Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Pesticides are widely used in agriculture and public health for pest control and prevention. The indiscriminate use of these compounds can trigger environmental contamination by pesticides and increase the risk of human exposure. Human exposure to pesticides can occur directly, through occupational activity, or indirectly, through the environment and food. Chronic exposure to pesticides may result in neurological, reproductive, teratogenic and immunological disorders. Mancozeb, chlorothalonil and thiophanate methyl are fungicides widely used in the world. Despite their characteristics of low acute toxicity and low persistence in the environment, in vitro and in vivo studies demonstrate the cytotoxic effects of these compounds. However, the immunological effects that these pesticides can trigger are unexplored. Therefore, the objective of this study was to evaluate in vitro the pro-inflammatory and oxidative effects of mancozeb, chlorothalonil and thiophanate methyl pesticides. RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™) macrophages were exposed to different concentrations (0.1-100 μg/mL) of each pesticide for 72 hours, and maintained in 5% CO2 atmosphere at 37°C. The pesticides were dissolved in dimethylsulfoxide, which was used as negative control. Phytohemagglutinin was used as positive control for inflammatory activation. The evaluation of cell proliferation, oxidative metabolism and pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α and IFN-γ), anti-inflammatory cytokine (IL-10) and caspases (Casp1, Casp3, Casp8) levels were performed by fluorimetric and molecular tests. The results showed a significant pro-inflammatory effect of mancozeb, chlorothalonil and thiophanate methyl pesticides at respective concentrations of 1, 3 and 100 μg/mL, with increase in cell proliferation and pro-inflammatory cytokines and caspases levels. However, the oxidative effect was only observed in macrophages exposed to chlorothalonil at 3 μg/mL. Thus, in these analysis conditions, the studied pesticides acted by activation of the immune system. The results found contribute to better understanding of immunological effects caused by exposure to these pesticides. / Os pesticidas são amplamente utilizados na agricultura e na saúde pública para o controle e prevenção de pragas. O uso indiscriminado desses compostos pode desencadear a contaminação ambiental por agrotóxicos e aumentar o risco de exposição dos seres humanos. A exposição aos agrotóxicos pelos humanos pode ocorrer de forma direta, através de atividade ocupacional, ou de forma indireta, pelo ambiente e pela alimentação. A exposição crônica aos pesticidas pode resultar em distúrbios neurológicos, reprodutivos, teratogênicos e imunológicos. Os pesticidas mancozebe, clorotalonil e tiofanato metílico são fungicidas amplamente utilizados no mundo. Apesar de suas características de baixa toxicidade aguda e baixa persistência no ambiente, estudos in vitro e in vivo demonstram os efeitos citotóxicos desses compostos. Entretanto, os efeitos imunológicos que esses pesticidas podem desencadear são pouco explorados. Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o efeito pró-inflamatório e oxidativo dos pesticidas mancozebe, clorotalonil e tiofanato metílico. Os macrófagos RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™) foram expostos a diferentes concentrações (0,1 – 100 μg/mL) de cada pesticida por 72 horas, sendo mantidos em atmosfera com 5% CO2 a 37oC. Os pesticidas foram dissolvidos em dimetilsulfóxido, o qual foi utilizado como controle negativo. Como controle positivo para a ativação inflamatória, utilizou-se a fitohemaglutinina. A avaliação da proliferação celular, do metabolismo oxidativo e dos níveis das citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α e IFN-γ), da citocina anti-inflamatória (IL-10) e das caspases (Casp1, Casp3, Casp8) foi realizada por testes fluorimétricos e moleculares. Os resultados obtidos demonstraram efeito pró-inflamatório significativo dos pesticidas mancozebe, clorotalonil e tiofanato metílico nas respectivas concentrações de 1, 3 e 100 μg/mL, ocorrendo aumento da proliferação celular e dos níveis de citocinas pró-inflamatórias e caspases. Entretanto, o efeito oxidativo somente foi observado nos macrófagos expostos ao clorotalonil na concentração de 3 μg/mL. Assim, nessas condições de análise, os pesticidas estudados atuam ativando o sistema imune. Os resultados encontrados contribuem para a melhor compreensão dos efeitos imunológicos que a exposição a estes pesticidas pode desencadear.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Studies on the topical use of diclofenac in horses deal mostly with pharmacokinetics and the clinical effect of the medication, few studies addressed its tolerability or its oral use. The aim of this study was to obtain data related to pharmacokinetics and distribution of diclofenac sodium in synovial fluid after oral or topical administration in healthy ponies as well as to evaluate the tolerability of oral and topical diclofenac sodium administered on a frequency similar to a treatment period. Healthy ponies were divided into three groups and treated with topical (group I, n = 6) or oral (group II, n = 6) diclofenac at a dose of 2.5 mg kg-1 and oral phenylbutazone (group III, n = 3) at a dose of 2.2 mg kg-1. To evaluate the bioavailability blood samples were collected at different times, from 30 minutes to 144 hours and synovial fluid samples 6, 12 and 24 hours, after starting treatment. Blood samples collected 24 hours before and until 144 hours after starting treatment were used for CBC, WBC, biochemical and coagulation profiles. A significant difference was found between group I and group II on prothrombin time, activated partial thromboplastin time, fibrinogen, hematocrit, hemoglobin, erythrocytes, total leukocytes, neutrophils, band cells, lymphocytes, eosinophils, and alkaline phosphatase. Similar results were found between group II and group III, however, the activated partial thromboplastin time did not differ. Even though the plasma concentration of diclofenac sodium was higher in group II than in group I, the synovial concentration tended to be higher in group I. The diclofenac bioavailability and tolerability data obtained in ponies showed that the topic administration delivered therapeutic concentrations of diclofenac and proved to be safer, as the oral administration resulted in blood changes. / Os estudos sobre a utilização tópica do diclofenaco conduzidos na espécie equina abordam em sua maioria a farmacocinética e o efeito clínico desta medicação. A tolerabilidade frente ao diclofenaco e a utilização deste medicamento por via oral têm sido pouco estudadas. Nossos objetivos foram obter dados relacionados à farmacocinética sanguínea e distribuição do diclofenaco de sódio no líquido sinovial, após a administração oral e tópica em pôneis sadios, bem como avaliar a tolerabilidade do diclofenaco de sódio administrado por via oral e tópica, usando uma frequência de administração semelhante a um período de tratamento. Pôneis clinicamente sadios foram divididos em três grupos e tratados com diclofenaco por via tópica (grupo I, n=6) e oral (grupo II, n=6), na dose de 2,5 mg kg-1 e fenilbutazona oral (grupo III, n=3) na dose de 2,2 mg kg-1. Para avaliar a biodisponibilidade foram coletadas amostras de sangue em diferentes momentos, desde 30 minutos até 144 horas após início do tratamento e amostras de líquido sinovial as 6, 12 e 24 horas, após o início do tratamento. Amostras de sangue foram coletadas a cada 24 horas até 144 horas após início do tratamento para hemograma, leucograma, bioquímico e coagulograma. Diferenças significativas foram encontradas entre o grupo I e o grupo II em determinados tempos no tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativado, fibrinogênio, hematócrito, hemoglobina, hemácias, leucócitos totais, segmentados, bastonetes, linfócitos, eosinófilos e fosfatase alcalina. Resultados semelhantes foram observados entre o grupo II e o grupo III, no entanto o tempo de tromboplastina parcial ativado não apresentou diferença. Embora a concentração plasmática do diclofenaco de sódio no grupo II tenha sido mais elevada que no grupo I, a concentração sinovial foi maior no grupo I. Os dados obtidos sobre a biodisponibilidade e tolerabilidade do diclofenaco em pôneis mostram que a aplicação tópica é superior à oral por resultar em concentrações sinoviais mais elevadas do fármaco, além de ser mais segura, pois não alterou significativamente os parâmetros avaliados.

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.