencia a la insulina.Por otro lado, se observó que los pacientes de artritis reumatoide con valores muy elevados de isoforma, presentaban, probablemente una mejor respuesta a la terapia con anticuerpos anti-TNF-alfa.

La presente Tesis Doctoral es un trabajo de investigación aplicada en el campo de la Química Médica. Se centra en el estudio de las integrinas GPIIb-IIIa y VLA-4, unos receptores de adhesión celular de tipo proteínico, que recientemente han sido validados como dianas potencialmente terapéuticas. Por un lado los antagonistas de la integrina GPIIb-IIIa han demostrado su eficacia como potentes antiagregantes plaquetarios y por otro, los antagonistas de la VLA-4 podrían aportar un nuevo tratamiento en enfermedades inflamatorias crónicas (esclerosis múltiple, asma, ó artritis reumatoidea).El trabajo se estructura en dos capítulos independientes. En el primero se plantea la optimización de la síntesis del ácido 2(S)-(bencenosulfonilamino)-3-[N-[[2-(4,4'-bipiperidin-1-il)-4-isopropiltiazol-5-il]carbonil]amino]propiónico ó UR-12947. Este compuesto había sido identificado previamente como un potente antagonista de la integrina GPIIb-IIIa y fue elegido como candidato para iniciar estudios clínicos. En esta parte se han estudiado todas las reacciones necesarias para preparar este compuesto, y se ha conseguido finalmente adecuar la síntesis para su ejecución en una planta piloto: se han mejorado los rendimientos en todos los pasos y se han evitado las cromatografías. Finalmente, también se ha puesto a punto un método de separación de enantioisómeros mediante electroforesis capilar para asegurar la pureza óptica del producto final.En el segundo capítulo, en primer lugar se han diseñado una serie de nuevas moléculas con carácter peptidomimético que podrían actuar como potentes antagonistas de la VLA-4. Este estudio se ha realizado empleando técnicas computacionales de modelado molecular. Como resultado de este trabajo se propuso la síntesis de 61 compuestos divididos en tres familias: derivados del ácido glutámico, del ácido (S)-2,3-diaminopropiónico (DAP) y de la serina. Se desarrollaron esquemas de síntesis convergentes comunes para las dos primeras familias y un esquema específico para los derivados de la serina, y se prepararon todos los compuestos pretendidos. En el caso concreto de las ureas derivadas del DAP se ha puesto a punto una nueva metodología sintética para su preparación a partir de la apertura nucleofílica de imidazolonas usando radiación de microondas. Finalmente, todos los compuestos se han evaluado farmacológicamente y se ha realizado un estudio estructura-actividad (SAR). En este estudio se han identificado compuestos con una potente actividad in vitro como antagonistas de la VLA-4 y se han seleccionado los más activos para iniciar estudios farmacocinéticos. Además se han deducido importantes hechos estructurales que nos han permitido entender mejor la interacción entre la integrina VLA-4 y su ligando natural, el VCAM-1. ABSTRACT / This work is focused in a Medicinal Chemistry research in the Integrin field. Integrins are a large family of cell surface transmembrane receptors involved in numerous biological processes. Two integrins are studied in this thesis: the GPIIb-IIIa, implicated in cardiovascular diseases and the VLA-4, involved in autoimmune diseases. This thesis has two parts. First, the synthetic route for the preparation of 2(S)-(benzenesulphonylamino)-3-[N-[[2-(4,4'-bipiperidin-1-yl)-4-isopropylthiazol-5-yl]carbonyl]amino]propionic acid (UR-12947) was optimised in order to scale it up in a pilot plant. This compound had been identified as a potent GPIIb-IIIa integrin antagonist. In the second part, the design, synthesis and biological activities of novel VLA-4 antagonist series are described. These compounds could potentially be effective therapies for asthma, multiple sclerosis, and rheumatoid arthritis. Several compounds showed nanomolar IC50 values, and they were selected for pharmacokinetics studies. Furthermore, new ideas about the interaction between the VLA-4 and its natural ligand, the VCAM-1 are proposed.

La membrana sinovial, és el lloc on s'inicia i es perpetua el procés inflamatori que caracteritza a les diferents artropaties inflamatòries. A diferència d'altres òrgans no té una estructura definida, motiu pel qual el context on es produeix la investigació és un teixit poc diferenciat que dificulta trobar diferències rellevants.Els treballs presentats en aquesta tesi, intenten aportar algunes claus per aprofundir en la patògenia i el pronòstic dels diferents tipus d'artritis.L'objectiu de la tesi seria demostrar si existeixen diferències macroscòpiques vasculars (patrons vasculars valorats per artroscòpia) així com d'expressió cel·lular i de certes mol.lècules entre els diferents tipus d'artritis i la seva correlació amb els mecanismes fisiopatogènics subjacents i amb el pronòstic.La hipòtesi de treball seria que aquestes diferències ens poden orientar sobre el tipus de sinovitis i ens ajuden a trobar marcadors sinovials d'utilitat diagnòstica i pronòstica.L'artroscòpia ha demostrat ser el millor mètode per l'estudi directe de la membrana sinovial i l'obtenció de mostres dirigides. La introducció d'aquesta tècnica en algunes unitats d'artritis ha permès un estudi sistemàtic dels patrons vasculars i la seva correlació amb la clínica. Per altra banda, la anàlisi immunohistoquímica de l'expressió de diferents tipus cel·lulars i mol.leculars, ha estat àmpliament validada en l'estudi microscòpic del teixit sinovial.Els patrons sinovials són útils per diferenciar entre entitats clíniques i entre subtipus d'una mateixa malaltia. Existeixen diferències d'expressió cel·lular i de la proteïna p53 entre els pacients amb artritis reumatoide (AR) i artritis psoriàsica (APso), i aquestes diferències tant a nivell macroscòpic com microscòpic es corresponen amb una realitat clínica i pronòstica dels pacients.Les aportacions d'aquesta tesi apunten a utilitzar aquestes troballes com a ajuda en el coneixement fisiopatògenic d'aquestes malalties i com a via per establir factors pronòstics i de resposta al tractament. / "CLASSIFICATION OF SYNOVITIS BY ARTHROSCOPIC AND IMMUNOHISTOQUIMIC METHODS. DIAGNÒSTIC AND PROGNOSTIC VALUE"TEXT:Inflammation of synovial tissue (synovitis) is a common final pathway in different inflammatory arthritides. Synovium, has not a well defined structure compared with other organs, so investigation in this field makes difficult to find relevant differences. The studies conforming this Doctoral Thesis, try to clarify some of the aspects of pathogenesis and prognostic of different types of arthritis. Our objective would be to assess if there are macroscopic vascular differences (vascular patterns by arthroscopy) either different molecular and cellular expression among different types of arthritis. We also try to correlate these features, with subjacent pathogenic mechanisms and prognosis.Our hypothesis would be that these differences may give us information about the type of synovitis and aid us to find synovial markers with diagnostic and prognostic utility.Arthroscopy has been proved as the best method to provide a direct study of synovial membrane and to obtain specific samples. Introduction of this technique in arthritis units has provide insight into the systematic study of vascular patterns and their correlation with clinical. Furthermore, immunohistochemical analysis of different cellular and molecular expression has been widely validated in the microscopic study of synovial tissue. Synovial vascular patterns may be of interest to discriminate different types of arthritis and different subgroups of patients with the same disease. There is a differential cellular expression and of the protein p53 between patients with rheumatoid arthritis (RA) and psoriatic arthritis (PsA). These differences correlate with a clinical and prognostic reality. The contribution of this thesis aim to use these findings as a pathway in the pathogenic knowledge of inflammatory diseases and alights a way to establish prognostic factors and evaluate the efficacy of treatments.

La malaltia de Crohn és una malaltia inflamatòria intestinal de base immunitària. L’etiologia de la malaltia és desconeguda, encara que en general s’admet la següent definició: la malaltia és conseqüència d’una desregulació de la resposta immunitària en front als antígens comuns de la flora bacteriana intestinal en individus genèticament susceptibles. Un component important de la desregulació immunitària es la hiperactivació dels limfòcits T que es dóna en aquesta i altres malalties de tipus autoimmunitari, i en les que tradicionalment s’ha atribuït una major presència i producció de citocines per part de la població limfocitària Th1 en el teixit inflamat. Recentment, amb la descripció de la citocina IL-23 i la població Th17 se ha posat en dubte el paper principal de la població Th1 en les malalties inflamatòries de base immunitària. De fet, en algunes d’aquestes malalties s’ha descrit un augment de las cèl•lules Th17 així com de les citocines produïdes per aquesta població. L’objectiu d’aquesta tesi ha sigut caracteritzar el paper relatiu de les poblacions Th1 i Th17 en la mucosa intestinal inflamada i en la circulació perifèrica de pacients amb malaltia de Crohn activa o en remissió així com avaluar el paper i l’evolució d’aquestes poblacions limfocitàries en els estadis inicials (primers brots de la malaltia) i avançats de la malaltia. En aquest estudi observem que els períodes d’activitat inflamatòria en la malaltia de Crohn s’associen a una resposta sistèmica exacerbada de la població Th17, essent la producció de IL-17 en sobrenedant del cultiu de sang total, el percentatge de limfòcits CD4+IL-17+ i la producció de IL-17 per part d’aquestes cèl•lules més elevada que en els pacients amb malaltia inactiva i que en els controls sans. Paral•lelament hem descrit que la població Th1 circulant no presenta durant un brot d’activitat un augment tan generalitzat com la població Th17, sinó que només observem un augment en el percentatge de limfòcits CD4+IFN-γ+ circulants i en els dobles productors de IL-17 y IFN-γ. Els pacients que denominem debut (pateixen el primer brot de la malaltia) no presenten a nivell sistèmic un augment de la resposta Th17 ni Th1. A diferència del que observem en circulació perifèrica, en la mucosa intestinal inflamada trobem un augment dels trànscrits de les citocines característiques de la població Th17, tant en els pacients debut com en els que es troben en un estat més avançat de la malaltia. A més, en la mucosa inflamada d’ambdós grups de pacients trobem una major infiltració de cèl•lules IL-17+. A partir d’aquests resultats hipotetitzem un model per a la fisiopatologia de la malaltia de Crohn en el que la generació de limfòcits Th17 memòria podrien estar implicats en la cronicitat i recurrència de la malaltia. Així en les primeres fases de la malaltia només detectem un augment d’aquesta població en la mucosa intestinal, com seria d’esperar d’una resposta immunitària local. A conseqüència d’aquesta es generarà una població limfocitària de memòria immunitària que només detectem en circulació en aquells malalts que es troben ja en estadis més crònics de la malaltia. Amb aquesta hipòtesi podem explicar mitjançant mecanismes immunitaris diferents el fet que, en general, la malaltia de Crohn no es manifesta fins la segona o tercera dècada de vida d’un individu, mentre que un cop s’ha manifestat, la recurrència d’activitat inflamatòria és molt més freqüent (degut a la participació dels limfòcits memòria). / One component of the immune deregulation observed in Crohn’s disease is the massive infiltration of T lymphocytes in the inflamed tissue. Classically these hyperreactive lymphocytes have been attributed to the Th1 subpopulation. Recently the description of IL-23 cytokine and Th17 population has questioned the main role given to Th1 population. In this regard, an increase in the frequency of Th17 cells and in the production of their signature cytokines has been already described in some inflammatory diseases. In this study we have observed that active inflammation in Crohn’s disease associates to an increased systemic response of Th17 cells described as overproduction of IL-17 in supernatants of whole blood cultures, increased percentage of CD4+IL-17+ lymphocytes and increased production of IL-17 from these cells related to remission periods of disease or healthy controls. Early patients (patients who suffer their first flare of the disease) do not present a systemic increase of Th1 or Th17 cells despite suffering of active inflammation. Otherwise, in inflamed intestinal mucosa there is an increase in the expression of Th17 cytokines both in early as well as late chronic patients. Moreover we found a significant higher number of Th17 cells infiltrating the mucosa of both groups of patients. Taking these results into account we hypothesize a model for the physiopathology of Crohn’s disease in which the generation of memory Th17 lymphocytes could be involved in the chronicity and recurrence of the disease. Therefore, in early phases of disease we only detect an increase of this population in the intestinal mucosa, as we could expect from a local immune response. As a consequence of this activation there would be a generation of memory lymphocytes that we can detect in peripheral circulation only in that patients that have already suffered repeated flares of the disease. This hypothesis allows us to explain the different immune mechanisms that could be acting during the evolution of Crohn’s disease, as it is the first appearance of disease, generally occurring during the second or third decade of the individual life, and the subsequent appearance of recurrences that are much more frequent and life-long lasting.

En el patró fibroestenosant de la malaltia de Crohn els fibroblasts intestinals augmenten en número contribuint al desenvolupament de la fibrosi. Un dels principals promotors de la proliferació d’aquestes cèl•lules és el bFGF. En el present estudi la fracció rica en tocotrienol ha demostrat tenir efectes antiproliferatius en fibroblasts intestinals humans independentment de la procedència dels fibroblasts. Els tocotrienols redueixen tant la proliferació basal com la induïda per bFGF en fibroblasts. L’apoptosi de les cèl•lules efectores en el desenvolupament de la fibrosi sembla ser el principal mecanisme de la seva resolució. Els tocotrienols instauraren un procés complert d’apoptosi en els fibroblasts. A diferència del que passa amb la majoria d’agents proapoptòtics, els tocotrienols provoquen l’activació tant de la via extrínseca com de la via intrínseca de l’apoptosi ja que activa les caspases 8 i 9. Sorprenentment, l’addició de ciclosporina A (CsA), un conegut inhibidor de la via intrínseca de l’apoptosi, bloqueja completament el procés d’apoptosi induït per FRT. Això demostra que tot i l’activació de la caspasa 8 i per tant, de la via extrínseca, en el tractament amb tocotrienols la predominant és la via intrínseca. L’autofàgia té un paper molt rellevant en l’aclariment de cossos apoptòtics. Els tocotrienols han demostrat eficàcia en la inducció d’autofàgia en fibroblasts, ja que provoca la maduració de la proteïna LC3 i l’aparició de vacuoles autofàgiques en el citoplasma d’aquestes cèl•lules. Un cop més la CsA reverteix aquest procés, i per tant inhibeix l’autofàgia, demostrant que aquest procés requereix la participació de la mitocòndria. Les patologies que cursen amb desenvolupament de fibrosi estan associades a alts nivells de TGF-β que resulta en el reclutament de fibroblasts al lloc de la lesió i a un increment en la producció de matriu extracel•lular. A nivell intracel•lular, la fosforilació d’Smad3 és el pas clau que regula les accions del TGF-β. Els tocotrienols han mostrat eficàcia en la disminució dels nivells intracel•lulars d’Smad3 fosforilada induïda per TGF-β. La fosforilació d’Smad3 té efectes oposats en la regulació de l’expressió gènica. Regula positivament l’expressió de TIMP-1, en canvi, regula negativament l’expressió de MMP-3. Tot i ser efectes oposats en quant a expressió gènica, aquests dos fenòmens afavoreixen l’acumulació de matriu extracel•lular. L’exposició a tocotrienols fa que es reverteixi aquest estat profibrogènic ja que indueix l’expressió de MMP-3 però no afecta als nivells de TIMP-1. La síntesi de MEC i especialment la síntesi de COL1, COL3 i COL5 està incrementada en la fibrosi intestinal, aquest fet està directament relacionat amb l’activitat de TGF-β en la zona afectada. Els tocotrienols interfereixen en la síntesi de col•lagen. A més, els tocotrienols disminueixen la fosforilació d’Smad3 induïda per TGF-β, un fet clau en la síntesi de matriu extracel•lular. Aquests resultats permeten hipotetitzar un potencial antifibrogènic dels tocotrienols. Per a confirmar aquest potencial “in vivo” ens calia disposar d’un model experimental de fibrosi intestinal. A diferència del que succeeix amb la colitis, en la que es disposa d’un gran nombre de models animals, hi ha pocs models experimentals específicament dissenyats per a reproduir la fibrosi intestinal. Aquest fet, ha limitat molt el desenvolupament de noves estratègies de tractament antifibrogènic en l’intestí. Mitjançant l’administració intracolònica repetida a dosis baixes de l’haptè TNBS vam poder establir fibrosi intestinal en la rata de manera rellevant i reproduïble. En aquest model de fibrosi intestinal, els animals que van rebre la dosi més alta de tocotrienols provada en aquest estudi van mostrar nivells disminuïts en paràmetres que mesuren la inflamació, això és, es va disminuir l’índex d’activitat de la malaltia i la pèrdua de pes causada pel TNBS així com també va reduir l’expressió de TNF-α. / Excessive fibroblast expansion and extracellular matrix deposition are key events for the development of bowel stenosis in Crohn’s disease patients. Tocotrienols are vitamin E compounds with proven in vitro antifibrogenic effects on rat pancreatic fibroblasts. We aimed at investigating the effects of tocotrienols on human intestinal fibroblast proliferation, apoptosis, autophagy, and synthesis of ECM. Intestinal fibroblasts isolated from patients with Crohn’s disease were treated with tocotrienol-rich fraction from palm oil. Tocotrienols significantly reduced proliferation, enhanced cell death by promoting apoptosis and autophagy. Fibroblast apoptosis, but not autophagy, was prevented by the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk, whereas both types of cell death were prevented when the mitochondrial permeability transition pore was blocked by cyclosporin A, demonstrating a key role of the mitochondria in these processes. TRF diminished procollagen type I and laminin γ production these cells. Transforming growth factor-β plays a key role in matrix deposition during fibrosis. Treatment of intestinal fibroblasts with tocotrienol rich fraction prevents Smad3 phosporylation induced by transforming growth factor-β and reduces collagen type 1 and 3 production by these cells. Besides, in a rat model of intestinal fibrosis, treatment with tocotrienols reduces diarrhea, rectal bleeding and weight loss, as well as levels of colonic tumor necrosis factor-α and vimentin expression demonstrating that this compound has anti-inflammatory effects in vivo.