Se han desarrollado inmunosensores en flujo para el análisis de residuos de productos fitosanitarios capaces de trabajar con altas concentraciones de medios orgánicos. Este hecho ha permitido la determinación de residuos de plaguicidas (carbaril, 1-nartol e Irgarol) en muestras de agua y vegetales siguiendo los protocolos de extracción dados por los métodos oficiales de análisis. Por otro lado, se ha puesto a punto un método de extracción rápido alternativo a los multirresiduo permitiendo reducir tanto el consumo de disolventes orgánicos como el tiempo de análisis. Se han aportado datos acerca del efecto de los medios orgánicos en las interacciones inmunoquímicas. Según los estudios realizados, se ha demostrado que en estos medios la sensibilidad es inferior a la obtenida mediante las técnicas habituales de inmunoensayo en medio acuoso, sin embargo la selecctividad de estos sistemas es superior a los ensayos en medio acuoso. Por otro lado, se ha comprobado el efecto del marcaje y/o técnica de detección en las prestaciones de los sistemas desarrollados. Así, técnicas más sensibles (fluorescencia con resolución temporal y quimioluminiscencia) que la habitualmente utilizada (fluorescencia), han permitido, mejorar apreciablemente la sensibilidad de los ensayos y utilizar medios con un mayor porcentaje de disolventes orgánicos. Finalmente, se resolvieron una serie de cuestiones prácticas en el desarrollo de este tipo de inmunosensores tales como estabilidad de reactivos, tiempos de incubación, etc. Se ha observado que los soportes de naturaleza silícea presentaron mejores prestaciones que los soportes tipo gel. El formato de ensayo denominado de captura de inmunocomplejo produjo los mejores resultados. Respecto al tipo de anticuerpo -en los estudios efectuados en el presente trabajo experimental- los anticuerpos policlonales mostraron mejores prestaciones que los monoclonales. / Penalva Villegas, J. (2000). Inmunoensayos en medios orgánicos para el análisis en linea de plaguicidas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4283

Tesis por compendio / [ES] Esta tesis doctoral se enmarca en uno de los retos demandados por la sociedad relativo a la seguridad y calidad alimentaria, establecido en los actuales planes estatales y europeos de investigación científica, técnica y de innovación. En particular, la investigación realizada en esta tesis doctoral, contribuye a la validación de una técnica de análisis novedosa para la detección de pesticidas y antibióticos de interés en la miel. Esta técnica está basada en el uso combinado de la tecnología de sensores acústicos de alta resolución (High Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance - HFF-QCM) funcionalizados con anticuerpos monoclonales, como elemento de reconocimiento biológico, para la detección de dos pesticidas (carbaril y DDT) y un antibiótico (sulfatiazol), en la matriz alimentaria miel. La metodología desarrollada se presenta como una técnica de análisis, alternativa y/o complementaria a las ya existentes, que resuelve algunos inconvenientes de las mismas; con la ventaja de requerir bajo consumo de muestra, ser fiable, simple, de bajo coste y de fácil manejo, por lo que no necesita de personal altamente cualificado. Además, es una técnica rápida que proporciona los resultados en pocos minutos, y está basada en instrumentación portátil, lo que facilita su implantación en la línea de trabajo. Los límites de detección alcanzados en miel por los inmunosensores HFF-QCM para carbaril, DDT y sulfatiazol fueron: 7, 24 y 0.10 µg/kg, respectivamente. Por su parte, los límites de cuantificación para los mismos analitos fueron: 17, 52 y 2 µg/kg, respectivamente. Los valores obtenidos con esta nueva tecnología son del mismo orden de magnitud que las técnicas de referencia actuales (cromatografía, SPR y ELISA), y confirman que cumple con los LMRs establecidos en el marco normativo actual. Respecto a la validación de esta nueva tecnología, el inmunosensor HFF-QCM desarrollado para la detección de sulfatiazol cumplió los requisitos de precisión y exactitud establecidos por la guía SANCO 12571/2013 para concentraciones de sulfatiazol en miel iguales o superiores a 10 ¿g/kg. Los inmunosensores HFF-QCM desarrollados para la detección de carbaril y DDT se aproximaron a los criterios de validación recomendados por la guía SANCO 12571/2013. Los resultados obtenidos con la técnica propuesta para el análisis de mieles reales han sido corroborados mediante cromatografía. En este sentido, ninguna de las muestras de miel reales analizadas mediante cromatografía y HFF-QCM reveló la presencia de pesticidas o de antibióticos en la miel, lo que confirma la fiabilidad de la técnica para la detección de estos contaminantes. Los hallazgos obtenidos en esta tesis son prometedores y establecen un punto de partida para futuros desarrollos encaminados a lograr la detección simultánea de varios analitos en un único análisis y muestra. Esto podría lograrse con un array de sensores HFF-QCM. En definitiva, la investigación realizada pone de manifiesto que los inmunosensores basados en la tecnología HFF-QCM son una alternativa seria a las técnicas actuales, para la cuantificación in situ de pesticidas y antibióticos en la industria de envasado de la miel. / [CA] Aquesta tesi doctoral s'emmarca en un dels reptes demandats per la societat relatiu a la seguretat i qualitat alimentària, establit en els actuals plans estatals i europeus d'investigació científica, tècnica i d'innovació. En particular, la investigació realitzada en aquesta tesi doctoral, contribuïx a la validació d'una tècnica d'anàlisi nova per a la detecció de pesticides i antibiòtics d'interés en la mel. Esta tècnica està basada en l'ús combinat de la tecnologia de sensors acústics d'alta resolució (High Fudamental Frequency Quartz Crystal Microbalance - HFF-QCM) functionalitzats amb anticossos monoclonals, com a element de reconeixement biològic, per a la detecció de dos pesticides (carbaril i DDT) i un antibiòtic (sulfatiazol), en la matriu alimentària mel. La metodologia desenvolupada es presenta com una tècnica d'anàlisi, alternativa y/o complementària a les ja existents, que resol alguns inconvenients de les mateixes; amb l'avantatge de requerir baix consum de mostra, ser fiable, simple, de baix cost i de fàcil maneig, per la qual cosa no necessita de personal altament qualificat. A més, és una tècnica ràpida que proporciona els resultats en pocs minuts, i està basada en instrumentació portàtil, la qual cosa facilita la seua implantació en la línia de treball Els límits de detecció aconseguits en mel pels inmunosensors HFF-QCM per a carbaril, DDT i sulfatiazol van ser: 7, 24 i 0.10 µg/kg, respectivament. Per la seua banda, els límits de quantificació per als mateixos analits van ser: 17, 52 i 2 µg/kg, respectivament. Els valors obtinguts amb aquesta nova tecnologia són del mateix orde de magnitud que les tècniques de referència actuals (cromatografia, SPR i ELISA), i confirmen que complix amb els LMRs establits en el marc normatiu actual. Respecte a la validació d'esta nova tecnologia, l'inmunosensor HFF-QCM desenvolupat per a la detecció de sulfatiazol va complir els requisits de precisió i exactitud establits per la guia SANCO 12571/2013 per a concentracions de sulfatiazol en mel iguals o superiors a 10 µg/kg. Els inmunosensors HFF-QCM desenvolupats per a la detecció de carbaril i DDT es van aproximar als criteris de validació recomanats per la guia SANCO 12571/2013. Els resultats obtinguts amb la tècnica proposta per a l'anàlisi de mels reals han sigut corroborats per mitjà de cromatografia. En aquest sentit, cap de les mostres de mel reals analitzades per mitjà de cromatografia i HFF-QCM va revelar la presència de pesticides o d'antibiòtics en la mel, la qual cosa confirma la fiabilitat de la tècnica per a la detecció d'estos contaminants. Les troballes obtinguts en aquesta tesi són prometedors i estableixen un punt de partida per a futurs desenvolupaments encaminats a aconseguir la detecció simultània de diversos analits en un únic anàlisi i mostra. Açò podria aconseguir-se amb una matriu de sensors HFF-QCM. En definitiva, la investigació realitzada posa de manifest que els inmunosensors basats en la tecnologia HFF-QCM són una alternativa seriosa a les tècniques actuals, per a la quantificació in situ de pesticides i antibiòtics en la indústria d'envasament de la mel. / [EN] This thesis is part of one of the challenges demanded by society regarding food safety and quality, established in the current state and European plans for scientific, technical and innovation research. In particular, the research carried out in this doctoral thesis contributes to the validation of a novel analysis technique for the detection of pesticides and antibiotics of interest in honey. This technique is based on the combined use of high resolution acoustic sensor technology (High Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance - HFF-QCM) functionalized with monoclonal antibodies, as a biological recognition element, for the detection of two pesticides (carbaryl and DDT ) and an antibiotic (sulfathiazole), in the honey food matrix. The developed methodology is presented as an analysis technique, alternative and / or complementary to those that already exist, which solves some of their drawbacks; with the advantage of requiring low sample consumption, being reliable, simple, low cost and easy to use, so it does not require highly qualified personnel. In addition, it is a fast technique that provides results in a few minutes, and is based on portable instrumentation, which facilitates its implementation in the industry. The detection limits reached in honey by the HFF-QCM immunosensors for carbaryl, DDT and sulfatiazole were: 7, 24 and 0.10 µg / kg, respectively. On the other hand, the quantification limits for the same analytes were: 17, 52 and 2 µg / kg, respectively. The values obtained with this new technology are of the same order of magnitude as the current reference techniques (chromatography, SPR and ELISA), and confirm that it meets the MRLs established in the current regulatory framework. Regarding the validation of this new technology, the HFF-QCM immunosensor developed for the detection of sulfathiazole meet the precision and accuracy requirements established by the SANCO 12571/2013 guideline for concentrations of sulfathiazole in honey equal to or greater than 10 ¿g / kg. The HFF-QCM immunosensors developed for the detection of carbaryl and DDT approached the validation criteria recommended by the SANCO guide 12571/2013. The results obtained with the proposed technique for the analysis of real honeys have been verified by chromatography. In this sense, none of the real honey samples analyzed by chromatography and HFF-QCM revealed the presence of pesticides or antibiotics in honey, confirming the reliability of this technique for the detection of these contaminants. The findings obtained in this thesis are promising and establish a starting point for future developments aimed at achieving the simultaneous detection of several analytes in a single analysis and sample. This could be accomplished with an array of HFF-QCM sensors. Ultimately, the research carried out shows that immunosensors based on HFF-QCM technology are a serious alternative to current techniques for in situ quantification of pesticides and antibiotics in honey packaging industry. / Así mismo quiero agradecer a la Generalitat Valenciana y al Fondo Social Europeo por haberme proporcionado la financiación económica mediante el contrato “Ayudas para la contratación de personal investigador en formación de carácter predoctoral” (ACIF/2016/132), ya que sin este contrato la realización de esta tesis no habría sido posible. Además, quiero agradecer de nuevo a la Generalitat Valenciana y al Fondo Social Europeo por el apoyo financiero para llevar a cabo una estancia predoctoral en el Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de León (ICTAL), España (BEFPI/2018/021). Y no menos importante es el agradecimiento al Ministerio Español de Economía y Competitividad, que mediante Fondos FEDER ha financiado esta investigación a través del proyecto titulado: “Diseño de una plataforma basada en matrices de sensores de cuarzo de alta resolución para HTS (High-Throughput Screening) de residuos en mieles” (PQHTS-HONEY, AGL 2013-48646-R). / Cervera Chiner, L. (2020). Aplicación y validación de la tecnología de inmunosensores piezoeléctricos de alta frecuencia (HFF-QCM) para la detección de pesticidas y antibióticos en miel [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/152488 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] La sociedad actual demanda un mayor control en la seguridad y calidad de los alimentos que se consumen. Esta preocupación se ve reflejada en los diferentes planes estatales y europeos de investigación científica, los cuales, plantean la necesidad de innovar y desarrollar nuevas técnicas analíticas que cubran los requerimientos actuales. En el presente documento se aborda el problema de la presencia de residuos químicos en la miel. El origen de los mismos se debe, fundamentalmente, a los tramientos veterinarios con los que se tratan enfermedades y parásitos en las abejas, y a los tratamientos agrícolas con los que las abejas se ponen en contacto cuando recolectan el néctar en cultivos próximos a las colmenas. La Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) confirma esta realidad al notificar numerosas alertas sanitarias en la miel. En los últimos años, los métodos de análisis basados en inmunosensores piezoeléctricos se han posicionado como la base de una técnica de cribado muy prometedora, la cual puede ser empleada como técnica complementaria a las clásicas de cromatografía, gracias a su sencillez, rapidez y bajo coste. La tecnología de resonadores High-Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (HFF-QCMD) combina la detección directa en tiempo real, alta sensibilidad y selectividad con un fácil manejo y coste reducido en comparación con otras técnicas. Además, está tecnología permite aumentar el rendimiento del análisis mediante el diseño de arrays de resonadores en un mismo sustrato (Monolithic HFF-QCMD). En este documento se presenta el diseño de un array de 24 sensores HFF-QCMD, junto con un cartucho de micro-fluídica que traza diversos microcanales sobre los diferentes elementos sensores, a los que hace llegar la muestra de miel diluida a analizar. El cartucho actúa también como interfaz para realizar la conexión entre el array de resonadores y el instrumento de caracterización de los mismos. Para obtener el máximo partido del array diseñado, se desarrolla un método de medida robusto y fiable que permite elevar la tasa de adquisición de datos para facilitar la toma de registros eléctricos de un elevado número de resonadores de forma simultánea, e incluso en varios armónicos del modo fundamental de resonancia. La gran sensibilidad de la tecnología HFF-QCMD a los eventos bioquímicos a caracterizar se extiende también a otro tipo eventos externos, como son los cambios de temperatura o presión, lo que es necesario minimizar con el fin de reducir el impacto que estas perturbaciones no deseadas provocan en la estabilidad y fiabilidad de la medida. Con este fin, se desarrolla un algoritmo de procesado de señal basado en la Discrete Transform Wavelet (DTW). Finalmente, todos los desarrollos tecnológicos realizados se validan mediante la implementación de un inmunoensayo para la detección simultánea, en muestras de mieles reales, de residuos químicos de naturaleza química muy diferente, a saber, el fungicida tiabendazol y el antibiótico sulfatiazol. / [CA] La societat actual demanda un major control en la seguretat i qualitat dels aliments que es consumeixen. Aquesta preocupació es veu reflectida en els diferents plans estatals i europeus d'investigació científica, els quals, plantegen la necessitat d'innovar i desenvolupar noves tècniques analítiques que cobrisquen els requeriments actuals. En el present document s'aborda el problema de la presència de residus químics en la mel. L'origen dels mateixos es deu, fonamentalment, als tractaments veterinaris amb els quals es tracten malalties i paràsits en les abelles, i als tractaments agrícoles amb els quals les abelles es posen en contacte quan recol·lecten el nèctar en cultius pròxims als ruscos. L'Agència Europea de Seguretat Alimentària (EFSA) confirma aquesta realitat notificant nombroses alertes sanitàries en la mel. En els últims anys, els mètodes d'anàlisis basades en immunosensors piezoelèctrics s'han posicionat com la base d'una tècnica de garbellat molt prometedora, la qual pot ser emprada com a tècnica complementària a les clàssiques de cromatografia, gràcies a la seua senzillesa, rapidesa i baix cost. La tecnologia de ressonadors High-Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (HFF-QCMD) combina la detecció directa en temps real, alta sensibilitat i selectivitat amb un fàcil maneig i cost reduït en comparació amb altres tècniques. A més, està tecnologia permet augmentar el rendiment del anàlisi mitjançant el disseny d'arrays de ressonadors en un mateix substrat (Monolithic HFF-QCMD). En aquest document es presenta el disseny d'un array de 24 sensors HFF-QCMD, juntament amb un cartutx de microfluídica que estableix diversos microcanals sobre els diferents elements sensors, als quals fa arribar la mostra de mel diluïda a analitzar. El cartutx actua també com a interfície per a realitzar la connexió entre l'array de ressonadors i l'instrument de caracterització d'aquests. Per a traure el màxim partit a l'array dissenyat, es desenvolupa un mètode de mesura robust i fiable que permet elevar la taxa d'adquisició de dades per a facilitar la presa de registres elèctrics d'un elevat nombre de ressonadors de manera simultània, i fins i tot en diversos harmònics del mode fonamental de ressonància. La gran sensibilitat de la tecnologia HFF-QCMD als esdeveniments bioquímics a caracteritzar s'estén també a un altre tipus esdeveniments externs, com són els canvis de temperatura o pressió, la qual cosa és necessari minimitzar amb la finalitat de reduir l'impacte que aquestes pertorbacions no desitjades provoquen en l'estabilitat i fiabilitat de la mesura. A aquest efecte, es desenvolupa un algorisme de processament de senyal basat en la Discrete Transform Wavelet (DTW). Finalment, tots els desenvolupaments tecnològics realitzats es validen mitjançant la implementació d'un immunoassaig per a la detecció simultània, en mostres de mel reals, de residus químics de naturalesa química molt diferent, a saber, el fungicida tiabendazol i l'antibiòtic sulfatiazol. / [EN] Currently, society demands greater control over the safety and quality of the food consumed. This concern is reflected in the different states and European plans for scientific research, which establish the necessity to innovate and develop new analytical techniques that meet current requirements. This document addresses the problem of the presence of chemical residues in honey. Its origin is fundamentally due to the veterinary treatments against diseases and parasites in bees, and also to the agricultural treatments with which the bees come into contact when they collect the nectar in crops close to the hives. The European Food Safety Agency (EFSA) confirms this reality by notifying numerous health alerts in honey. In recent years, analysis methods based on piezoelectric immunosensors have been positioned as the basis of a very promising screening technique, which can be used as a complementary technique to the classic chromatography, thanks to its simplicity, speed and low cost. High-Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (HFF-QCMD) resonator technology combines direct real-time detection, high sensitivity and selectivity with easy handling and low cost compared to other techniques. In addition, this technology allows increasing the performance of the analysis through the design of resonator arrays on the same substrate (Monolithic HFF-QCMD). This document presents the design of an array of 24 HFF-QCMD sensors, together with a microfluidic cartridge that establish various microchannels on the different sensor elements, to provide them the diluted honey sample to be analyzed. The cartridge also acts as an interface to make the connection between the array of resonators and the characterization instrument. To get the most out of the designed array, a robust and reliable measurement method has been developed that allows increasing the data acquisition rate to facilitate electrical parameters readout from a high number of resonators simultaneously, and even in several harmonics of the fundamental resonance mode. The great sensitivity of the HFF-QCMD technology to the biochemical events to be characterized also is extended to other types of external events, such as changes in temperature or pressure, which must be minimized in order to reduce the impact that these unwanted disturbances cause in the stability and reliability of the measurement. To this end, a signal processing algorithm based on the Discrete Transform Wavelet (DTW) is developed. Finally, all the technological developments carried out are validated through the implementation of an immunoassay for the simultaneous detection, in real honey samples, of chemical residues of very different chemical nature, namely, the fungicide thiabendazole and the antibiotic sulfathiazole. / The authors would also like to thank Jorge Martínez from the Laboratory of High Frequency Circuits (LCAF) of the Universitat Politècnica de València (UPV) for assistance with profilometry, and Manuel Planes, José Luis Moya, Mercedes Tabernero, Alicia Nuez and Joaquin Fayos from the Electron Microscopy Services of the UPV for helping with the AFM, and SEM measurements. M.Calero is the recipient of the doctoral fellowship BES-2017-080246 from the Spanish Ministry of Economy, Industry and Competitiveness (Madrid, Spain). This research was funded by Spanish Ministry of Economy and Competitiveness with FEDER funds (AGL 2016-77702-R) and European Commission Horizon 2020 Programme (Grant Agreement number H2020-FETOPEN-2016-2017/737212-CATCH-U-DNA - Capturing non-Amplified Tumor Circulating DNA with Ultrasound Hydrodynamics) for which the authors are grateful. Román Fernández is with the Center for Research and Innovation in Bioengineering (Ci2B), Universitat Politècnica de València, València, Spain and with Advanced Wave Sensors S.L., Paterna, València, Spain. (e-mail: rfernandez@awsensors.com); Yolanda Jiménez, Antonio Arnau and María Calero are with the Center for Research and Innovation in Bioengineering (Ci2B), Universitat Politècnica de València, València, Spain; Ilya Reiviakine is with Advanced Wave Sensors S.L., Paterna, Valencia, Spain and with the Department of Bioengineering, University of Washington, Seattle, WA, 98150 USA; María Isabel Rocha-Gaso and José Vicente García are with Advanced Wave Sensors S.L., Paterna, València, Spain. / Calero Alcarria, MDS. (2022). Development of a novel high resolution and high throughput biosensing technology based on a Monolithic High Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance (MHFF-QCM). Validation in food control [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182652 / Compendio