Einleitung: Humanisierte Mausmodelle werden in der humanmedizinischen Forschung bereits vielseitig eingesetzt und haben zu zahlreichen wissenschaftlichen Erkenntnissen im Zusammenhang mit zum Beispiel humanen Vorläuferzellen oder in Bezug auf humane Infektionskrankheiten beigetragen. Orientierung für die vorliegende Arbeit bot eine der zahlreichen Methoden zur Humanisierung von Mäusen, bei der immundefizienten Mäusen hämatopoetische Vorläuferzellen transplantiert werden. Ziele der Untersuchungen: Das etablierte Modell der humanisierten Maus sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf die Spezies Rind übertragen werden, um sogenannte bovinisierte Mäuse zu entwickeln und somit die Grundlage für ein vielversprechendes Modell des Immunsystems des Rindes zu schaffen. Es sollten zweckmäßige Transplantationsmethoden etabliert werden, die zu einer nachweisbaren Bovinisierung immundefizienter Mäuse führen. Tiere, Material und Methoden: Aus bovinem Nabelschnurblut (NSB) und bovinem peripheren Blut (pB) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation die jeweiligen mononukleären Zellen gewonnen (bCBMC (bovine cord blood mononuclear cells) aus NSB; bPBMC (bovine peripheral blood mononuclear cells) aus pB). Hierfür wurde methodisch die Durchführung unter Anwendung eines Mediums mit einer Dichte von 1,077 g/ml etabliert. Zur Isolierung boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen aus den genannten Zellfraktionen kamen verschiedene magnetische Separationsmethoden zum Einsatz. Mittels positiver Separation wurden aus den bCBMC zum einen CD34-positive (CD34+) und zum anderen c-kit-positive (c-kit+) Zellen isoliert, welche jeweils neugeborenen NSG™ Mäusen (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl) transplantiert wurden (Versuchsgruppe A: CD34+: n = 1 und c-kit+: n = 4). Darüber hinaus wurden mittels negativer Separation die T-Lymphozyten aus den bCBMC und bPBMC depletiert um die Stammzell-enthaltenden Fraktionen (SeF) zu gewinnen. Zur Depletion boviner T-Lymphozyten kamen zeitgleich drei Antikörper gegen bovine Oberflächenmarker dieses Zelltyps zum Einsatz: WC1, CD4 und CD8. Die isolierten SeF wurden in der Versuchsgruppe B ebenfalls NSG™ Mäusen transplantiert, jedoch, im Unterschied zur Versuchsgruppe A, neugeboren und auch adult (Versuchsgruppe B: neugeb. NSB: n = 10; neugeb. pB: n = 7; adult NSB: n = 2). Beide Versuchsgruppen bestanden aus mehreren unterschiedlich großen Untergruppen, welches auf die Größe der jeweils selektierten Zellpopulationen zurückzuführen war. Transplantationsverlauf und -erfolg innerhalb der Versuchsgruppen wurden mittels klinischem Scoring und Gewichtsbestimmung, wiederholter Blutbildanalyse sowie mittels durchflusszytometrischer Analysen des Blutes im laufenden Versuch und Analysen von Blut und Organsuspensionen aus Milz und Knochenmark zum Zeitpunkt des Versuchsendes untersucht. Für die durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes der Mäuse kamen verschiedene bovine Antikörper zum Einsatz, wobei dem Pan-Leukozytenmarker anti-CD45 die größte Bedeutung zukam. Durch den Einsatz muriner und boviner anti-CD45-Antikörper gelang die Unterscheidung zwischen originären murinen Leukozyten und den nach der Transplantation im Organismus der Maus sich etablierten bovinen Leukozyten. Statistische Analysen zwischen den Untergruppen waren aufgrund der unterschiedlichen Gruppengrößen nur eingeschränkt möglich. Es wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung untersucht. Je nach Anzahl der zu vergleichenden Grundgesamtheiten wurden die Daten anschließend entweder mittels t-Test für unabhängige Stichproben beziehungsweise mittels Mann-Whitney-U-Test (n = 2) oder mittels nicht parametrischer, einfaktorieller Varianzanalyse (Kruskal-Wallis-Test, wenn n ≥ 3) ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p = 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Bei den Tieren der Untergruppe neugeb. pB der Versuchsgruppe B wurden nach der Transplantation während des Versuchszeitraumes von 18 Wochen keine klinischen Auffälligkeiten festgestellt. Das gleiche galt für die Tiere beider Untergruppen der Versuchsgruppe A. Aus den anderen beiden Untergruppen der Versuchsgruppe B, neugeb. NSB und adult NSB, mussten hingegen aufgrund des eingetretenen starken Gewichtsverlustes und der Verschlechterung des klinischen Zustandes Tiere vorzeitig getötet werden. In der Untergruppe neugeb. NSB der Versuchsgruppe B handelte es sich um 3 von 10 Tieren (30 %), in der Untergruppe adult NSB um 1 von 2 Tieren (50 %). In allen Versuchsgruppen konnten im Laufe des Experimentes im peripheren Blut der Mäuse durchflusszytometrisch bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen werden. Im Falle der Versuchsgruppe A wurden während des gesamten Versuches im peripheren Blut der Tiere der Untergruppe c-kit+ im Mittel höhere Anteile boviner CD45-positiver Zellen an der Gesamtleukozytenzahl nachgewiesen als im Blut der Tiere der Untergruppe CD34+ (c-kit+: 11,5 %; CD34+: 0,733 %). Im Vergleich zu den genannten Ergebnissen der Versuchsgruppe A wurde bei den neugeboren transplantierten Tieren der Versuchsgruppe B durchschnittlich eine größere Zahl boviner CD45-positiver Zellen im peripheren Blut nachgewiesen (neugeb. NSB: 13,5 % und neugeb. pB: 16,0 %). Es konnte kein signifikanter Unterschied zur Untergruppe c-kit+ der Versuchsgruppe A festgestellt werden (Kruskal-Wallis-Test). Im peripheren Blut der adult transplantierten Mäuse der Versuchsgruppe B wurden während des Versuchszeitraumes im Mittel 2,89 % bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, ein Modell bovinisierter Mäuse zu entwickeln. Unter Berücksichtigung der klinischen Parameter erwies sich die Transplantation von T-Zell-depletierten mononukleären Zellen aus bovinem peripherem Blut in neugeborene NSG™ Mäuse als am vielversprechendsten, auch wenn aufgrund der begrenzten Tierzahlen statistische Analysen nur eingeschränkt auswertbar waren. Daran anknüpfend können die dargelegten Untersuchungen fortgesetzt und bovinisierte Mausmodelle ausgewählter Infektionserreger des Rindes etabliert werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden eine Grundlage, um weitere Anwendungen zur Immunologie in der Rindermedizin zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Immunsystem 2.2 Besonderheiten des bovinen Immunsystems 2.3 Humanisierte Mausmodelle 2.3.1 Humanes Nabelschnurblut 2.3.2 Marker humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.4 Bovine Mausmodelle 2.4.1 Transplantation boviner Leukozyten 2.4.2 Transplantation bovinen Gewebes 2.4.3 Infektionsversuche mit bovinen Infektionserregern 2.5 Bovines Nabelschnurblut 2.6 Marker boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.7 Ziele der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Verbrauchsmaterialien 3.2 Laborgeräte 3.3 Software 3.4 Gewinnung bovinen Materials 3.4.1 Gewinnung von Nabelschnurblut 3.4.2 Gewinnung von peripherem Blut 3.5 Aufarbeiten des bovinen Materials 3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation 3.5.2 Stammzellisolierung 3.5.2.1 Positive Separation 3.5.2.2 T-Zell-Depletion 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Versuchstiere 3.6.2 Präkonditionierung durch Bestrahlung 3.6.3 Markierung der Tiere 3.6.4 Transplantation und Versuchsgruppen 3.6.5 Scoring 3.6.6 Blutentnahme 3.6.7 Finale Präparation 3.7 Erfassung des Blutbildes 3.8 Durchflusszytometrische Analysen 3.8.1 Erfassung und Auswertung der Daten 3.8.2 Verwendete Antikörper 3.8.3 In vivo-Analysen 4 Ergebnisse 4.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 4.1.1 Dichtegradientenzentrifugation 4.2 Stammzellisolierung 4.2.1 Positive Separation 4.2.2 T-Zell-Depletion 4.3 Transplantationsverlauf 4.3.1 Versuchsgruppe A - CD34+/ c-kit+ 4.3.1.1 Scoring 4.3.1.2 Blutbild 4.3.1.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.2 Versuchsgruppe B - T-Zell-Depletion 4.3.2.1 Scoring 4.3.2.2 Blutbild 4.3.2.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.3 Zusammenfassung des Transplantationsverlaufes 5 Diskussion 5.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 5.2 Stammzellisolierung 5.2.1 Positive Separation 5.2.2 T-Zell-Depletion 5.3 Transplantationsverlauf 5.3.1 Versuchsgruppe A – CD34+/ c-kit+ 5.3.2 Versuchsgruppe B – T-Zell-Depletion 5.4 Bewertung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis A Anhang A.0.1 Tätowierschema A.0.2 Mittels T-Zell-Depletion isolierte Zellfraktionen A.0.3 Versuchsgruppe A - Blutbild A.0.4 Versuchsgruppe B - Blutbild Danksagung

Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Todesursache weltweit. Für die Therapie des ischämischen Schlaganfalls steht derzeit nur eine bewährte Methode zur Verfügung, die Rekanalisation durch Thrombektomie oder Fibrinolyse mit recombinant tissue plasminogen activator. Doch ein enges therapeutisches Zeitfenster und Kontraindikationen führen dazu, dass weniger als 10 % der Patienten davon profitieren können. Die Suche nach alternativen Therapiestrategien ist zwingend erforderlich. Eine vielversprechende Alternative ist Neuroprotektion durch Hypothermie, die sich gut mit Rekanalisationsverfahren kombinieren ließe. Für die Erforschung neuer Therapiestrategien sind präklinische Studien nötig. Da sich Nagetiermodelle nur bedingt für die Erforschung neurointerventioneller Therapien eignen, ist hier der Einsatz von Großtieren unerlässlich. Schafe eignen sich aufgrund einiger Vorteile für Schlaganfallmodelle. Bei Rekanalisationsstudien ist es notwendig, den temporären Verschluss eines Gehirngefäßes nachweisen zu können. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Darstellung der Vor- und Nachteile und des Einsatzes von Großtieren in der neurointerventionellen Forschung. Weitere Ziele dieser Arbeit waren die Evaluierung eines Schaf-Schlaganfallmodells und die Testung eines geeigneten Verfahrens zur zuverlässigen Darstellung eines temporären Gefäßverschlusses (Etablierungsstudie). Darüber hinaus sollte die Testung eines Kühlkathetersystems für eine Kombination von Rekanalisation und Hypothermie erfolgen (Sicherheits- und Machbarkeitsstudie). Material und Methoden: Für den Überblick über den Einsatz von Großtieren in der neurointerventionellen Forschung wurde ein systematisches Review angefertigt. Durch die Suche in zwei Datenbanken wurden 5250 Publikationen identifiziert und anhand der Abstracts deren Inhalt überprüft. 540 Arbeiten wurden einer Volltextauswertung unterzogen und 334 Paper letztendlich eingeschlossen. In der Etablierungsstudie zur Evaluierung eines Schlaganfallmodells wurde bei zehn Schafen ein Schlaganfall induziert. Danach wurden eine digitale Subtraktionsangiographie (DAS), eine Magnetresonanztomografie (MRT), eine Magnetresonanzangiographie (MRA), sowie eine Computertomographie (CT) einschließlich -perfusion und -angiographie durchgeführt. In der darauffolgenden Sicherheits- und Machbarkeitsstudie wurde bei 20 Schafen ein Schlaganfall induziert. Primäre Endpunkte waren die Sicherheit und Machbarkeit des neuen Kühlkatheters. Als sekundärer Endpunkt wurde unter anderem die Beurteilung der neurologischen Funktion gewählt. Ergebnisse: Das Review zeigt den vielfältigen Einsatz von Großtiermodellen und deren klinische Relevanz. Das Review zeigt auch auf, dass bei Studien mit Großtieren noch die Notwendigkeit für Verbesserungen besteht, allen voran Randomisierung und Verblindung. In der Etablierungsstudie konnte die DSA den Gefäßverschluss nicht zuverlässig nachweisen. Die CT-Perfusion hingegen war gut geeignet, um den Gefäßverschluss über die Hirnminderperfusion zu belegen. Die Time-of-Flight-MRA hat sich zur Darstellung eines permanenten Gefäßverschlusses als zuverlässig erwiesen. Die diffusionsgewichtete Bildgebung im MRT ist geeignet, die endgültige Infarktgröße zu bestimmen. Die Sicherheit und Machbarkeit des Kühlkatheters konnte nachgewiesen werden, da keine Gefäßschäden durch histologische Untersuchungen zu finden waren und eine ausreichend schnelle und tiefe Kühlung des Gehirns erreicht werden konnte. Die klinisch-neurologische Bewertung der Tiere ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Schlussfolgerungen: Insgesamt lässt sich der Schluss ziehen, dass die Erforschung von therapeutischen Alternativen für den Schlaganfall enorm wichtig und der Einsatz von Großtieren unerlässlich ist. Das Schaf eignet sich gut für diesen Einsatz. Der getestete Kühlkatheter ist komplikationsfrei und ohne medizinische Sicherheitsbedenken einsetzbar. Die Wirksamkeit sollte nun in einer verblindeten, randomisierten Studie mit ausreichender Gruppengröße getestet werden:Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Schlaganfall 3 2.1.1 Pathophysiologische Mechanismen 4 2.1.1.1 Exzitotoxizität 4 2.1.1.2 Peri-Infarkt Depolarisationen 6 2.1.1.3 Entzündung 7 2.1.1.4 Apoptose 8 2.1.2 Therapeutische Angriffspunkte 8 2.1.2.1 Rekanalisation 8 2.1.2.2 Neuroprotektion 10 2.2 Hypothermie 11 2.2.1 Anwendung der Hypothermie 11 2.2.1.1 Globale Hypothermie 12 2.2.1.2 Selektive Hypothermie 12 2.2.1.3 Kühlkathetersystem 13 2.2.2 Wirkung beim Schlaganfall 14 2.3 Tiermodelle 15 2.3.1 Schafmodell 16 2.3.1.1 Blutversorgung des ovinen Gehirns 17 2.4 Fragestellung 18 3 Kumulativer Teil der Dissertation 20 3.1 Large animals in neurointerventional research: a systematic review on models, techniques and their application in endovascular procedures for stroke, aneurysms and vascular malformations 20 3.2 Darstellung der Eigenleistung 41 3.3 Development of a routinely applicable imaging protocol for fast and precise middle cerebral artery occlusion assessment and perfusion deficit measure in an ovine stroke model: a case study 42 3.4 Darstellung der Eigenleistung 54 3.5 Ausblick: Selective intracarotid blood cooling in acute ischemic stroke: a safety and feasibility trial of hypothermia vs. normothermia in an ovine stroke model 54 3.5.1 Überblick zur Methodik 54 3.5.2 Ausgewählte Ergebnisse 55 3.5.3 Darstellung der Eigenleistung 58 4 Diskussion 59 4.1 Hintergrund der Arbeit 59 4.2 Übersicht zu existierenden Großtiermodellen des ischämischen Schlaganfalls und deren Anwendung 60 4.3 Etablierung eines Tiermodells zur temporären MCAO mit Akutbildgebung 63 4.4 Machbarkeits- und Sicherheitsstudie zum Einsatz des endovaskulären Kühlkathetersystems 65 4.5 Fazit 68 5 Zusammenfassung 70 6 Summary 72 7 References 74 8 Anhang 97 8.1 Search Strategy in Medline (Wolters Kluwer, Ovid) 97 8.2 Search Strategy Web of Science Core Collection 107 8.3 Supplementary Figure 1: DSA carotid siphon 112 8.4 Abbildungsverzeichnis 113 9 Danksagung 114

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Die orale Mukositis ist eine der häufigsten und schwerwiegendsten frühen Nebenwirkungen nach einer Ganzkörperbestrahlung im Rahmen der Therapie hämatologischer Tumoren sowie nach einer Strahlenexposition im Kopf-Hals-Bereich. Es existieren zahlreiche experimentelle und klinische Ansätze zur Prophylaxe und Therapie dieser Strahlenfolge, aus denen jedoch bisher kein allgemein anwendbares Behandlungsschema ableitbar ist. Für Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) werden in präklinischen und klinischen Untersuchungen mukoprotektive Effekte nachgewiesen. Er ist als rekombinante humane Form (∆23-rHuKGF) mit der Wirkstoffbezeichnung Palifermin unter dem Markennamen Kepivance® für die Anwendung beim Menschen zur Prophylaxe der oralen Mukositis im Rahmen der Konditionierungsbehandlung bei Knochenmarktransplantationen zugelassen. Die Applikation von Palifermin erfolgt dabei intravenös in einer Dosierung von 60 g/kg an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Konditionierungstherapie. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob eine Reduktion der Anzahl der Palifermin-Applikationen vor und/oder nach der Konditionierungstherapie möglich ist. Zusätzlich sollen histologische Untersuchungen Hinweise zum Mechanismus der Paliferminwirkung geben. Die Untersuchungen erfolgen am etablierten Modell des Epithels der Zungenunterseite von C3H/Neu-Mäusen. Eine Einzeitbestrahlung der Zunge simuliert die Konditionierungsbehandlung. Gestaffelte Strahlendosen werden zur Auslösung einer Ulzeration verwendet, um komplette Dosis-Effekt-Kurven zu generieren. Primärer Endpunkt ist die Induktion einer ulzerativen Mukositis in Abhängigkeit von der Strahlendosis. Latenzzeit und Ulkusdauer beschreiben den zeitlichen Verlauf der Veränderungen. Die beim Menschen zugelassene Anwendung von Palifermin wird auf das Mausmodell übertragen (Standardanwendung), wobei Palifermin in einer Dosierung von 5 mg/kg an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Tag -3,-2,-1,+1,+2,+3) subkutan appliziert wird. Die Palifermin-Applikation wird vor der Bestrahlung auf zwei Gaben (Tag -3,-2,+1,+2+3, Tag -2,-1,+1,+2,+3) bzw. eine Gabe (Tag -3,+1,+2,+3, Tag -2,+1,+2,+3, Tag -1,+1,+2,+3) oder nach der Bestrahlung auf zwei (Tag – 3,-2,-1,+1,+2, Tag -3,-2,-1,+2,+3) bzw. eine Applikation (Tag -3,-2,-1,+1, Tag -3,-2,-1,+2, Tag -3,-2,-1,+3) reduziert. Die Palifermin-Dosierung beträgt bei mehr als einer Applikation 5 mg/kg s.c. täglich, bei einer einmaligen Anwendung 15 mg/kg s.c.. Histologische Untersuchungen der Mukosa erfolgen bei Standardanwendung von Palifermin sowie bei Applikation nur an drei Tagen vor oder nach der Einzeitbestrahlung. Nach alleiniger Einzeitbestrahlung treten ulzerative Läsionen mit einer ED50 von 11,0  1,3 Gy (Dosis, bei der bei 50 % der Tiere eine ulzerative Läsion im Zungenepithel erwartet wird) nach durchschnittlich 10,0  0,7 Tagen (Latenzzeit) für 3,4  1,0 Tage (Ulkusdauer) auf. Erhalten die Mäuse Palifermin im Standardprotokoll, so ist die Strahlentoleranz des Zungenepithels im Vergleich zur alleinigen Bestrahlung erhöht (ED50=21,9  2,2 Gy, DMF=2,0). Eine signifikant stärkere Wirkung wird erzielt, wenn Palifermin nach der Einzeitbestrahlung nur ein- oder zweimal appliziert (ED50=31,5  5,1 Gy und 28,9  3,8 Gy) oder wenn vor und nach der Einzeitbestrahlung der Wirkstoff nur einmal verabreicht wird (ED50=31,1  3,8 Gy). Die ulzerativen Reaktionen treten dabei später auf und sind von kürzerer Dauer, insbesondere wenn die Palifermin-Gabe unmittelbar nach der Einzeitbestrahlung erfolgt. Die Reduktion der Palifermin-Anwendung vor der Einzeitbestrahlung auf eine oder zwei Applikationen ist in ihrer Wirkung mit der Standardanwendung vergleichbar. Nach einer alleinigen Einzeitbestrahlung mit 13 Gy verringern sich Zellzahl (Minimalwert Tag 6 - 8, 73-74 %) und Dicke (Minimalwert Tag 4, 72 %) des Epithels, das Zellvolumen nimmt zu (Maximalwert Tag 8, 239 %). Palifermin erhöht nach dreitägiger Applikation vor der Bestrahlung die Zellzahl (184 %), die Epitheldicke (215 %) und vergrößert das Zellvolumen (152 %). Wird Palifermin zusätzlich an drei Tagen nach der Bestrahlung appliziert (Standardanwendung), erfolgt die Abnahme der epithelialen Zelldichte verzögert (Minimalwert Tag 7, 36 %). Die Epitheldicke nimmt bis Tag 3 weiter zu (286 %). Die vorliegenden Untersuchungen am Modell der Zungenseite der Maus zeigen, dass die mukoprotektive Wirkung von Palifermin im Vergleich zu klinisch üblichen Standardanwendung erhöht werden kann, wenn der Wirkstoff vor und nach der Bestrahlung nur einmal gegeben wird oder die Applikationen nach der Bestrahlung reduziert werden.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 5 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen 5 2.2 Strahlentherapie in der Humanmedizin 5 2.3 Einzeitbestrahlung/kurzfristige Bestrahlung in der Human- medizin 6 2.3.1 Ganzkörperbestrahlung 6 2.3.2 Stereotaktische Strahlentherapie (Radiochirurgie) 7 2.3.3 Intraoperative Strahlentherapie 8 2.3.4 Brachytherapie 8 2.4 Strahlentherapie bei Hunden und Katzen 8 2.5 Akutes Strahlensyndrom nach Strahlenunfällen (Akzidentielle Strahlenexposition) 15 2.6 Nebenwirkungen einer Strahlentherapie bzw. -exposition 17 2.6.1 Frühe Strahlenfolgen 18 2.6.2 Späte Strahlenfolgen 18 2.6.3 Konsekutive Strahlenfolgen 18 2.7 Aufbau und proliferative Organisation der Mundschleimhaut 19 2.7.1 Anatomischer Aufbau der Mäusezunge 19 2.7.2 Histologischer Aufbau des Epithels der Zungenunterseite der Maus 19 2.7.3 Proliferationskinetik des Epithels der Zungenunterseite der Maus 20 2.7.4 Besonderheiten der Mundschleimhaut des Menschen 21 .2.8 Strahlenreaktion des Epithels der Mundschleimhaut 22 2.8.1 Pathogenese der radiogenen oralen Mukositis 22 2.8.2 Bedeutung der radiogenen oralen Mukositis 22 2.8.3 Klassifizierung der radiogenen oralen Mukositis 23 2.8.4 Prophylaxe und Therapie der oralen Mukositis 25 2.8.4.1 Allgemeine Maßnahmen 26 2.8.4.2 Zahnsanierung 26 2.8.4.3 Mundspülungen 27 2.8.4.4 Kälteapplikation 27 2.8.4.5 Stimulation von Proliferationsvorgängen 28 2.8.4.6 Reduktion freier Sauerstoffradikale 28 2.9 Tiermodelle zur Untersuchung der radiogenen oralen Mukositis 29 2.9.1 Maus 29 2.9.2 Ratte 30 2.9.3 Hamster 30 2.10 Einflussfaktoren der Strahlenempfindlichkeit 30 2.10.1 Intrinsische Radiosensibilität 31 2.10.2 Recovery (Erholung) 32 2.10.3 Repopulierung 33 2.10.4 Redistribution 33 2.10.5 Reoxygenierung 34 2.10.6 Volumeneffekt 34 2.11 Palifermin 35 2.11.1 Einfluss von Palifermin auf unbehandeltes Epithel 35 2.11.2 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei Einzeitbestrahlung 36 2.11.2.1 In vitro Untersuchungen 36 2.11.2.2 In vivo Untersuchungen 37 2.11.3 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei fraktionierter Bestrahlung 38 2.11.4 Einfluss von Palifermin auf das Zungenepithel bei Radiochemotherapie 38 2.11.5 Klinische Studien zur Wirkung von Palifermin 39 2.11.5.1 Gesunde Probanden 39 2.11.5.2 Palifermin in der Therapie hämatologischer Tumoren 39 2.11.5.3 Palifermin in der Therapie kolorektaler Karzinome 41 2.11.5.4 Palifermin in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren 41 2.11.6 Nebenwirkungen einer Palifermin-Behandlung 42 3 Material und Methoden 43 3.1 Versuchstiere 43 3.2 Lokale Bestrahlung der Zungenunterseite 43 3.2.1 Bestrahlungsanlage 43 3.2.2 Dosimetrie 44 3.2.3 Versuchsdurchführung 44 3.3 Palifermin 45 3.4 Beschreibung der durchgeführten Versuche 46 3.4.1 Alleinige Einzeitbestrahlung (Versuch K) 47 3.4.2 Einzeitbestrahlung und Palifermin-Applikation (Versuchsreihe P) 47 3.4.2.1 Palifermin-Applikation an drei aufeinander folgenden Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Stanardan- wendung,Versuch P1) 47 3.4.2.2 Modifikation der Palifermin-Applikation vor der Einzeit- bestrahlung (Versuche P 2.x, P 3.x) 47 3.4.2.3 Modifikation der Palifermin-Applikation nach der Einzeit- bestrahlung (Versuche P 4.x, P 5.x) 47 3.4.2.4 Palifermin-Applikation an einem Tag vor und nach der Einzeitbestrahlung (Versuch P 6) 48 3.5 Klinische Beurteilung der Strahlenreaktion 48 3.6 Statistische Auswertung 48 3.6.1 Dosis-Effekt-Beziehungen 49 3.6.2 Zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 49 3.7 Histologische Untersuchungen 49 3.7.1 Versuchsprotokoll 49 3.7.2 Präparation der Zunge und Herstellung histologischer Schnitte 50 3.8 Histologische Auswertung 51 4 Ergebnisse 53 4.1 Strahlenreaktion des Epithels der Zungenunterseite 53 4.1.1 Klinische Veränderungen und zeitlicher Verlauf der Strahlenreaktion 53 4.1.2 Dosisabhängigkeit der Strahlenreaktion 55 4.1.3 Sonstige Effekte der Einzeitbestrahlung 55 4.2 Einfluss von Palifermin auf die Strahlenreaktion des Zungenepithels nach Einzeitbestrahlung 56 4.2.1 Palifermin-Applikation an drei Tagen unmittelbar vor und nach der Einzeitbestrahlung (Standardanwendung, Versuch P1) 57 4.2.1.1 Dosis-Effekt-Beziehung 57 4.2.1.2 Zeitlicher Verlauf 58 4.2.2 Reduktion der Palifermin-Gabe vor der Einzeitbestrahlung auf zwei Applikationen (Versuch 2.1, P 2.2) 58 4.2.2.1 Dosis-Effekt-Beziehung 58 4.2.2.2 Zeitlicher Verlauf 59 4.2.3 Reduktion der Palifermin-Gabe vor der Einzeitbestrahlung auf eine einmalige Applikation (P 3.1, P 3.2, P 3.3) 60 4.2.3.1 Dosis-Effekt-Beziehung 60 4.2.3.2 Zeitlicher Verlauf 61 4.2.4 Reduktion der Palifermin-Gabe nach der Einzeitbestrahlung auf zwei Applikationen (Versuch P 4.1, P 4.2) 61 4.2.4.1 Dosis-Effekt-Beziehung 61 4.2.4.2 Zeitlicher Verlauf 61 4.2.5 Reduktion der Palifermin-Gabe nach der Einzeitbestrahlung auf eine einmalige Applikation (Versuch P 5.1, P 5.2, P 5.3) 62 4.2.5.1 Dosis-Effekt-Beziehung 62 4.2.5.2 Zeitlicher Verlauf 63 4.2.6 Einmalige Palifermin-Applikation vor und nach der Einzeitbestrahlung (Versuch P 6) 64 4.2.6.1 Dosis-Effekt-Beziehung 64 4.2.6.2 Zeitlicher Verlauf 65 4.2.7 Zusammenfassung der Untersuchungen zur Ulkus- induktion 65 4.3 Histologische Untersuchungen 65 4.3.1 Histologie des unbehandelten Epithels 65 4.3.2 Qualitative histologische Veränderungen im Epithel durch die Behandlung 66 4.3.2.1 Alleinige Einzeitbestrahlung 66 4.3.2.2 Palifermin-Applikation 67 4.3.3 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach alleiniger Einzeitbestrahlung 68 4.3.3.1 Zellzahl 68 4.3.3.2 Epitheldicke 69 4.3.3.3 Zellvolumen 70 4.3.4 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen vor und nach der Einzeitbestrahlung (Standard-anwendung) 71 4.3.4.1 Zellzahl 71 4.3.4.2. Epitheldicke 72 4.3.4.3 Zellvolumen 74 4.3.5 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen vor der Einzeit- bestrahlung 75 4.3.5.1 Zellzahl 75 4.3.5.2. Epitheldicke 76 4.3.5.3 Zellvolumen 77 4.3.6 Quantitative Analyse histologischer Veränderungen nach Palifermin-Applikation an drei Tagen nach der Einzeit- bestrahlung 78 4.3.6.1 Zellzahl 78 4.3.6.2. Epitheldicke 80 4.3.6.3 Zellvolumen 82 4.3.7 Zusammenfassung der Untersuchungen zu histologischen Veränderungen des Zungenepithels nach Einzeitbe- strahlung und Palifermin-Applikation 83 5 Diskussion 85 5.1 Radiogene orale Mukositis und Keratinozyten- Wachstumsfaktor 85 5.2 Zungenepithel der Maus als Tiermodell 86 5.3 Strahlenreaktion des Epithels der Zungenunterseite nach Einzeitbestrahlung 87 5.4 Einfluss von Palifermin auf die Strahlenreaktion der Mundschleimhaut 87 5.5 Histologische Untersuchungen 88 5.5.1 Zellzahl 89 5.5.2 Epitheldicke 91 5.6 Wirkmechanismen von Palifermin 91 5.7 Einfluss von Palifermin auf das Tumorwachstum 92 5.8 Ausblick 94 6 Zusammenfassung 95 7 Summary 97 8 Literaturverzeichnis 99 9 Anhang 125 9.1 SPF-Bedingungen im Tierstall des Experimentellen Zentrums 125 9.2 Reagenzien zur HE-Färbung 125 9.3 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen 126 Danksagung 132

Hund, bakterieller/ zytologischer Konjunktivalstatus, Konjunktivitis, Klinikaufenthalt

Einleitung: Gesundheit, Leistung und Fruchtbarkeit der Sauen sind in der Ferkelerzeugung wichtige Grundlagen, um wettbewerbsfähig zu bleiben. Der antioxidative Status ist ein wichtiges Instrument, um die erhöhten Ansprüche und metabolischen Stresssituationen, die während des peripartalen Zeitraums existieren, zu reflektieren. Im Vergleich zu anderen Tierarten fehlen solche Untersuchungen beim Schwein im peripartalen Zeitraum. Zielstellung: Erhebung verschiedener Parameter des antioxidativen Status bei gesunden Sauen in Abhängigkeit von Trächtigkeit, Laktation, Alter und Jahreszeit Material und Methoden: Es wurden Blutproben von insgesamt 60 gesunden Sauen einer Thüringer Herde Deutsche Landrasse x Deutsches Edelschwein entnommen. Je Jahresquartal begann die Entnahme im Mai, August, Oktober 2005 und Januar 2006 bei jeweils 5 Jungsauen (1. Wurf) und 10 Altsauen (ab 2. Wurf). Die Probenentnahmen erfolgte 3 bis 2 Tage ante inseminationem (3-2 d a.i.), 4 Wochen post inseminationem (4 Wo p.i.), 14 Wochen post inseminationem (14 Wo p.i), 1 Tag post partum (1 d p.p.), 7 Tage post partum (7 d p.p.) sowie 14 Tage post partum (14 d p.p.). Es wurden folgende Parameter untersucht: Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GPX), Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), Antioxidant capacity of water soluble substances (ACW), Antioxidant capacity of lipid soluble substances (ACL), Vitamin A, Vitamin E, Selen. Des Weiteren wurden Futtermittelproben und eine Wasserprobe aus dem betriebseigenen Brunnen analysiert. Ergebnisse: Die SOD zeigte ante partum mit Aktivitäten von 1188 (1. Quartil: 999; 3. Quartl: 1386) U/g Hb bis 1223 (1065; 1407) U/g Hb einen annähernd konstanten Verlauf, während 7 und 14 d p.p. signifikant niedrigere Aktivitäten mit 1082 (923; 1238) U/g Hb bis 1134 (954; 1305) U/g Hb gemessen werden konnten. Die GPX-Aktivitäten wiesen eine kontinuierliche, signifikante Steigerung von 161 (126; 204) U/g Hb bis 221 (157; 270) U/g Hb von der ersten bis sechsten Entnahme auf. Von der 4. Wo p.i. mit 289 (230; 354) µmol/l konnte ein nicht signifikanter Konzentrationsabfall der TEAC bis zur 14. Wo p.i. mit 271 (232; 342) µmol/l ermittelt werden. 1 d p.p. erfolgte eine nicht signifikante Steigerung der TEAC-Konzentration auf 281 (221; 318) µmol/l, welche bis 14 d p.p. mit 304 (229; 344) µmol/l erhalten blieb. Bei 49 % der untersuchten Proben lagen die ACW-Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze. Die Konzentrationen der ACL wiesen zum Partus einen signifikanten Abfall von 8,80 (6,35; 10,20) µmol/l bei der 3. Entnahme auf 5,98 (4,96; 7,54) µmol/l am 1. d p.p. sowie einen kontinuierlichen Anstieg über das Ausgangsniveau bis 14 d p.p. mit 9,08 (6,58; 11,57) µmol/l auf. Die Konzentrationen der Vitamine A und E sanken signifikant zum Zeitpunkt der Geburt. Die Vitamin A-Konzentrationen wurden am 3.-2. d a.i. mit 0,35 (0,31; 0,42) µg/ml ermittelt und sanken 1 d p.p. signifikant auf 0,29 (0,26; 0,35) µg/ml. Ebenso verhielten sich die Vitamin E-Konzentrationen mit 2,98 (2,58; 3,73) µg/ml und 2,57 (2,32; 2,91) µg/ml zur ersten und vierten Entnahme. Während der ersten 3 Entnahmen stieg die Selenkonzentration von 1,91 (1,51; 2,43) µmol/l auf 2,18 (1,83; 2,43) µmol/l und sank am 1. d p.p. auf 2,08 (1,76; 2,28) µmol/l. Bis zur 6. Entnahme wurde die signifikant höchste Selenkonzentration von 2,47 (2,14; 2,71) µmol/l erreicht. Zum Teil signifikante Unterschiede zwischen Jung- und Altsauen konnten bei der GPX, der ACL sowie dem Vitamin E gemessen werden. Jahreszeitlich bedingte Abhängigkeiten konnten nicht ermittelt werden. Folgende Richtwerte während Trächtigkeit und Laktation wurden erhoben: SOD: 730 – 1829 U/g Hb; GPX: 68 – 460 U/g Hb; TEAC:166 – 450 µmol/l; ACL: 2,58 – 15,33 µmol/l; Vitamin A: 0,20 – 0,53 µg/ml; Vitamin E: 1,85 – 4,42 µg/ml; Selen: 1,21 – 2,99 µmol/l. Schlussfolgerungen: Der antioxidative Status bei Schweinen unterliegt durch Trächtigkeit, Geburt und Laktation moderaten Veränderungen. Als zentral beeinflussendes Ereignis ist die Geburt zu nennen. Zum Teil wurden Altersdifferenzen nachgewiesen. Zwischen der Jahreszeit und den Parametern des antioxidativen Status konnte in dieser Studie bei gesunden Sauen kein Zusammenhang hergestellt werden. Die bereits existierenden Referenzbereiche für Selen, Vitamin A und E bestätigten sich in dieser Verlaufsuntersuchung.

Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, neben dem biographisch-persönlichen Werdegang von Johannes RICHTER auch die essentiellen Aspekte seiner fachlichen Arbeit auf dem Gebiet der Tierzucht und insbesondere der Tiergeburtshilfe zu beleuchten. Dies resultiert aus der Tatsache, dass bis zum heutigen Zeitpunkt noch keine genaue Betrachtung der Entwicklung des Fachgebietes in Dresden bzw. Leipzig vorliegt. Als Quellenbasis dienten für die Dissertation neben einer beachtlichen Anzahl an Archivalien - insbesondere aus dem Sächsischen Hauptstaatsarchiv in Dresden sowie dem Leipziger Universitätsarchiv - Berichte aus zeitgenössischer Literatur. Daneben konnte auch Material aus der Hand von RICHTERs Nachkommen verwendet werden. In einigen Bereichen musste die Verfasserin auf Sekundärliteratur zurückgreifen. Im ersten Abschnitt erfolgt die Darstellung des Lebenslaufes von Johannes RICHTER. Seiner Familie, privaten Interessen, seinem gesundheitlichen Zustand und auch RICHTERs politischer Einstellung wird dabei besondere Beachtung geschenkt. Der zweite Teil dieser Dissertation widmet sich den zahlreichen Arbeiten RICHTERs in seiner Funktion als Leiter der Ambulatorischen, ab 1911 auch der Geburtshilflichen Klinik in Dresden. Da diese Arbeiten Fortsetzung in der Errichtung des Institutes für Tierzucht und Geburtskunde finden, das 1923 nach Leipzig übernommen wurde, wird der Einrichtung hier besondere Beachtung geschenkt. Die Probleme des Institutes infolge der Wirtschaftskrise und später durch den Ausbruch des 2. Weltkrieges stellen - wie auch die Nachfolge RICHTERs nach 1943 - ebenfalls zentrale Themen des zweiten Abschnitts dar. Johannes RICHTER, der von 1906 bis 1912 Direktor der Ambulatorischen Tierklinik war, gab 1912 nach dem Tod des Tierzüchters PUSCH dieses Direktorat ab, erhielt die Professur für Tierzucht und stand damit bis zu seinem Tod 1943 dem Institut für Tierzucht und Geburtskunde vor. Während dieser Zeit gab es kaum ein Teilgebiet der Tiergeburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie bei Rindern, Pferden, Schweinen, Schafen und Kleintieren, auf dem er nicht tätig war. Seine wissenschaftlichen Veröffentlichungen umfassen die Geburtshilfe im engeren Sinne mit all ihren Zweigen: die Geburt, das Puerperium und deren Störungen, die Therapie von Genitalerkrankungen, Jungtiererkrankungen, Ursachen und Bekämpfung der Sterilität und schließlich tierzüchterische Fragen der Fortpflanzung und Besamung. Neben seiner unermüdlichen Arbeit an der Dresdener und später Leipziger Bildungsstätte in Lehre und Forschung war Johannes RICHTER Mitglied zahlreicher Verbände und Gesellschaften – darunter die Kaiserlich Deutsche Akademie der Naturforscher zu Halle. Anerkennung fand seine Tätigkeit auch in zahlreichen Ehrungen: So erhielt er im Dezember 1915 das Eiserne Kreuz II. Klasse sowie am 7. März 1916 in Lüttich das Ritterkreuz I. Klasse mit Schwertern des Sächsischen Albrechtsordens. 1918 wurden ihm Titel und Rang eines Medizinalrates verliehen. In der anschließenden Diskussion werden die essentiellen Aspekte nochmals umrissen und unter Hinzuziehung von eigenen Erkenntnissen vertieft. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf der Einstellung RICHTERs zum Nationalsozialismus, die im Zusammenhang zu seinem Suizid - einem weiteren Schwerpunkt - zu sehen ist. Die Autorin kommt hier zu dem Ergebnis, dass RICHTER lediglich eine deutschnationale Einstellung vertrat, sich aber nie politisch engagierte. RICHTER war kein Mitglied der NSDAP und bekannte sich auch nur dann öffentlich zum Nationalsozialismus, wenn er dazu verpflichtet war bzw. wenn ein Zuwiderhandeln mit persönlichen Nachteilen verbunden gewesen wäre. RICHTERs Bedeutung für die Weiterentwicklung der Tiergeburtshilfe wird ebenfalls reflektiert. Dabei galt es insbesondere zu klären, welchen Wert seine Fachliteratur heutzutage hat. Hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang RICHTERs „Lehrbuch der Tiergeburtshilfe“ als Neuauflage von „HARMS´ Lehrbuch der tierärztlichen Geburtshilfe“, das bis heute als Standardwerk gilt. Auf dem Gebiet der Veterinärmedizin hat Johannes RICHTER so bemerkenswerte Spuren für die Nachwelt hinterlassen.

Es gibt Fälle von Exitus letalis nach erfolgreich reponierter Dislocatio abomasi. Deren Ursache sowie prognostische Indikatoren zu ermitteln, war das Ziel vorliegender Arbeit. Zunächst wurden alle Rinder mit Exitus letalis zwischen 1990 und 2000 analysiert, die meisten litten an rechtsseitiger oder linksseitiger Disloactio abomasi. Bei diesen Tieren wurden die Befunde der Aufnahmeuntersuchung und der letzten Untersuchung vor dem Exitus letalis erfaßt, analysiert und mit den Befunden von nach linksseitiger oder rechtsseitiger Dislocatio abomasi geheilt entlassenen Tieren verglichen. Die Heilungsaussichten sinken bei rechtsseitiger und linksseitiger Dislocatio abomasi durch geringeren zeitlichen Abstand zur Kalbung, schlechteren Kreislaufzustand, geringere Pansenbewegungen, Hyperbilirubinämie und das Auftreten von Begleiterkrankungen. Bei rechtsseitiger Dislocatio abomasi waren weiterhin Hyponaträmie und Hypokalämie, bei linksseitiger Dislocatio abomasi erhöhte BHB-Konzentrationen, Hypocholsterolämie und Azidosen mit einer schlechten Prognose verbunden.

Der Sinn ungerichteter Reihenuntersuchungen, sogenannter Screening-untersuchungen, als Ergänzung zur präanästhetischen Untersuchung wird sowohl in Human- als auch Veterinärmedizin kontrovers diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es, den Nutzen von Blutuntersuchungen beim Hund im Sinne eines ungerichteten Screenings zu prüfen. Bei 1537 Hunden wurde im Routinebetrieb der Klinik vor jeder Narkose zunächst eine standardisierte Anamnese erhoben und eine standardisierte klinische Untersu-chung durchgeführt. Im Anschluss hieran wurden Blutproben für die Untersuchung verschiedener Parameter des Blutbildes und der Blutchemie entnommen. 1123 Pati-enten wurden präanästhetisch vom Anästhesisten als „benötigt keine Laboruntersu-chung“ eingestuft. Diese Patientengruppe hätte ein ungerichtetes präanästhetisches Laborscreening betroffen und wurde für die Auswertung der Blutuntersuchung herangezogen. Der Anteile der Werte, die außerhalb des jeweiligen Referenzbereichs lagen, schwankte je nach Parameter zwischen 2 und 85 Prozent. Insgesamt wurden für die einzelnen Parameter deutlich mehr Abweichungen festgestellt als in vergleichbaren humanmedizinischen Studien. Der Anteil geringgradiger Abweichungen war hierbei sehr hoch. Aufregungsbedingte Blutbildveränderungen, Vorbehandlungen, der verwendete Referenzbereich und bei sehr jungen Hunden altersbedingte Abweichungen kamen als mögliche Ursachen für diese Veränderungen in Betracht. In elf Prozent der Fälle ließen sich deutliche Abweichungen einzelner Laborparameter vom Referenzbereich feststellen, die retrospektiv zu einer Neueinschätzung des jeweiligen Narkoserisikos beim Patienten führten. Hieraus hätte sich für 6,5 % aller Patienten eine Änderung im perioperativen Management ergeben. In humanmedizinischen Studien liegt der Anteil der Patienten, bei denen ein Laborscreening eine Änderung des Narkosemanagements ergeben hätte bei unter einem Prozent. Verschiedene spezifisch veterinärmedizinische Gründe werden für diese Diskrepanz vermutet. Aufgrund der Besitzeranamnese statt Patientenanamnese und aufgrund verschiedener Störfaktoren für die klinische Untersuchung wie Aufregung oder mangelnde Kooperationsbereitschaft des Patienten kann von einem höheren Prozentsatz nicht erfasster Patienten mit höhe-rem Narkoserisiko ausgegangen werden. Bezüglich aller untersuchten Patienten konnte ein deutlicher Einfluss des Alters auf die Risikoeinschätzung des Anästhesisten festgestellt werden. Eine Untersuchung auf Korrelationen zwischen Laborwerten und dem Alter der Tiere zeigte im Falle von Thrombozytenzahl, ALAT, Natriumkonzentration und Gesamteiweißkonzentration eine positive Korrelation zum Alter, im Falle der Glukose eine negative Korrelation. Der Einfluss des Alters auf die Laborparameter ist aber in allen Fällen zu gering ausgeprägt um für die Beurteilung der Laborparameter hinsichtlich einer Narkoserelevanz entscheidend zu sein. Die Altersstruktur der „laborauffälligen“ Patienten weist im Vergleich zu den „laborunauffälligen“ Patienten keinen statistisch sicherbaren Unterschied auf. Der Einfluss verschiedener Rassen auf die Variabilität der Laborparameter wurde anhand der Korrelation von Körpermasse und Laborparametern näherungsweise untersucht. Nur für Kreatinin konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen Kör-permasse und Laborwert festgestellt werden, was wahrscheinlich auf die unter-schiedliche Bemuskelung kleiner und großer Hunde, bezogen auf das Körperge-wicht, zurückzuführen ist. Für die Laborwertinterpretation relevante rassebedingte Unterschiede konnten jedoch nicht ausgemacht werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie deutliche Unterschiede zu denen vergleichbarer Humanmedizinischer Studien. Es können mittels eines unge-richteten Laborscreenings deutlich mehr relevante Laborwertveränderungen festge-stellt werden, die auch zu einer Neueinschätzung der Risikosituation für den Patienten führen können. Ein Einfluss des Alters auf die Zahl der Laborwertveränderungen konnte im Rahmen dieser Studie nicht festgestellt bzw. statistisch gesichert werden. Insgesamt zeigt der Anteil relevanter Laborwertveränderungen, dass präanästhetische Blutuntersuchungen beim Hund eine sinnvolle Ergänzung zur präanästhetischen Untersuchung darstellen können.

Pregnancy toxaemia (ketosis) is a metabolic disease of ewes which occurs during the late gestation as a result of the inability of the pregnant ewe to maintain an adequate energy balance for the fast growing maternal fetal unit. As a result of energy defi-ciency mobilization of lipid reserves results in a doubling of the plasma free fatty acid (FFA) giving rise to fatty liver and increased ketone bodies β-hydroxybutyrate (BHB) in blood and urine. It is associated with a higher rate of mortality and causes severe economic losses. The objective of this study was directed at investigating the relationship between metabolic parameters and cytokine TNFα, to check the interaction between the TNFα and fat metabolism in late pregnant ewes of different breeds, and whether TNFα play a role in the pathogenesis of pregnancy toxaemia, which may serve as marker to early diagnosis of the disease. In this study, 29 pregnant and clinically healthy ewes (16 Merino, 13 Blackhead) were selected out of a flock of sheep. Blood samples were collected at 5, 3, and 1 week be-fore parturition (b.p.) and also 4 weeks after parturition (a.p.). The average numbers of lambs were 2.18 and 1.58 /ewe for Merino and Blackhead breeds respectively. The blood samples were analyzed for the following:  Concentration of metabolic parameters: glucose, insulin, free fatty acids (FFA), β-hydroxybutyrate (BHB), albumin, total protein (TP), iron (Fe), glutamat-dehydro-genase (GLDH), creatin kinase (CK), gamma-glutamyl-transferase (GGT), choles-terol, haptoglobin.  Haematological parameters: Haematocrite (HK), haemoglobin concentration (HB), erythrocyte count (EC), leukocyte count (LC), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC).  Cytokine TNFα by using ovine TNFα ELISA assay. The results of glucose concentration of pregnant ewes showed significant increase (3.8 mmol/l) in five weeks b.p. and declined with advancing gestation (2.6 mmol/l) one week b.p. Insulin concentration remained constant with an average of 0.11 nmol/l b.p., and then significantly increased to 0.22 nmol/l four weeks a.p. Maximal FFA concentrations were found at five weeks b.p. (976 µmol/l). The levels of FFA showed high levels b.p. compared with reference range (R.R. < 600 µmol/l), and the FFA levels significantly decreased postpartum (four weeks b.p.). while there was significant increasing (p<0.05) in the level of FFA in Merino sheep than in Black-head sheep b.p. On the other hand there was no significant difference a.p. The mean values of BHB in all periods of sampling, period 1(5 w.b.p.), period 2 (3 w.b.p.), period 3 (1 w.b.p.), and period 4 (4 w.a.p.) were 0.37 mmol/l, 0.23 mmol/l, 0.17 mmol/l and 0.3 mmol/l respectively. The mean of BHB indicated normal levels of BHB before and after parturition compared to subclinical ketosis (BHB > 1 mmol/l) and clinical ketoses (BHB > 1.6 mmol/l), and there was a significant difference (p<0.05) in the values of BHB between Blackhead and Merino breeds before parturi-tion while there was no significant difference after parturition. The concentration of TNFα showed elevated levels in all period of sampling before parturition. The TNFα values were 30.4 (17.2, 785.0) ng/ml (median, first, and third quartiles), 35.6 (13.6, 54.3), and 26.6 (13.0, 39.9) ng/ml in period 1(5 w.b.p.), period 2 (3 w.b.p.), and period 3 (1 w.b.p.) respectively. These values decreased to 19.1 (9.9, 33.8) ng/ml at 4 weeks after parturition. Statistical analysis showed that there was a positive correlation between free fatty ac-ids and TNFα. This correlation means that adipose tissue produces TNFα causing insu-lin resistance, which stimulates the lipolysis and leads to an increase of circulatory free fatty acids levels. It is concluded that fat mobilization occurs in the prepartum clinically healthy ewes with a significant increase in the levels of FFA, and also there is an increase in the proinflammatory cytokine TNFα at late gestation which predisposes ewes to pregnancy toxaemia and can aid in the diagnosis of the disease.:Table of contents 1 Introduction…………….…………………………………………………..1 2 Review of literature……....…………….……………………………….….3 2.1 Metabolic condition of ewes in the late pregnancy………….………………3 2.2 Metabolic disorders subacute and acute pregnancy Toxaemia…….………..4 2.3 The Importance and dynamic of the different biochemical parameters glucose, insulin, free fatty acids, and β-hydroxybutyrate of ewes in the late pregnancy…………………….………..….……………………………10 2.3.1 Glucose……………………………………………………………………..10 2.3.2 Insulin………………………………………………………………………12 2.3.3 β-hydroxybutyrate (BHB)…….……………………………………………16 2.3.4 Free fatty acids……………………………………………………………...20 2.4 TNFα and its role in fat metabolism and pregnancy toxaemia………….….22 3 Animals, material and methods……………………………………..……38 3.1 Animals……………………………………………………………………..38 3.2 Clinical examination………………………………………………………..38 3.3 Collection of blood samples……………………………………………..…38 3.4 Analysis of haematological parameters in blood samples……………….....38 3.5 Determination of biochemical parameters………………………………….39 3.6 Determination of haptoglobin by using haptoglobin assay……………...…39 3.6.1 Haptoglobin assay principle………………………………………………..39 3.6.2 Components………………………………………………………………...40 3.6.3 Additional materials required………………………………………………40 3.6.4 Sample and reagent preparation………………………………….….……..40 3.6.4.1 Samples……………………………………………………………………..40 3.6.4.2 Haemoglobin.................................................................................................40 3.6.4.3 Chromogen/Substrate………………………………………………………40 3.6.5 Manual methods (microplate or spectrophotometric)……………………...41 3.6.5.1 Calibrator…………………………………………………………………...41 3.6.5.2 Test temperature…………………………………………………………....41 3.6.5.3 Procedure………………..………………………………………………….41 3.7 Analysis of TNFα by using ovine TNFα ELISA assay…………………….42 3.8 Statistical analysis…………………………………………………….…….43 4 Results.……………………………………………………………………..44 4.1 Clinical examination (observation)…………………………………….…...44 4.2 Biochemical parameters………………………………………………….…44 4.2.1 Glucose………………………………………………………………….…..44 4.2.1.1 Glucose concentrations in all sheep…………………………..…………….44 4.2.1.2 Glucose concentrations in Blackhead sheep…………………………..…....44 4.2.1.3 Glucose concentrations in Merino sheep………………………...…………45 4.2.2 Insulin……………………………………………………………………….45 4.2.2.1 Insulin concentrations in all sheep………………………………..………...45 4.2.2.2 Insulin concentrations in Blackhead sheep………………………..………..46 4.2.2.3 Insulin concentrations in Merino Sheep…………………………………….46 4.2.3 Free fatty acids……………………………………………………………...47 4.2.3.1 Free fatty acid concentrations in all sheep………………………………….47 4.2.3.2 Free fatty acid concentrations in Blackhead sheep………………………....47 4.2.3.3 Free fatty acid concentrations in Merino sheep………………………….....47 4.2.4 β-hydroxybutyrate (BHB)…….…………………………………………….48 4.2.4.1 β-hydroxybutyrate concentrations in all sheep……..……………………....48 4.2.4.2 β-hydroxybutyrate concentrations in Blackhead sheep……… …………....48 4.2.4.3 β-hydroxybutyrate concentrations in Merino sheep…………………...…...49 4.2.5 Tumor necrosis factor alpha (TNFα)………………….……………….…...50 4.2.5.1 TNFα concentrations in all sheep…………..................................................50 4.2.5.2 TNFα concentrations in Blackhead sheep……………………………….....50 4.2.5.3 TNFα concentrations in Merino sheep………………………………….......51 4.2.6 Haptoglobin………………………………………………………………....51 4.2.6.1 Haptoglobin concentrations in all sheep……………………………..…......51 4.2.6.2 Haptoglobin concentrations in Blackhead and Merino sheep…….………..51 4.2.7 Albumin…………………………………………………………………….52 4.2.7.1 Albumin concentrations in all sheep…………………………..…………...52 4.2.7.2 Albumin concentrations in Blackhead and Merino sheep……………….....53 4.2.8 Creatinkinase (CK)…………………………………………………………53 4.2.8.1 Creatinkinase activity in all sheep………………………………………….53 4.2.8.2 Creatinkinase activity in Blackhead and Merino sheep…………………….53 4.2.9 Gamma-Glutamyl Transferase (GGT)………………………….…………..54 4.2.9.1 GGT activity in all sheep…………………………………………………...54 4.2.9.2 GGT activity in Blackhead and Merino sheep……………………………..55 4.2.10 Glutamat-Dehydrogenase (GLDH)………………………………………...56 4.2.10.1 GLDH activity in all sheep…………………………………………………56 4.2.10.2 GLDH activity in Blackhead and Merino sheep………….…………….......56 4.2.11 Total protein………………………………………………………………..57 4.2.11.1 Total protein concentrations in all sheep………………………………...…57 4.2.11.2 Total protein concentrations in Blackhead and Merino sheep……………..57 4.2.12 Cholesterol……………………………………………………………….…58 4.2.12.1 Cholesterol concentrations in all sheep………………………………...…...58 4.2.12.2 Cholesterol concentrations in Blackhead and Merino sheep…………....….58 4.2.13 Iron………………………………………………………………………….59 4.2.13.1 Iron concentrations in all sheep…………………………...………………..59 4.2.13.2 Iron concentrations in Blackhead and Merino sheep………………….........60 4.3 Haematological parameters………………………………………………...60 4.3.1 Haematological parameters in all sheep……………………………………60 4.3.2 Haematological parameters in Blackhead sheep…………………………...61 4.3.3 Haematological parameters in Merino sheep………………………………61 4.3.4 Statistical analysis of haematological parameters………………………….62 4.3.4.1 Haemoglobin concentration (Hb)…………………………………………..62 4.3.4.2 Haematocrite (HK)…………………………………………………………62 4.3.4.3 Mean corpuscular volume (MCV) …………………………………………62 4.3.4.4 Mean corpuscular haemoglobin (MCH)……………………………………62 4.3.4.5 Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC)……………………63 4.3.4.6 Thrombocytes volume (THB)……………………..…………………….…63 4.3.4.7 Leukocytes (LC)………..…………………………………………………..63 4.3.4.8 Erythrocytes.……………………………………………………………….63 5 Discussion…………………………………………………………………..65 6 Summary…………………………………………………………………..71 7 Zusammenfassung………………………………………………………...73 8 References…………………………………………………………………75 Acknowledgements.......................................................................................................84